改良透明質酸水凝膠控釋腦源性神經營養因子對大鼠胚胎神經干細胞生長、分化和凋亡的影響

王 震，張香路，李 陽，阮銘暄，黃 斐

目前脊髓損傷的治療仍然面臨著很大的挑戰，主要原因是脊髓損傷內部的神經干細胞分化效率低[1]，神經生長因子的缺乏以及損傷部位產生炎癥的微環境[2-3]。組織工程技術將神經干細胞支架與藥物或生長因子結合來克服這些問題。透明質酸(hyaluronic acid, HA)因具有非免疫原性，良好的生物相容性[4]，而廣泛用作脊髓損傷修復的生物材料。但HA降解速度過快，不支持細胞黏附[5-6]，因此需對HA進行改良，用己二酸二酰肼(adipic dihydrazide，ADH)對HA修飾，然后與葡聚糖(dextran，Dex)接枝。腦源性神經營養因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)是脊髓損傷實驗中最常用的生長因子，它可以促進神經干細胞的增殖，神經軸突的生長，并誘導神經干細胞分化為神經元[7]，然而，BDNF半衰期短，很難保持長期的活性[8]。聚乳酸乙醇酸[poly(lactic-co-glycolic acid), PLGA]作為受控細胞因子的釋放載體，能有效維持細胞因子的活性，延長其作用時間[9]。該研究制備了改良HA水凝膠控釋BDNF的微環境，首先，將BNDF包覆在PLGA微球中制備BDNF-PLGA微球，然后用改良的HA與微球進行混合，形成BDNF-PLGA/Dex-HA微環境，最后探討大鼠胚胎神經干細胞(rat fetal neural stem cells, rFNSCs)與BDNF-PLGA/Dex-HA微環境共培養對rFNSCs的生長、分化及凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組孕14 d的Sprague-Dawley(SD)大鼠3只，清潔級，300～320 g，由安徽醫科大學實驗動物中心提供。實驗以大鼠胚胎干細胞為研究對象，將實驗分為3組：空白對照組為rFNSCs與PLGA和HA共培養；條件對照組為rFNSCs與BDNF-PLGA和HA共培養；實驗組為rFNSCs與BDNF-PLGA和改良的透明質酸水凝膠即Dex-HA共培養。

1.2 主要試劑及儀器HA鈉鹽(分子量：1.5～2.0 Mu，化妝品級，≥99.5%)購自山東福瑞達生物科技有限公司；除非另有說明，實驗中使用的BDNF和高碘酸鈉(NaIO4，≥99%)和氯化鐵六水合物(FeCl3·6H2O，≥98%)均購自美國Sigma-Aldrich公司。DMEM/F12培養基、B27和胎牛血清(美國Gibco公司)；表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)和堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor，b-FGF)(美國Pepro-Tech公司)；巢蛋白(Nestin)多克隆抗體、羊抗兔 Alexa fluor 488(英國Abcam公司)；βⅢ微管蛋白(βⅢ-tubulin)單克隆抗體、星形膠質細胞特異性蛋白(GFAP)多克隆抗體和少突膠質細胞特異性蛋白(CNPase)單克隆抗體(美國Chemicon公司)；驢抗兔Alexa fluor 594(美國Sigma-Aldric公司)；大鼠ELISA試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)；細胞活力檢測試劑盒(CCK-8)(日本同仁化學研究所)；酶標儀(美國Thermofisher公司)；倒置熒光顯微鏡、BX-51免疫熒光顯微鏡(日本Olympus Corporation公司)。

1.3 BDNF-PLGA微球的合成將200 mg PLGA(75/25，分子量：4～15 ku)溶解在2 ml的二氯甲烷中，10 μg的BDNF溶于1 ml牛血清白蛋白，將兩種溶液混合。然后，將10 ml聚乙烯醇(PVA，1%)緩慢加入到混合物中超聲混勻，加入80 ml PVA(0.3%)，攪拌12 h以去除二氯甲烷。最終的乳狀液用蒸餾水洗滌，離心，冷凍干燥，得到負載BDNF的PLGA微球。

1.4 氧化葡聚糖(ODex)的產生和HA-ADH的合成ODex的產生：將1 g Dex溶于20 ml蒸餾水中，加入2 ml NaIO4(100 mg/ml)，于室溫避光攪拌反應12 h。然后加入乙二醇終止反應。將所得溶液用纖維素管(截留分子量為7～12 ku)在去離子水中透析3 d，之后冷凍干燥處理。

