諾卡酮對抑郁樣行為和海馬中PKA/CREB/BDNF信號通路的影響

王凱新，王三旺，翟慶齡，趙 娣，劉 晶，孟凡濤，李 晨，陳金波

抑郁癥是一種發病率較高且容易復發的精神疾病，其特征是情緒低落、快感缺乏、思維遲緩等，嚴重者可有自殺傾向，近年來抑郁癥的患病率呈逐年上升趨勢[1]。傳統抗抑郁藥物一般需要幾周到幾個月的治療周期，并且近50%的抑郁癥患者治療反應差或沒有反應[2]。諾卡酮(nootkatone)是一種天然存在的倍半萜烯類，是有益智作用的中草藥提取物[3]。研究[4]表明諾卡酮具有改善認知功能損傷的神經保護作用，但是其對慢性應激誘導抑郁表型的影響作用和機制尚不明確。海馬神經再生受損與抑郁癥的發生和發展密切相關，許多抗抑郁藥物通過增加海馬神經再生起到治療抑郁癥的作用[5]，腦源性神經營養因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)作為抑郁癥的重要致病基因在腦內廣泛分布，尤其是海馬腦區[6]。該研究用慢性不可預知應激(chronic unpredictable stress，CUS)建立小鼠抑郁模型，研究諾卡酮對小鼠抑郁表型的影響，同時檢測海馬腦區神經再生和蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)/環腺苷酸反應元件結合蛋白(cyclic adenosine monophosphate response element-binding protein，CREB)/BDNF信號通路相關蛋白的表達，以探討諾卡酮的抗抑郁作用及其機制，為新型抗抑郁藥物的研發提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物雄性24只SPF級C57BL/6小鼠(20～25 g，8周齡)，購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司[許可證號：SYXK(魯)20190003]。每籠飼養5只，飼養溫度(22±2)℃、相對濕度(55±5)%、12 h/12 h光暗循環的環境,動物可以自由獲取食物顆粒和水。實驗過程中動物處置均符合濱州醫學院附屬醫院動物倫理委員會標準。

1.2 試劑與儀器諾卡酮(nootkatone)購于美國Sigma公司，批號：C5724；RNA組織提取試劑盒購于廣州Omega公司；RNA反轉錄試劑盒購于大連Takara公司；RIPA裂解液及Tween-20購自于上海碧云天生物技術有限公司；AceQ qPCR SYBR Green Master Mix試劑盒購自于南京諾唯贊生物科技股份有限公司；鼠抗β-actin、兔抗CREB、兔抗磷酸化環磷酸腺苷反應元件結合蛋白(phosphorylated cyclic adenosine monophosphate response element-binding protein，p-CREB)，兔抗PKA均購于美國Cell Signaling Technology公司；兔抗BDNF、免疫熒光雙皮質素(doublecortin，DCX)抗體購于英國Abcam公司；驢抗鼠二抗IR Dye680LT、羊抗兔二抗IR Dye800CW購自美國Li-COR公司；ALexafluor 546驢抗兔熒光二抗購于美國Thermo Fisher公司；小鼠自主活動試驗數據用Any-maze軟件分析，購自于美國Stoelting公司。雙紅外激光成像系統Odyssey Sa 購自美國Li-COR公司；共聚焦顯微鏡(FV1200)購自日本東京奧林巴斯有限公司。

1.3 實驗步驟及分組將小鼠隨機分為3組，即對照組、CUS 組、CUS+諾卡酮組。CUS組、CUS +諾卡酮組小鼠連續給14 d CUS，同時，每天在應激之前腹腔注射等劑量的0.9%氯化鈉溶液或10 mg/kg諾卡酮，對照組僅每天腹腔注射等劑量的0.9%氯化鈉溶液。CUS是按照實驗室先前研究報道的步驟進行[7]，應激包括束縛1 h、搖晃和擁擠1 h、夾尾20 min、24 h光照、8 ℃冷水中游泳5 min、濕盒4 h、電擊10 min，每天隨機給予小鼠任意一種上述應激，以確保實驗的不可預測性。第15天進行蔗糖偏好試驗，第16天進行強迫游泳試驗，第17天進行自主活動試驗。第18天將部分小鼠斷頭處死，在冰盤上取腦，用0.9%氯化鈉溶液沖洗干凈后，將小鼠左右側海馬迅速剝離取出，并放入液氮速凍，儲存在-80 ℃中備用。部分小鼠進行灌注固定，取腦進行免疫熒光。

