TRIM59基因沉默對結直腸癌細胞增殖和細胞周期的影響

高曉斌，武雪亮，王勝杰，孫光源，王文靜，梁 峰，趙軼峰，劉振顯

近年來，我國結直腸癌發病率及患病率呈逐年上升趨勢[1-2]，盡管近年來結直腸癌的診斷和治療技術已經取得了較大進展，但由于在早期篩查、早期診斷上的諸多困難，部分患者失去了最佳治療時期，五年生存率并未有明顯提高[3]。因此，探究結直腸癌的發生發展機制非常迫切。三結構域蛋白59(tripartite motif-containing 59,TRIM59)是一個新型的三結構域蛋白家族(tripartite motif, trim)家族成員，其主要通過介導蛋白與蛋白間的互相作用，調控蛋白穩定性，進而促進腫瘤細胞的無序化增殖，促進腫瘤發生[4]。現階段TRIM59已被證實在肝癌[5]、非小細胞肺癌[6]等腫瘤中高表達，而TRIM59在結直腸癌中的研究鮮有報道，該研究探討沉默TRIM59對結直腸癌細胞HCT116增殖和細胞周期的影響，旨在為結直腸癌的診斷、分子治療提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 主要試劑RPMI-1640培養基、胰蛋白酶和胎牛血清購于美國Hyclone公司；細胞計數試劑盒(cell counting kit-8, CCK-8)、電化學發光試劑盒以及細胞周期試劑盒購自上海碧云天生物有限公司；磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution, PBS)、二甲基亞砜(dimethylsulfoxide, DMSO)細胞凍存液、蛋白質裂解緩沖液(RIPA)均購于北京索萊寶生物有限公司；RNA提取試劑盒購于北京天根生化科技有限公司；SDS-PAGE凝膠制備試劑盒購于武漢博士德生物工程有限公司；靶向TRIM59的干擾質粒RNA(si-TRIM59)和陰性對照質粒(si-NC)購自上海吉瑪基因科技有限公司；兔抗人TRIM59單克隆抗體、CDK4、cyclinD1抗體以及辣根過氧化物酶標記的二抗購于美國Abcam生物公司；引物由武漢擎科創新生物科技有限公司合成。

1.2 細胞培養結直腸癌細胞HCT116、SW620、SW480及人正常結直腸黏膜細胞FHC均購于中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫，用含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養基培養，置于37 ℃、5% CO2的恒溫培養箱中培養，每隔1 d更換新鮮培養液。次日倒置熒光顯微鏡下觀察細胞生長狀況，待細胞鋪滿培養瓶，細胞可進行細胞傳代。細胞傳代步驟：吸凈舊的培養基，0.25%胰蛋白酶消化細胞，收集細胞懸液與離心管中，置于離心機中以1 000 r/min離心8 min；重新混懸細胞，并將懸液于新的培養瓶內繼續培養。

1.3 細胞分組及細胞轉染選擇處于對數生長期的HCT116細胞用于后續實驗，設置TRIM59干擾組(si-TRIM59組)和陰性對照組(si-NC組)。將1×105/孔細胞量接種6孔板，培養12～24 h后，待細胞融合密度達到60%～70%時開始進行細胞轉染，根據轉染操作說明書，每孔轉染50 nmol/L si-TRIM59或si-NC。轉染完成后采用實時熒光定量聚合酶鏈式反應(real time quantity polymerase chain reaction, RT-qPCR)和Western blot驗證質粒轉染效果。

1.4 RT-qPCR實驗根據TRIzol操作說明書提取HCT116細胞總RNA。使用RNA提取試劑盒提取HCT116細胞中的總RNA；利用隨機引物反轉錄成cDNA。根據熒光定量試劑盒操作說明書進行PCR定量反應。引物序列分別為：TRIM59正義鏈為5′-GGACATGCTGTGTCACATCCT-3′，反義鏈為5′- CTCCTGTTGGTCTCATTTGGT-3′；GAPDH正義鏈為5′- GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′，反義鏈為5′- GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG -3′。PCR反應條件如下： PCR預變性5 min，95 ℃變性30 s，然后60 ℃退火30 s，65 ℃延長60 s，共35個循環。以GAPDH作為內參，用2-ΔΔCt方法計算目的基因TRIM59mRNA的相對表達量，重復3次實驗。

