Eya1基因過表達對MES23.5細胞凋亡的影響

秦登利，高 錦

帕金森病(Parkinson′s disease, PD)是一種常見的神經系統退行性疾病[1]。PD發生的主要病理學特征為黑質致密部多巴胺能神經元變性死亡[2]。雖然目前臨床上的藥物可以暫時減緩PD的運動癥狀，但卻不能阻止多巴胺能神經細胞的漸進性死亡[3]。眼發育缺失1(eye absent 1, Eya1)是Eya家族中的一員，是一種轉錄激活因子[4]。Eya家族成員主要由兩個結構域構成，即氨基端和羧基端結構域[5]。研究顯示Eya1不僅在發育中，在腫瘤及神經相關疾病中均發揮著重要的作用[6]。Eya1可修復大腸腫瘤細胞中斷裂的DNA，進而拮抗細胞凋亡的作用[7]。在損傷早期的多巴胺能神經細胞中，Eya1通過轉錄因子Six2促進膠質細胞系神經營養因子的表達而保護損傷的細胞[8]。然而，Eya1保護受損多巴胺能神經細胞的具體機制尚未闡明。

該研究構建了攜帶Eya1基因的慢病毒表達質粒，篩選了穩定高表達Eya1的細胞株，并通過CCK-8、Hoechst 33258染色和Western blot方法檢測過表達Eya1對細胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1主要試劑 大鼠DA能神經細胞系MES23.5細胞購自中國科學院細胞庫(上海)；HEK 293細胞購自美國ATCC公司；Lipofectamine 2000購自天津Invitrongen公司；ApaL I和Xho I等限制性內切酶購自美國NEB公司；Eya1 Polyclonal Antibody(貨號：22658-1-AP、稀釋比1 ∶500)、Bcl-2 Polyclonal Antibody(貨號：12789-1-AP、稀釋比1 ∶2 000)及Bax Polyclonal Antibody(貨號：50599-2-lg、稀釋比1 ∶5 000)均購自武漢三鷹Proteintech公司，細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒(貨號：KGA317)購自南京凱基公司；Hoechst 33258染色試劑盒(貨號：C0003)購自上海碧云天公司；6-羥基多巴胺(6-hydroxydopamine，6-OHDA)藥物(貨號：HY-B1081A)購自上海MCE公司。

1.2 方法

1.2.1細胞培養 將MES23.5細胞和HEK 293細胞用含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素的DMEM培養基中，于37 ℃、5%CO2、95%濕度的培養箱內培養，當細胞培養生長到90%融合度左右時用0.25%胰蛋白酶消化傳代，選擇處于對數生長期良好的細胞用于實驗。

1.2.2攜帶Eya1基因的載體的構建 利用NCBI數據庫下載Eya1基因序列(Gene ID:NM_001 310 459.1)，利用引物設計軟件，設計一對Eya1基因特異性的PCR引物，正向引物為5′-GCCAACTTTGTACAAAAAAGCAGGCTGCCACCATGGAA ATGCAGGATCCTAAACCAGCC-3′，反向引物為5′-TACTTGTCGTCATCGTCTTTGTAGTCCAGGTACTCTA ATTCCAAGGCATG-3′，引物由上海生工有限公司合成。

PCR擴增目的基因Eya1，并使其兩端帶上Gibson(Gibson Assembly)反應重疊區域。在核酸外切酶、DNA聚合酶和DNA連接酶的共同作用下發生Gibson反應，將目的基因連接到入門載體，構建pDown-mEya1入門載體。將Gibson反應產物轉化到感受態細胞DH5α后，將平板37 ℃倒置培養過夜，隨后挑取菌落，PCR反應鑒定陽性克隆，DNA測序mEya1區域，確認序列正確的克隆。然后，將攜帶attL4-EFIA-attR1序列的pUp-EF1A、攜帶attL1-mEya1-attL2序列的pDown-mEya1和攜帶attR4-Chl-ccdB-attR2序列的慢病毒終載體pLV.Des2d.C/mCherry:T2A:Puro LR反應(reaction of an attL substrate with an attR substrate)，EF1A啟動子、mEya1/Flag按順序正確插入到終載體上，經過轉化挑菌、酶切鑒定得到正確的mEya1過表達慢病毒終載體(plv-mCherry:T2A:Puro-EF1A>mEya1/Flag)，過表達的Eya1轉錄本：[NM_001 310 459.1]。