1.4 糖水偏好試驗在整個CUS過程中，給予對照及實驗小鼠雙瓶純水適應，小鼠可以自由選擇飲水，以免小鼠對飲水位置偏好導致結果偏差；實驗前禁水4 h，測試時小鼠單籠飼養，一側給予一瓶純水，另一側放置一瓶1%(w/v)蔗糖溶液，使小鼠可以自由選擇純水或蔗糖溶液；在測試結束時，通過稱重來計算攝入量。根據以下公式計算蔗糖偏好值：蔗糖攝入量/(蔗糖攝入量+水攝入量)。

1.5 強迫游泳試驗小鼠被放在裝有新鮮自來水(溫度：24 ℃±1 ℃，高度：15 cm)的圓柱形玻璃容器(高25 cm，直徑10 cm)中測試6 min游泳，前2 min內記錄小鼠首次出現靜止不動狀態的時間即潛伏期，后4 min中記錄小鼠不動狀態的總持續時間。小鼠在水面漂浮或只有維持呼吸和漂浮的必要輕微運動被定義為不動狀態。

1.6 自主活動試驗小鼠在單籠適應4 h后，輕輕放在測試裝置(40 cm×40 cm×40 cm)的中心位置，小鼠可以自由活動。小鼠的運動通過安裝在籠子上的紅外光電傳感器進行監控，記錄小鼠30 min內的運動情況。

1.7 實時熒光定量PCR(RT-PCR)按照Omega公司的組織RNA提取試劑盒說明書提取總RNA，用RNA反轉錄試劑盒生成cDNA，然后用AceQ qPCR SYBR Green Master Mix試劑盒進行熒光定量PCR，具體反應條件：95 ℃、5 min，95 ℃、10 s，60 ℃、30 s，40個循環；相關引物序列如下：BDNF，(Forward)5′-CCCTGGCTGACACTTTTGAG-3′，(Reverse)5′-TCCAGCAGAAAGAGCAGAGG-3′；β-tubulin，(Forward)5′-AGCAACATGAATGACCTGGTG-3′，(Reverse)5′-GCTTTCCCTAACCTGCTTGG-3′。根據熒光曲線的循環閾值(cycle threshold，Ct)，按照2-ΔΔCt方法計算目的基因的相對表達量。

1.8 Western blot用RIPA組織細胞裂解液從海馬組織中提取總蛋白。用BCA法進行蛋白質定量，隨后加入5×蛋白上樣緩沖液，在100 ℃條件下煮沸8 min。各個樣品用8%～15%的分離凝膠進行SDS-PAGE電泳，并轉到PVDF膜上，后用TBST溶液(20 μmmol/L Tris-HCl，pH 7.4，150 μmmol/L NaCl，0.1% Tween-20)配制的5%脫脂奶粉封閉90 min，之后加入一抗(1 ∶1 000)，4 ℃搖床孵育過夜。之后孵育二抗(1 ∶5 000)，室溫搖床90 min。經雙紅外激光成像系統成像并識別灰度進行分析。

1.9 免疫熒光實驗

1.9.1灌注小鼠 使用4%水合氯醛將小鼠深度麻醉，用0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution，PBS)經左心室灌注，肝臟變白后更換4%多聚甲醛灌注固定，斷頭取腦后，4%多聚甲醛固定過夜，30%蔗糖溶液脫水。用OCT冷凍切片包埋劑包埋腦組織，冰凍切片，切片厚度為40 μm。