1.5 Western blot實驗收集轉染后的HCT116細胞并用細胞裂解液裂解細胞，提取總蛋白并采用BCA法測定蛋白濃度。上樣后在SDS-PAGE凝膠電泳1.5 h，將分離的蛋白轉移到PVDF膜上，10%脫脂牛奶封閉1 h，分別加入TRIM59抗體(1 ∶6 000)、cyclinD1抗體(1 ∶8 000)、CDK1抗體(1 ∶4 000)、STAT3抗體(1 ∶4 000)、p-STAT3抗體(1 ∶2 000)、JAK2抗體(1 ∶4 000)、p- JAK2抗體(1 ∶2 000)，在4 ℃下過夜。TBST漂洗，加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗在孵育1 h，取出PVDF膜后再TBST漂洗，用電化學發光試劑盒顯影，計算目標條帶的相對表達量。

1.6 CCK-8法檢測細胞增殖能力吸取100 μl密度為2×104個/ml細胞懸液接種于96孔板上，待細胞貼壁生長后加入CCK-8試劑，使用酶聯免疫檢測儀分別在0、24、48、72 h時450 nm波長處吸光度(A)值，實驗重復3次，并繪制細胞生長曲線。

1.7 克隆形成試驗收集轉染si-TRIM59和si-NC轉染后的HCT116細胞，胰酶消化制備單細胞懸液，以500個細胞數目/孔接種于6孔板中，并在完全培養基中培養2～3周。每4 d更換1次新鮮培養基。待細胞克隆形成后，采用4%多聚甲醛固定細胞，1%結晶紫染色10 min，PBS洗滌細胞3～5次，獲取圖像，計算細胞克隆形成數量。

1.8 流式細胞術檢測細胞周期細胞量按照5×105/孔接種在培養板中；待細胞融合密度達到60%～70%時轉染細胞，胰酶消化收集細胞；以1 000 r/min離心5 min，取沉淀細胞，PBS洗滌細胞2次；經預冷的70%乙醇固定并低溫下孵育3 h，離心棄固定液，調整細胞濃度為1×106/ml，加入50 μg/ml碘化丙啶(PI)染液室溫下避光反應30 min進行DNA染色，最后流式細胞儀檢測細胞周期分布情況，實驗重復3次。

2 結果

2.1 TCGA數據庫分析TRIM59在結直腸癌組織中的表達及其與患者預后的相關性采用TCGA數據庫的在線網站GEPIA(http://gepia.cancer-pku.cn/)數據表明，與癌旁組織相比，TRIM59在結直腸癌組織中明顯高表達，差異有統計學意義(P<0.01) (圖1A)；進一步通過Kaplan-Meier分析TRIM59表達與結直腸癌患者總生存期和無病生存期之間的關系，結果表明，TRIM59低表達組患者的總生存期和無病生存期較TRIM59高表達患者無明顯縮短，差異無統計學意義(log rankP=0.57，log rankP=0.54)(圖1B、C)。上述結果表明TRIM59在結直腸癌中高表達，但與結直腸癌患者不良預后無關。

圖1 TCGA數據庫分析TRIM59在結直腸癌及正常結直腸黏膜組織中的表達水平及其與患者預后的相關性A：結直腸癌組織及癌旁組織中TRIM59的相對表達水平；B：Kaplan-Meier生存曲線分析TRIM59表達與結直腸癌患者總生存期的關系；C：Kaplan-Meier生存曲線分析TRIM59表達與結直腸癌患者無病生存期的關系

2.2TRIM59mRNA在結直腸癌細胞中的表達水平采用RT-qPCR檢測結直腸癌細胞及正常結直腸黏膜細胞中TRIM59mRNA表達水平。結果顯示，TRIM59mRNA在結直腸癌細胞HCT116、SW620、SW480中表達高于正常結直腸黏膜細胞FHC，尤其是在HCT116細胞表達最高。

圖2 qRT-PCR法檢測人結直腸癌細胞中TRIM59 mRNA 的表達水平

2.3TRIM59siRNA對結直腸癌細胞中TRIM59mRNA及蛋白表達量的影響將si-TRIM59和si-NC轉染HCT116細胞中，結果顯示，si-TRIM59組的TRIM59mRNA表達水平和蛋白表達水平低于si-NC組(t=18.56，P<0.01)。si-TRIM59干擾組TRIM59蛋白相對表達水平低于si-NC組(t=16.93，P<0.01)。見圖3。

圖3 qRT-PCR和Western blot檢測轉染TRIM59 siRNA后結直腸癌細胞HCT116中TRIM59的mRNA和蛋白表達水平A：qRT-PCR;B:Western blot;與si-NC組比較：*P<0.05