1.2.3攜帶Eya1基因的慢病毒顆粒的包裝及病毒滴度測定 培養HEK 293細胞，待細胞匯合度達到80%～90%時，替換成無抗生素的完全培養基。加入質粒DNA混合物(15 μg轉移載體和20 μg的包裝混合物)和脂質體2 000。轉染后48～72 h，收集病毒上清液，4 ℃、3 000 r/min離心15 min，用0.45 μm濾膜進一步過濾病毒上清液。將200 μl病毒濃縮液加入至離心管，上層加入1.5 ml的20%蔗糖溶液，平衡后12 000 r/min離心2 h。離心去上清液，收集沉淀病毒顆粒，每管沉淀用200 μl Hank′s平衡鹽溶液重懸，測定病毒滴度。48～72 h后熒光顯微鏡下觀察熒光表達情況。選取熒光率在1%～20%的孔進行滴度計算。

1.2.4篩選穩定表達Eya1基因的MES23.5細胞 取對數生長期的MES23.5細胞按照每孔5×104個細胞接種到6孔板內，待細胞生長到50%～60%融合度時感染病毒，分為對照組(未感染慢病毒的細胞)、空載體組(感染攜帶熒光蛋白但不攜帶Eya1基因的慢病毒)和慢病毒感染組(感染攜帶Eya1基因及熒光蛋白基因的重組慢病毒)。根據預實驗得到的最佳感染細胞的感染復數在培養基中加入MOI=10的病毒量，同時加入感染試劑Polybrene(最終濃度應為5 μg/ml)提高感染效率。混勻后置于細胞培養箱培養；12 h后更換新的培養基；48 h后熒光顯微鏡下觀察感染效率，并加入嘌呤霉素(預實驗測定的最佳藥物篩選濃度為8 μg/ml)篩選出感染成功的細胞進行實驗。

1.2.5MES23.5細胞損傷模型的制備 本課題組前期研究顯示，100 μmol/L 6-OHDA溶液加入多巴胺能神經細胞2 h，細胞生存率約為53%，所以選擇此濃度和時間用于后續實驗。待細胞生長密度到90%左右時，加入100 μmol/L 6-OHDA溶液，對照組加入含抗壞血酸的0.9%氯化鈉溶液，在加入6-OHDA 2 h后收集細胞，進行MES23.5細胞凋亡的檢測，以及采用Western blot檢測Bcl-2和Bax蛋白的表達變化。

1.2.6CCK-8試驗檢測MES23.5細胞活力 取對數期生長的細胞，用胰蛋白酶消化成單細胞懸液，將MES23.5細胞以每孔8×103個的密度接種在96孔板中，每組均設置6個復孔；24 h培養細胞貼壁后，對照組加抗壞血酸處理2 h，給予空載體組和過表達Eya1組加藥處理2 h后，將培養基吸出，每孔加入100 μl培養基和10 μl CCK-8試劑，混勻后置于細胞培養箱孵育2 h。用酶標儀在波長450 nm處測定各孔吸光度值。

1.2.7Hoechst 33258染色 細胞發生凋亡時，染色質會發生固縮。Hoechst 33258對細胞進行染色后，在熒光顯微鏡下觀察，正常細胞核呈正常的藍色，而凋亡的細胞核會呈致密濃染或呈碎片狀致密濃染。將細胞接種到24孔板中(5×104細胞/孔)，當細胞融合度為80%左右時，對照組加入抗壞血酸處理2 h，實驗組加入100 μmol/L 6-OHDA處理2 h，吸盡培養液，加入150 μl固定液，固定10 min后，用PBS洗3遍，加入150 μl Hoechst 33258染液，染色5 min，去染色液，用PBS洗2遍，吸盡液體，滴一滴抗熒光淬滅液于載玻片上，蓋上有細胞的蓋玻片，熒光顯微鏡下觀察細胞核形態變化。

1.2.8Western blot檢測Eya1、Bcl-2和Bax蛋白表達水平 取對數期生長的細胞，收集病毒感染細胞和6-OHDA處理后的細胞及對照組細胞，用預冷的RIPA裂解液提取總蛋白，12 000 r/min離心30 min，取上清用BCA(bicinchonininc acid)法測定蛋白濃度，按1 ∶4的體積比在蛋白樣品中加入5×SDS上樣緩沖液，95 ℃煮沸變性10 min。取60 μg蛋白進行SDS-PAGE電泳分離目的蛋白，并轉移至NC膜，使用5%的脫脂牛奶室溫封閉2 h，加一抗4 ℃孵育過夜，washing buffer洗滌條帶3次，每次10 min，室溫二抗避光孵育2 h，再用washing buffer洗滌條帶3次后用Odyssey CLX紅外激光成像系統掃描條帶。以β-actin為內參，使用Image J分析條帶灰度值。