1.9.2免疫熒光染色 取含有海馬區域的切片進行DCX免疫熒光染色。將含有1%牛血清白蛋白、3% Triton X-100、0.3%驢血清的PBS液室溫封閉1 h；兔抗DCX(1 ∶1 000)一抗，4 ℃過夜; 加Alexa Fluor 546驢抗兔(1 ∶300)，室溫孵育4 h；用抗熒光衰減封片劑封片。在共聚焦熒光顯微鏡下觀察海馬齒狀回染色結果并拍照。

2 結果

2.1 諾卡酮對CUS誘導的小鼠抑郁行為的影響根據流程圖(圖1A)進行CUS刺激和諾卡酮注射，之后測定抑郁行為。單因素方差分析顯示CUS刺激和諾卡酮給藥對糖水偏好值有影響，差異有統計學意義(F=20.88，P<0.05)。進一步比較分析結果顯示，與對照組比較，CUS組糖水偏好百分比降低(P<0.05)；與CUS組比較，CUS+諾卡酮組糖水偏好百分比增加(P<0.05)，見圖1B。單因素方差分析顯示CUS刺激和諾卡酮給藥對強迫游泳潛伏期有影響，對強迫游泳的不動時間亦有影響，差異皆有統計學意義(F=19.11，P<0.05；F= 9.46，P<0.05)。進一步比較分析結果顯示，與對照組相比，CUS組強迫游泳潛伏期降低(P<0.05)和不動時間增加(P<0.05)；與CUS組比較，CUS+諾卡酮組強迫游泳潛伏期增加(P<0.05)和不動時間降低(P<0.05)，見圖1C。為評估小鼠運動活動情況，對小鼠進行自主活動試驗，比較分析結果顯示各組之間小鼠每2 min的運動距離(P>0.05)及30 min內運動總距離差異均無統計學意義。見圖1D。

圖1 諾卡酮對CUS誘導的小鼠抑郁行為的影響A：實驗設計圖；B：糖水偏好試驗；C：強迫游泳的潛伏期及不動時間測試；D：自主活動試驗；1：對照組；2：CUS 組；3：CUS + 諾卡酮組；與對照組比較：*P<0.05；與CUS 組比較：#P<0.05

2.2 諾卡酮對CUS模型小鼠海馬BDNF的表達的影響單因素方差分析顯示，CUS刺激和諾卡酮給藥對BDNF mRNA和蛋白表達有影響，差異有統計學意義(F= 9.98，P<0.05；F= 6.58，P<0.05)。進一步比較分析結果顯示，與對照組比較，CUS組海馬中BDNF mRNA和蛋白表達水平降低(P<0.05)；與CUS組比較，CUS+諾卡酮組BDNF mRNA和蛋白表達水平升高(P<0.05)。見圖2。

圖2 諾卡酮對CUS誘導的小鼠海馬腦區BDNF表達的影響(n=5)A：BDNF mRNA相對表達水平；B：BDNF蛋白檢測Western blot圖；C：BDNF蛋白水平統計圖；1：對照組；2：CUS組；3：CUS +諾卡酮組；與對照組比較：*P<0.05；與CUS組比較：#P<0.05

2.3 諾卡酮對CUS模型小鼠海馬PKA/CREB信號通路的影響單因素方差分析顯示，CUS刺激和諾卡酮給藥對PKA和p-CREB的表達水平有影響，差異有統計學意義(F=14.90，P<0.05；F=11.46，P<0.05)。進一步比較分析結果顯示，與對照組比較，CUS 組海馬中PKA和p-CREB表達水平降低(P<0.05)；與CUS組比較，CUS+諾卡酮組海馬中PKA和p-CREB的表達水平升高(P<0.05)。見圖3。