2.4 敲減TRIM59對結直腸癌細胞增殖及細胞克隆形成能力的影響CCK-8檢測結果顯示，在細胞轉染48 h和72 h后，與si-NC組相比，敲減TRIM59表達后，HCT116細胞的增殖能力下降(48 h:t=3.939，P<0.05；72 h:t=8.828，P<0.01)；細胞克隆形成實驗結果表明，與si-NC組相比，敲減TRIM59后HCT116細胞集落形成數目減少(t=5.18,P<0.01)，表明干擾TRIM59表達可顯著抑制結直腸癌細胞的增殖能力。見圖4。

圖4 CCK-8和細胞克隆形成實驗檢測敲減TRIM59對HCT116細胞增殖和克隆形成能力的影響A:CCK-8實驗檢測細胞增殖；B：細胞克隆形成實驗；與si-NC組比較：*P<0.05

2.5 敲減TRIM59對人結直腸癌HCT116細胞周期的影響流式細胞術檢測結果顯示，與si-NC組相比，si-TRIM59組G0/G1期細胞百分比顯著增加，S期比例下降，差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖5。

圖5 流式細胞術檢測敲減TRIM59對人結直腸癌HCT116細胞周期的影響A：si-NC組;B:si-TRIM59組；C：直方圖；與si-NC組比較：*P<0.05

2.6 敲減TRIM59對細胞周期相關蛋白的影響采用Western blot檢測敲減TRIM59對細胞周期蛋白cyclin D1和CDK4表達水平，結果顯示，敲減TRIM59后HCT116中細胞周期相關蛋白CDK4和cyclin D1表達降低(t=38.41,P<0.01；t=11.65,P<0.01)。見圖6。

圖6 Western blot檢測干擾TRIM59對HCT116細胞周期蛋白的影響與si-NC組比較：**P<0.01

3 討論

TRIM59，又稱為Mrf1(mouse ring finger protein 1)，屬于TRIM蛋白超家族的成員之一，其主要位于人類第3號染色體上[7]。TRIM59結構包含高度保守的RBCC結構域和涉及蛋白跨膜定位的TM結構域，其主要功能是參與調控TRIM59細胞內定位[8]。TRIM59可作為原癌基因，在多種實體惡性腫瘤的侵襲、遷移、增殖和凋亡等過程中發揮重要作用[9]。Hao et al[10]研究表明，TRIM59在非小細胞肺癌(NSCLC)中的表達明顯上調，其表達與NSCLC患者的年齡、性別、吸煙狀態、腫瘤分期、淋巴結轉移和病理分期密切性相關；此外，Cox回歸分析結果表明TRIM59是NSCLC的獨立預后因子。提示TRIM59可作為非小細胞肺癌預后的獨立預測指標和潛在的治療靶點。Zhou et al[11]采用qPCR和Western blot法檢測50例胃癌組織和配對正常組織中TRIM59的mRNA和蛋白水平，結果表明，胃癌組織中TRIM59mRNA和蛋白水平較癌旁組織明顯升高，且其高表達與胃癌患者生存時間縮短相關。在胰腺癌的研究中，Li et al[12]研究表明，TRIM59在胰腺癌組織中的表達顯著增加，并且其高表達與胰腺癌患者不良預后呈正相關。Lin et al[13]研究表明TRIM59在人前列腺癌組織中高表達，干擾TRIM59表達可明顯抑制前列腺癌細胞增殖和克隆形成能力，干擾TRIM59可增加S期細胞的比例，降低G2/M期細胞比例，且CDC25A、CDC2和cyclinB1三個細胞周期調節蛋白表達水平下降。

與上述結果相類似，本研究結果表明，TRIM59在結直腸癌組織及細胞中均高表達，提示TRIM59可能在結直腸癌的發生發展過程中發揮重要作用。

以結直腸癌細胞HCT116為研究對象，構建TRIM59基因siRNA載體，將此載體以瞬時轉染方式抑制細胞中TRIM59mRNA表達；結果顯示，敲減TRIM59的表達抑制了HCT116細胞的增殖能力和細胞集落形成能力，導致G1期比例增加，S期比例減低，提示G0/G1期細胞周期阻滯。以上研究表明，TRIM59在結直腸癌發展中發揮促進作用。

隨后，本研究對TRIM59促進結直腸癌細胞增殖的相關分子機制進行初步探索。有研究[14-15]表明，CDK4作為細胞G1/S期轉換的關鍵調控因子，它與細胞cyclin D1形成復合物后可使腫瘤細胞蛋白發生磷酸化失活，驅動細胞周期進展，從而影響腫瘤的惡性進程。本研究表明敲減TRIM59表達后可通過下調CDK4和cyclin D1表達來抑制細胞周期G1/S期轉變，從而抑制細胞生長。癌基因和抑癌基因的異常表達參與細胞周期的調節，從而導致腫瘤細胞異常增殖。