2 結果

2.1 攜帶Eya1基因的慢病毒重組表達質粒的構建及鑒定PCR擴增的目的片段Eya1經Gibson和LR反應后連接于慢病毒終載體，利用SnapGene軟件進行酶切分析，可知使用ApaL I和Xho I連接的載體進行雙酶切后，可以分別產生1 085、2 295、2 891、1 246、3 648 bp的5條DNA條帶(圖1A)。酶切后瓊脂糖凝膠電泳結果顯示有5條清晰的條帶，與預測的一致，其中2 295處所在的條帶包含目的基因Eya1(圖1B)。測序結果經DNA分析比對與預期完全一致(圖2)。以上結果表明攜帶Eya1的重組表達載體構建成功。

圖1 構建的重組慢病毒質粒酶切后瓊脂糖凝膠電泳分析A：重組慢病毒質粒；B：瓊脂糖凝膠電泳分析；M：DNA marker；P7：未轉染質粒；7：重組慢病毒質粒

圖2 DNA測序圖譜及基因序列比對

2.2 攜帶Eya1基因的慢病毒的包裝及病毒滴度測定將Eya1表達質粒轉染至HEK293細胞中，培養48 h后收集細胞培養上清液，通過熒光計數法進行滴度測定。病毒滴度=熒光細胞數×稀釋倍數×1 000，結果顯示上清液中的病毒滴度為2.61×108(TU/ml)。

將慢病毒包裝的Eya1顆粒按照預實驗的感染復數MOI=10感染到MES23.5細胞中，48 h后能明顯觀察到大量mCherry紅色熒光(圖3)，感染效率達80%。經嘌呤霉素藥物篩選后得到穩定表達目的基因的細胞株，即Eya1 MES23.5細胞株。

圖3 Eya1慢病毒感染MES23.5細胞 ×20A：明場顯微鏡下；B：熒光顯微鏡下

2.3 穩定表達Eya1基因的MES23.5細胞中Eya1蛋白水平的鑒定收集培養的Eya1 MES23.5細胞株，Western blot方法鑒定細胞中Eya1蛋白的表達。結果顯示，過表達Eya1組中Eya1蛋白表達水平明顯高于空載體組和對照組(F=11.82，P<0.05)，見圖4。以上結果進一步表明，成功篩選出穩定表達Eya1的MES23.5細胞。

圖4 Western blot檢測MES23.5細胞中Eya1蛋白表達水平A：Western blot檢測Eya1基因的表達；B：各組Eya1蛋白灰度值統計圖；1：對照組；2：空載體組；3：過表達Eya1組；與空載體組比較：*P<0.05

2.4 過表達Eya1對6-OHDA誘導的MES23.5細胞活力的影響用CCK-8試驗檢測了藥物處理后MES23.5細胞的活力變化并進行了形態學觀察。結果顯示，過表達Eya1組細胞活力明顯高于空載組(F=9.159，P<0.05)，而對照組之間差異無統計學意義(圖5)。顯微鏡下觀察顯示，對照組細胞形態正常，胞體和突起均勻附著；加藥處理后細胞形態異常，胞體變小且皺縮，過表達Eya1組細胞胞體變小和皺縮明顯減輕(圖6)。以上結果表明過表達Eya1保護了藥物處理對MES23.5細胞的損傷作用。

圖5 CCK-8檢測各組細胞的活力1：對照組；2：空載體組；3：6-OHDA處理的空載體組；4：6-OHDA處理的過表達Eya1組；與6-OHDA處理的空載體組比較：*P<0.05；與對照組比較：#P<0.05

圖6 顯微鏡下MES23.5細胞形態的觀察 ×20A：對照組；B；空載體組；C：6-OHDA處理的空載體組；D：6-OHDA處理的過表達Eya1組

2.5 過表達Eya1對6-OHDA誘導的MES23.5細胞凋亡的影響Hoechst 33258染色觀測了藥物處理后MES23.5細胞核的形態學變化。結果顯示，熒光顯微鏡下觀察到未加藥物處理組的細胞核呈現均勻淡藍色，細胞核大小一致，形狀均勻(圖7A、B)。6-OHDA藥物處理后，空載體組細胞核發生固縮，變小，且出現凋亡小體，細胞核呈現濃染致密的熒光(圖7C)；過表達Eya1組細胞核中凋亡小體與空載體組相比明顯減少。以上結果表明過表達Eya1可降低6-OHDA誘導的MES23.5細胞的凋亡。