圖3 諾卡酮對CUS誘導的小鼠海馬腦區PKA和p-CREB表達的影響A：PKA和p-CREB蛋白檢測Western blot圖；B：PKA蛋白定量分析；C：p-CREB蛋白定量分析；1：對照組；2：CUS組；3：CUS+諾卡酮組；與對照組比較：*P<0.05；與CUS組比較：#P<0.05

2.4 諾卡酮對CUS模型小鼠海馬齒狀回神經元再生的影響單因素方差分析顯示，CUS刺激和諾卡酮給藥對DCX標記的神經元數量有影響，差異有統計學意義(F=8.01，P<0.05)。進一步比較分析結果顯示，與對照組比較，CUS組海馬DCX標記神經元數量降低(P<0.05)；與CUS組比較，CUS+諾卡酮組DCX標記神經元數量增加(P<0.05)。見圖4。

圖4 諾卡酮對CUS誘導的小鼠海馬腦區DCX標記神經元數量的影響A：DCX免疫熒光圖 ×40；B：DCX陽性細胞定量結果；箭頭所示：海馬齒狀回；1：對照組；2：CUS組；3：CUS+諾卡酮組；與對照組比較：*P<0.05；與CUS組比較：#P<0.05

3 討論

研究表明，諾卡酮具有多種藥理特性，如殺菌、抗氧化和抗過敏活性[8]；諾卡酮具有通過TLR4/NF-κB/NLRP3通路抑制神經炎癥而發揮神經保護和改善認知功能障礙的作用[9]。最近研究[10]報道諾卡酮具有通過激活Keap1/Nrf2/HO-1抗氧化途徑而發揮抗肝損傷誘導的抑郁和焦慮的活性。因此，該研究在CUS所誘導的小鼠抑郁模型上驗證了諾卡酮的抗抑郁活性。結果顯示，諾卡酮具有明顯的抗抑郁作用，與以前的報道一致[11]，表明諾卡酮對多種方式導致的抑郁癥均有治療作用。

BDNF是腦內一種非常重要的神經營養因子，具有廣泛的神經保護和再生的作用[12]，是抑郁癥發病和治療的重要標志蛋白[13]。該研究結果顯示，諾卡酮可以明顯改善CUS誘導的抑郁表型的同時，也明顯改善了CUS誘導的BDNF表達降低，表明BDNF可能在諾卡酮的抗抑郁活性中發揮重要作用。研究[14]表明抑郁癥的發病和一些抗抑郁作用均涉及到PKA/CREB通路的調控，并且PKA/CREB通路具有明顯的調控BDNF表達的活性；該研究進一步評價了諾卡酮對PKA/CREB通路的影響，結果顯示諾卡酮可以顯著增加CUS導致的PKA和p-CREB表達的降低，提示PKA/CREB通路可能參與了諾卡酮對BDNF表達的調控作用。

情緒的掌控主要由海馬腦區負責，同時研究[15]證明哺乳動物的海馬腦區中存在一個最獨特的現象，即整個生命過程中都可以有神經再生。而神經再生在抑郁癥的發病機制中起著重要作用，是應對壓力應激的關鍵修復反應。DCX僅出現于神經元形成的前3周，是未成熟神經元的可靠標記。研究[15]表明DCX陽性神經元主要存在于海馬齒狀回腦區中，CA1、CA3中沒有DCX信號，即神經再生主要發生在海馬齒狀回腦區，而在CA1、CA3中較少，因此主要通過檢測海馬齒狀回的DCX陽性神經元來判斷神經再生的情況。該研究表明CUS可導致海馬齒狀回神經再生障礙，而諾卡酮可以改善海馬齒狀回的神經再生，說明諾卡酮可能通過改善神經再生而發揮抗抑郁作用。

綜上所述，該研究表明諾卡酮可能通過增加海馬齒狀回神經再生及激活PKA/CREB通路增加BDNF的表達而發揮抗抑郁活性。諾卡酮可作為抗抑郁藥物研究的新的候選化合物，該研究為新的抗抑郁藥物開發奠定了基礎。