HA-ADH的合成：將100 mg HA溶解于25 ml蒸餾水中，再加入8倍量的ADH，磁力攪拌4 h。將100 mg EDC和132 mg HoBt溶解在2 ml的50%DMSO溶液中，形成羧基活性基團，后用酰肼基團對HA進行修飾，調節HA-NHNH2溶液的pH至6.8持續反應4 h，將pH調至7.0完成反應。最后在100 mmol/L NaCl、25%EtOH/H2O和去離子水中透析3 d，-50 ℃條件下冷凍干燥，獲得凍干的HA-ADH粉。

1.5 構建BDNF-PLGA/Dex-HA及BDNF-PLGA/HA水凝膠將20 mg BDNF-PLGA微球加入1 ml 2%HA-ADH和0.5 ml 6%ODex混合溶液中，輕輕攪拌混合物，以24孔板作為圓柱形模具，制成BDNF-PLGA/Dex-HA水凝膠微環境。同樣的辦法構建BDNF-PLGA/HA水凝膠。

1.6 rFNSCs的分離、培養及鑒定rFNSCs的分離：將Sprague-Dawley(SD)大鼠用10%水合氯醛麻醉后，無菌條件下取出大鼠大腦皮質放入預冷的DMEM/F12培養液中，用剪刀將組織塊剪成1 mm3大小，收集于離心管中，D-Hank’s液清洗2次。然后加入0.25%的trypsin-EDTA和DNAase 100 μl于37 ℃下消化10 min，加入胎牛血清終止消化，并用吸管反復吹打，然后通過200目濾網制成單細胞懸液，將懸液在1 000 r/min離心5 min，獲得rFNSCs后進行原代及繼代培養。

rFNSCs培養：將分離的rFNSCs接種在低吸附培養皿上，加入含有2% B27、 20 ng/ml EGF和b-FGF的DMEM/F12培養液重懸,置于37 ℃、5%CO2細胞培養箱中培養7 d以上，傳代3～4次后，用于進一步實驗。

rFNSCs鑒定：將神經球放置在涂有0.1%多聚賴氨酸和Nestin(神經干細胞的標志物)的玻片上，用免疫細胞化學染色方法進行rFNSCs的鑒定。體外分化時，加入DMEM/F12與2% B27的分化培養基分化3 d，免疫細胞化學鑒定神經元。

1.7 水凝膠中BDNF的釋放用ELISA法測定BDNF的釋放量。將rFNSCs接種于BDNF-PLGA/Dex-HA水凝膠支架中作為實驗組，將100 ml BDNF-PLGA/Dex-HA水凝膠加入到10 ml無菌PBS中，按照ELISA試劑盒說明進行檢測。在每個設定的時間點(1～14 d)每天收集樣本的上清液，計算累積釋放率。將rFNSCs接種于BDNF-PLGA/HA水凝膠支架中作為條件對照組，并在相同時間點檢測BDNF濃度。所有實驗均重復3次，取每個時間點上的3個數值求平均值。

1.8 細胞增殖實驗將三組的水凝膠放在超凈工作臺中，紫外滅菌過夜。取96孔板，分別加入空白對照組、條件對照組和實驗組的水凝膠50 μl至96孔板中，將rFNSCs細胞按1×105個/ml的密度接種于96孔板中。在37 ℃、5%CO2培養箱中培養1、3、7 d后，將CCK-8試劑按照10 μl/孔加入到培養板中并在37 ℃、5%CO2條件下孵育4 h。酶標儀測量孔板中的溶液在450 nm處的吸光度(A)值。

1.9 Live/Dead實驗采用Live/Dead實驗檢測不同水凝膠中rFNSCs的活力。首先將每組的凝膠樣品分別放置于培養板底部，然后將1×103個rFNSCs種植于凝膠上，在37 ℃、5%CO2條件下培養72 h，用2 μmol/L Calcein-AM和4 μmol/L EthD-1于黑暗環境中常溫下染色30 min，然后PBS洗滌2次，在共聚焦顯微鏡下觀察各組凝膠接觸的細胞生長情況。活細胞呈現綠色，死細胞呈現紅色。

