SD大鼠外傷性特納牙模型建立及微觀結構觀察

高 黎，郭 姍，李藝博， 盧麗雯，張彥喜

特納牙是指由局部感染和創傷引起的牙齒釉質發育不全，好發于前磨牙。近年來，個別前牙尤其上頜切牙顏色或形態改變在臨床上比較常見，主要表現為前牙釉質表面呈黃色至棕黃色改變，多位于上前牙唇面切1/3至中1/3，黃染區域與正常釉質交界清晰，形狀不規則，嚴重者釉質表面或可出現明顯缺損。這種前牙釉質顏色和形態改變，影響患者美觀及心理。其表現為典型的特納牙，但在臨床上常被誤認為氟斑牙。該研究通過對SD大鼠下頜前牙區牙槽突垂直黏膜施加外力，建立外傷性特納牙大鼠模型，觀察外傷性釉質發育不全的臨床表現，并進行微觀結構觀察和能譜分析(energy dispersive spectrometry，EDS)，研究前牙區外傷是否出現特納牙性釉質發育不全，為后期研究大鼠特納牙和氟斑牙的相關區別提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料及設備一次性口腔器械盒，眼科剪，鑷子，持針器，手術刀及手術刀柄，木棒(一端接觸面積2.5 mm×2.0 mm)，0.9%氯化鈉溶液，蒸餾水；0～20牛(N)彈簧秤(昆山托普泰克公司)；游標卡尺(上海美耐特公司)；Nikon相機(日本尼康公司)；掃描電子顯微鏡(scanning electronic microscopes，SEM)、EDS能譜分析儀(德國ZEISS公司)。

1.2 實驗動物與分組鄭州大學動物實驗室提供的40只1 d齡SD大鼠作為受試對象，隨機分為四組(性別、體質量差異無統計學意義)，即對照組和3個實驗組，每組10只；實驗組依據施力分為5N力組、10N力組、15N力組。

1.3 實驗方法對照組不做任何處理；實驗組在大鼠下前牙區垂直于黏膜加力(圖1)，施力工具是木棒柱形壓力裝置，木棒一端與牙槽突接觸，接觸面積2.5 mm×2.0 mm；另一端與彈簧秤相連，分別施加5、10、15 N力(圖2)，在彈簧秤刻度的5、10、15、20 N處設置明顯標記。在瞬間施力時，在彈簧秤示數達到所需要的最大力值時即停止施力。相同條件下飼養，觀察下頜切牙的生長狀況。SD大鼠在出生后30 d，下頜第一磨牙牙根發育基本完成，咬合關系穩定，此時引頸處死大鼠。剝離下頜骨下切牙段，0.9%氯化鈉溶液、蒸餾水反復沖洗干凈。

圖1 受力示意圖

圖2 施力圖A:5N力組；B:10N力組；C:15N力組

1.4 記錄標準牙體唇面釉質出現變色，表面光滑、完整，記錄為釉質變色；牙體唇面釉質出現粗糙、凹坑狀、缺損，即記錄為釉質缺損；釉質缺損和釉質變色同時出現，則記為釉質缺損。

1.5 SEM觀察及鈣磷分析選取實驗組釉質發育不全區域與對照組相對應的釉質正常區域，制成實驗所需的釉質塊，放入無水乙醇中超聲震蕩清洗5 min，然后將樣本干燥處理，用導電膠固定在載物臺上，放入真空鍍膜機中，用SEM對牙釉質表面結構進行觀察，并檢測牙釉質表面鈣(Ca)磷(P)元素含量的質量分數。

1.6 統計學處理應用SPSS 17.0軟件進行數據錄入和統計分析，采用χ2檢驗對四組SD大鼠下頜切牙的正常牙數和釉質不全數及對10N力組和15N力組未萌牙數進行差異性比較，檢驗水準為雙側α=0.05；組間兩兩比較采用Bonferroni法，檢驗水準為α=0.008。對實驗組發育不全的牙釉質與對照組正常牙釉質Ca、P含量采用兩獨立樣本t檢驗進行比較。