圖7 Hoechst 33258染色觀察細胞的凋亡情況 ×20A：對照組；B：空載體組；C：6-OHDA處理的空載體組；D：6-OHDA處理的過表達Eya1組；箭頭：為部分凋亡細胞

2.6 過表達Eya1對6-OHDA誘導的MES23.5細胞中凋亡相關蛋白Bcl-2、Bax表達的影響Western blot方法檢測細胞中促凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，結果顯示，未加藥物處理組中Bcl-2和Bax表達差異沒有統計學意義；6-OHDA誘導細胞損傷后，Eya1過表達組Bax表達明顯低于空載體組(F=11.89，P<0.05)，而Bcl-2的表達明顯高于對照組(F=27.83，P<0.05)(圖8)。說明過表達Eya1增強了MES23.5細胞的抗凋亡作用。

圖8 Western blot檢測各組Bcl-2和Bax蛋白的表達A：Western blot 檢測各組Bcl-2和Bax蛋白的表達B：每組Bcl-2蛋白表達水平統計圖；C：每組Bax蛋白表達水平統計圖；1：對照組；2：空載體組；3：6-OHDA處理的空載體組；4：6-OHDA處理的過表達Eya1組；與對照組比較：#P<0.05；與6-OHDA處理的空載體組比較：*P<0.05

3 討論

在各種病毒載體中，慢病毒載體具有將外源基因有效整合到宿主染色體上，因而可以持久性表達，同時，慢病毒載體還具有安全性高的特點[9]。本研究利用慢病毒載體建立穩定高表達Eya1的細胞株，為研究Eya1基因在多巴胺能神經細胞中的生物學功能奠定基礎。

本研究將構建的Eya1過表達的穩定感染的MES23.5細胞株及其空載體對照組細胞株給予6-OHDA處理2 h，構建DA能神經細胞的損傷模型。研究結果顯示，6-OHDA作用2 h時MES23.5細胞的活性降低了約50%，故選擇6-OHDA作用2 h，便于觀察Eya1過表達對損傷的細胞是否具有保護作用。CCK-8檢測結果顯示，過表達Eya1組的細胞活力明顯高于空載體對照組，這說明Eya1對損傷的MES23.5細胞具有保護作用。Hoechst 33258染色結果表明Eya1是通過拮抗細胞凋亡的作用發揮了對細胞的保護作用。

細胞凋亡的主要途徑有死亡受體途徑和以線粒體為主的內源性凋亡，線粒體信號通路在調節細胞凋亡中起著重要的作用。線粒體凋亡途徑上Bcl-2蛋白家族作為參與細胞凋亡的核心家族，對凋亡的調控意義尤為突出[10]。在Bcl-2蛋白家族中Bcl-2是起主要作用的抗凋亡蛋白，有證據表明Bcl-2家族蛋白的功能與多巴胺能神經元的發育密切相關，Bax是重要的促凋亡蛋白。正常情況下，腦組織神經細胞處于抗凋亡與促凋亡相對平衡狀態。Bcl-2高表達狀態是為了阻止細胞凋亡，起到一種生理性神經自我保護作用，而Bax高表達狀態則是促進了細胞凋亡，起到一種病理學破壞作用[11-12]。本研究在應用Hoechst 33258法檢測細胞凋亡的基礎上，同步應用Western blot方法對Bcl-2和Bax蛋白進行檢測，進一步證實了Eya1在損傷的細胞中具有拮抗細胞凋亡的作用，結果顯示過表達Eya1組的Bcl-2表達明顯高于空載體組，Bax蛋白表達明顯低于空載體組。然而，本研究中課題組發現一個現象，即6-OHDA處理后的空載體組中Bcl-2的蛋白表達水平與對照組相比增高，而不是降低。造成這種現象的原因可能為受損早期的細胞啟動自身的應激性保護機制，調用自身抗凋亡系統來抵抗藥物造成的損傷。這也與本課題組前期研究[8]結果相一致，即在6-OHDA作用1～3 h時，Eya1表達一過性增高，以保護受損的多巴胺能神經細胞。

綜上所述，該研究構建了Eya1過表達的慢病毒表達載體及Eya1穩定表達的MES23.5細胞株，表明過表達Eya1通過調控Bcl-2、Bax表達，拮抗6-OHDA誘導的MES23.5多巴胺能神經細胞的凋亡。該研究為課題組進一步開展Eya1基因在帕金森病中的功能和作用機制研究奠定了重要基礎。