1.10 水凝膠對神經干細胞分化潛能的影響為探討rFNSCs在三組水凝膠中的分化程度，將在三組水凝膠中培養7 d的rFNSCs用4%甲醛室溫固定30 min，再用含0.1%Triton X-100的PBS中滲透15 min，在含1%BSA室溫封閉2 h。加入一抗rFNSCs標志物Nestin抗體(1 ∶250)、神經元標志物βⅢ-tubulin抗體(1 ∶100)、神經膠質細胞標志物GFAP抗體(1 ∶400)、少突膠質細胞標志物CNPase(1 ∶200)，于4 ℃孵育過夜。樣品用PBS洗滌3次后，分別用二抗山羊抗鼠IgG偶聯Alexa-Fluor488(1 ∶500)和驢抗兔IgG(1 ∶800)偶聯Alexa-Fluor594(1 ∶500)二抗室溫避光孵育2 h后，用DAPI染色細胞核后，用共聚焦顯微鏡采集圖像。

2 結果

2.1 水凝膠中BDNF的釋放水凝膠中BDNF的釋放如圖1所示，實驗組改良的水凝膠與條件對照組水凝膠有相似的14 d控釋和持續釋放的特性，這兩種水凝膠的BDNF釋放曲線可分為三個階段。實驗組水凝膠中的BDNF釋放曲線在前6 d呈線性緩釋，釋放率達到20.07%。第7～12天，樣品的釋放速率均勻增加，第12天樣品中BDNF的累積釋放率達到86.97%。在第13天與第14天，BDNF的積累釋放速率平均為88.52%和88.57%，趨于平穩。至于條件對照組水凝膠，BDNF在前4 d相對穩定，第5～11天，BDNF的釋放率增加，第11天BDNF的釋放率達到85.31%，第12～14天，BDNF的積累釋放量達到平衡。

2.2 rFNSCs的鑒定在圖2A中，大多數分離的細胞主要以神經球的形式生長，其形態符合rFNSCs鑒定的金標準。免疫細胞化學結果顯示神經球對Nestin呈陽性反應(圖2B)，因此懸浮神經球可以認為是rFNSCs。

2.3 rFNSCs與水凝膠共培養將rFNSCs按1×105/ml接種入三組的水凝膠上共培養。如圖3，培養3 d后在掃描電鏡下觀察rFNSCs的微觀形態，可見實驗組水凝膠中rFNSCs相對于空白對照組和條件對照組中rFNSCs增殖較多，且rFNSCs在水凝膠中細胞維持了良好的形態，提示rFNSCs與水凝膠具有良好的相容性。

圖3 rFNSCs在不同環境中的培養 A：rFNSCs與空白對照組水凝膠培養3 d；B:rFNSCs與條件對照組水凝膠共培養3 d；C:rFNSCs與實驗組水凝膠共培養3 d；1：×200；2：×1 000

2.4 細胞增殖實驗為了評價改良的HA水凝膠形成微環境能否支持rFNSC的生長，在實驗的第1、3、7天用CCK-8檢測細胞增殖活性。結果如圖4所示，在相同的培養時間條件下， 實驗組第3天的細胞增殖活性高于空白對照組(F=4.282,P<0.05)，第7天時， 實驗組細胞增殖活性高于空白對照組和條件對照組(F=15.240,P<0.05)，且條件對照組也高于空白對照組(P<0.05)，表明實驗組改良的HA水凝膠對rFNSC細胞增殖具有促進作用。

圖4 CCK-8法檢測不同培養組中rFNSCs的增殖活性與空白對照組比較：*P<0.05；與條件對照組比較：#P<0.05

2.5 細胞活力分析不同組的細胞活性在第3天用Live/Dead實驗進行評估,其中活細胞染成綠色，死細胞染成紅色。共聚焦結果顯示，與空白對照組相比，條件對照組與實驗組的細胞凋亡數目明顯降低，且實驗組死亡數目最少(圖5C)。由此可見，實驗組水凝膠可以降低rFNSCs的凋亡。

圖5 不同培養環境中rFNSCs細胞的活/死熒光染色 ×200A：rFNSCs與空白對照組水凝膠培養3 d；B:rFNSCs與條件對照組水凝膠共培養3 d；C:rFNSCs與實驗組水凝膠共培養3 d