2 結果

2.1 不同組外傷后一般情況在實驗過程中，實驗動物創面愈合良好，未發生感染和死亡。對照組SD大鼠下頜切牙區黏膜紅潤；5N力組SD大鼠受力部位黏膜有輕微的紅色壓痕；10N力組受力部位黏膜大部分有深的壓痕，有黏膜下血斑形成，有5例穿破黏膜，出血，但未刺破骨皮質；15N力組受力部位黏膜穿破10例，出血，但均未穿破其下頜骨皮質。

2.2 30 d齡SD大鼠下頜切牙各個標準大體表現釉質正常：牙齒表面光滑無缺損，顏色均勻，呈淡黃色,透明度好(圖3)。釉質著色：主要表現為白斑，表面光滑，完整，透明度降低(圖4)。釉質缺損：釉質表面粗糙出現凹坑狀缺損(圖5)。牙齒未萌：牙齒未完全萌出(圖6)。

圖3 釉質正常牙齒A：下頜切牙大體觀 B：下頜切牙冠狀面觀

圖4 牙齒釉質白色斑塊A：下頜切牙大體觀 B：下頜切牙矢狀面觀 C：下頜切牙冠狀面觀

圖5 牙齒釉質缺損A：下頜切牙大體觀 B：下頜切牙矢狀面觀 C：下頜切牙冠狀面觀

圖6 下頜切牙單個牙萌出A、B：下頜切牙大體觀

2.3 四組30 d齡SD大鼠下頜切牙發育情況對照組、5N力組、10N力組、15N力組四組SD大鼠釉質正常牙數和釉質發育不全牙數差異有統計學意義(χ2=50.402，P< 0.05)；四組之間兩兩比較，除外對照組與5N力組(χ2=2.105，P= 0.147)、10N力組與15N力組(χ2=1.111，P=0.496)，其余各組間比較P值均<0.008。10N力組(1/19)和15N力組(7/13)間未萌牙數/已萌牙數差異有統計學意義(χ2=5.625，P=0.018)。見表1。

表1 四組30 d齡SD大鼠下頜切牙發育情況(n)

2.4 SEM觀察結果使用SEM觀察，結果顯示：對照組正常釉質表面平整光滑；實驗組釉質變色區表面不平整，部分呈凹坑狀；釉質缺損區表面粗糙，部分區域呈剝脫狀。見圖7。

圖7 SEM下的不同釉質區域

2.5 EDS測量實驗組及對照組樣本Ca、P含量及鈣磷比(Ca/P)與對照組釉質正常區相比，實驗組釉質異常區鈣含量較低(P<0.05)，磷含量亦較低(P<0.05)，差異有統計學意義。鈣磷比(P=0.79)差異無統計學意義。見表2。

表2 外傷牙釉質異常區與對照組釉質正常區Ca和P的質量分數

3 討論

氟斑牙依據其臨床表現分為四種不同類型：釉質變色(Ⅰ型)，釉質異常聚結(Ⅱ型)，部分釉質缺損型(Ⅲ型)，Ⅰ、Ⅱ或Ⅲ組合型(Ⅳ型)[1]。釉質外觀上氟斑牙與特納牙的表現相似，臨床上診斷易混淆，常需結合病史才能加以鑒別，從多方面進行區別研究十分重要。關于外傷性特納牙，有學者通過實驗動物建模的方法探討牙胚外傷造成釉質發育不全的機理，猴和犬因牙齒生理解剖結構與人類相似可作為外傷性特納牙建模的理想動物模型。Thylstrup et al[2]曾用猴來建立乳牙外傷模型研究對繼承恒牙胚的影響，取得較好效果。本研究組前期也通過挫入犬乳牙研究對繼承恒牙胚的影響，結果顯示繼承恒牙釉質發育不全發生率達到85.4 %，主要表現為釉質著色和缺損[3]。文獻中未見報道大鼠牙外傷模型；若同時研究氟斑牙與特納牙的相關區別，大鼠是更為理想的建模動物。嚙齒類動物的切牙唇側釉質與人牙釉質結構類似[4]，其牙釉質結構從內到外大致可分為四層：內層無釉柱結構層、釉柱交錯結構層、釉柱平行排列結構層、表面無釉柱結構層[5-6]。另外，SD大鼠牙胚發育每個階段界限明確：出生1 d牙胚處于鐘狀末期，此時牙源性細胞特異性分化和礦化組織開始形成[7]。出生2 d牙胚進入分泌早期，牙釉質及牙本質大量形成[8]。如果牙胚在分泌期及之前受到外傷，之后的釉質發育就可能會受到影響[9]。因此，本實驗選用1 d齡SD大鼠建立外傷性特納牙模型。