2.6 rFNSCs在水凝膠中的的分化情況通過免疫組織化學研究制備改良HA水凝膠控釋BDNF對rFNSCs分化的影響，并統計其中各種細胞所占比例。其中，神經元、少突膠質細胞和星形膠質細胞類型細胞數目分別通過神經元特異性蛋白βⅢ-tubulin、少突膠質細胞特異性蛋白CNPase和星形膠質細胞特異性膠質纖維酸性蛋白GFAP的陽性表達數目來評估。與空白對照組及條件對照組相比,實驗組βⅢ-tubulin陽性率升高(F=30.418,P<0.05)、GFAP陽性率降低(F=28.381,P<0.05)，且條件對照組較空白對照組GFAP陽性率降低(P<0.05)。三組CNPase陽性率變化差異無統計學意義見圖6、7。由此可見，實驗組改良HA水凝膠控釋BDNF可以提高rFNSCs向神經元的分化，降低向星形膠質細胞分化，對于向少突膠質細胞的分化效果無明顯差異。

圖6 不同環境中rFNSCs分化的共聚焦顯微鏡圖像 ×400

3 討論

由于脊髓損傷區域周圍不利的微環境，空洞和纖維膠質瘢痕的形成，神經系統中分化成熟神經元自我修復能力的缺乏，以及缺乏合適的生長刺激因子，導致脊髓損傷的有效治療非常有限[10]。目前，針對脊髓損傷后功能恢復的方法有干細胞移植、生物材料及神經營養因子的植入，但研究[11]表明，單純的干細胞、單純的生物材料及單純的神經營養因子移植并不能使脊髓損傷后神經元恢復，但是由于干細胞具有多向分化潛能[12]，組織工程支架可以為其提供支持，神經營養因子則可以促進干細胞的分化，因此三者聯合起來移植便成為了研究的熱點。

相關研究[13]表明HA經過化學修飾及與Dex接枝可以降低HA的降解速度，提高其機械性能及增強神經細胞的黏附性能，為細胞提供了適宜細胞黏附及生長的微環境。

圖7 不同組中rFNSCs分化的百分比與空白對照組比較：*P<0.05；與條件對照組比較： #P<0.05

神經營養因子可以提高神經元的存活率，促進軸突再生。BDNF是脊髓損傷實驗中最常用的神經營養因子。研究[14]表明，外源性的BDNF可以促進損傷部位軸突的再生，髓鞘的形成，以及誘導損傷部位神經干細胞的增殖。PLGA作為受控的細胞因子釋放載體，能有效維持細胞因子的活性。本研究中將改良的HA(Dex-HA)與控釋BDNF的微球結合，BDNF在水凝膠釋放結果顯示實驗組的累計釋放率在開始階段和中期階段略低于條件對照組的，這是由于從PLGA微球中釋放BDNF后，BDNF從水凝膠基質中向外釋放。由于實驗組的Dex-HA相對于條件對照組的HA更穩定，不易被水解，所以實驗組相對于條件對照組在前中期累計釋放率低，后期累計釋放率高。且實驗組中BDNF的釋放，在前中期階段快速釋放，在后期的階段緩慢釋放，可以有效保護細胞因子的生物活性，這種釋放方式為神經干細胞的生長和分化形成局部有效濃度。將rFNSCs接種到三組水凝膠共培養3 d后在掃描電鏡下觀察rFNSCs的微觀形態，可見實驗中rFNSCs相對于空白對照組和條件對照組中rFNSCs增殖較多，主要原因是實驗組水凝膠相對穩定且利于細胞黏附，可以給rFNSCs提供一個良好的生長微環境。同時可以看到rFNSCs在水凝膠中細胞維持了良好的形態，與水凝膠具有良好的相容性。在CCK-8細胞增殖實驗中，實驗組相對于空白對照組與條件對照組吸光度增加(P<0.05)，表明本研究所制備的BDNF-PLGA/Dex-HA中rFNSCs的活性要高于在BDNF/HA水凝膠和BDNF-PLGA/HA水凝膠中的。Live/Dead實驗表明實驗組相對于空白對照組及條件對照組可以減少rFNSCs凋亡，提高其活力，主要原因是Dex-HA相對于HA的降解速度減緩了，機械性能及對神經細胞的黏附性能增加了，為rFNSCs提供了穩定的適宜生長的微環境。在免疫細胞化學染色實驗中，實驗組相對于空白對照組和條件對照組能提高rFNSCs分化成神經元的比例，減少rFNSCs分化成星形膠質細胞的比例。

綜上所述，改良的HA水凝膠的多孔結構為rFNSCs的生長、增殖及細胞黏附提供了良好的三維微環境，且其控釋BDNF可以促進rFNSCs向神經元的分化，減少了向星形膠質細胞的分化，解決了脊髓損傷區域神經元缺乏及膠質瘢痕形成的問題。該研究為后期相關動物實驗研究奠定了良好的基礎。