趙繼剛 等[10]通過以25 mm2的接觸面對犬暴露恒牙牙胚施加3 kg的壓力時，出現牙齒顏色的改變。因為1 d齡的SD大鼠下頜牙槽嵴尚未形成，骨壁較薄，直接在牙槽骨上施力即可傳導至牙胚上，影響牙胚發育[11]。因此，本實驗選擇在下前牙區沿牙槽突長軸垂直黏膜施力來進行預實驗。在實驗前對SD大鼠進行施力大小測試，施加5 N的力時，小鼠下頜骨受力部位黏膜出現輕微紅色壓痕；在施加15 N的力時，壓力頭可以穿透下頜黏膜但未穿破牙槽骨；當施加20 N時，壓力頭可輕松穿破黏膜及牙槽骨，術后SD大鼠表現痛苦且影響進食，這會對實驗建模準確性造成影響故此力值予以舍棄。因此，本研究選取力值大小為0、5、10、15 N。由于牙胚外傷是由口腔頜面部創傷引起，一般受的力是瞬時力，因此，本實驗也選擇瞬時力。在彈簧秤刻度的5、10、15 N處設置明顯標記,在快速施力時，在彈簧秤示數達到所需要的最大力值時即停止施力。本實驗中，5 N力組僅有2例出現釉質變色，發生率較低(10 %)，且未見釉質缺損，不適合建立牙胚外傷模型。通過比較10 N力組與15 N力組中均出現釉質發育不全(釉質變色和缺損)，兩組均可以建立外傷性特納牙模型，但15 N力組牙齒未萌數明顯高于10 N力組。因此，10 N力更適合建立SD大鼠外傷性特納牙模型。

本實驗在掃描電鏡下觀察到實驗組釉質變色區域表面粗糙不平，釉質缺損區釉質孔隙增多，表層釉質結構缺失，裸露內層釉質。這一結果說明了牙胚外傷可明顯導致釉質表層結構的改變。而未萌牙的出現則是牙胚外傷所造成更嚴重的后果，可能是外力使牙胚破損[12],牙胚死亡停止發育或牙胚發生移位導致了牙齒萌出障礙。本實驗中釉質變色主要表現為鼠牙齒表面的白堊色斑塊，可能是外傷擾亂了釉質形成的正常程序，導致不正常基質蛋白復合物的形成，過多的釉原蛋白潴留在牙釉質中，改變了釉質的結構，從而改變釉質的光學性質[13-14]。釉質主要成分是無機物質-羥基磷灰石。鈣磷含量一定程度上反應了釉質的礦化程度及再礦化能力[15]。本研究通過能譜分析顯示釉質發育不全區鈣磷含量均較正常區域低，推測可能是釉質發育不全區域的釉質出現結構紊亂，部分缺損導致無機物質減少。牙釉質異常區與正常區相比，鈣磷比無統計學差異，進一步說明了外傷性特納牙不同于遺傳性釉質發育不全，其對釉質形成的主要影響在于釉質的量而不是釉質的礦化成分。

本實驗表明5 mm2受力面施加力10 N適合建立大鼠外傷性特納牙模型。通過微觀結構分析，外傷性特納牙釉質的量減少，表面粗糙，凹凸不平，鈣磷含量減少。