不同大麥籽粒γ-氨基丁酸含量的差異及環境影響

張紫晉，任益明，江 迪，楊 婷，粟永英，鐘志明，陳 靜

(1.中國科學院成都生物研究所, 成都 610041；2.中國科學院地理科學與資源研究所，北京 100101)

【研究意義】γ-氨基丁酸( γ-aminobutyric acid，GABA)是一種非蛋白質、功能性氨基酸，廣泛分布于微生物和動植物體內的天然活性成分[1]。GABA僅存在于動物體內的神經組織，作為哺乳動物中樞神經系統中的抑制性神經遞質，參與重要的腦循環生理活動，具有改善腦機能、增強記憶、抗焦慮等生理功能，同時具有抗心律失常、促進乙醇代謝、降低血壓、預防肥胖、防止動脈硬化和改善糖尿病患者生理狀況等功效[2-3]。隨著年齡的增長和精神壓力的增加，人體內GABA積累異常困難，需要從外界攝入一定量的GABA以滿足機體的需要，富含GABA的谷物和豆類食品是理想的GABA膳食補充來源[4-6]。因此，開展谷物GABA的基因型和環境影響研究對于富含GABA的功能原料作物種植區劃和品種培育具有重要意義。【前人研究進展】谷物γ-氨基丁酸的研究主要集中在水稻、玉米和大麥γ-氨基丁酸的富集培養及功能食品開發方面[7-9]。在冷激、熱激、低氧、干旱等脅迫環境下，發芽籽粒GABA的含量顯著增加，低溫和低氧條件下谷物發芽是富集GABA的常用手段，研究人員因此開發了系列功能食品和飲料[10]。姚森等[11]發現水稻品種間GABA含量變異較大，平均GABA含量早稻品種高于晚稻，不同光溫生態類型發芽糙米GABA的含量差異可能與水稻的品種特性和生育期內的光照、氣溫等環境條件有關。Makoto等[9]發現大麥發芽籽粒GABA含量顯著高于水稻發芽籽粒，可成為γ-氨基丁酸的優質原料。趙大偉、曹彬等[12-13]分別對大麥品種類型、籽粒顏色與籽粒GABA含量差異進行了分析，發現裸大麥GABA含量高于皮大麥，籽粒GABA含量和籽粒顏色存在顯著相關性，由于試驗過程中的代表性供試材料數量不足，上述研究結果尚需進一步驗證，而關于種植環境對大麥籽粒GABA含量影響的研究鮮有報道。【本研究切入點】大麥是重要的“藥食同源”作物，尤其青藏高原裸大麥(亦稱青稞)作為藏區人民的主糧，富含蛋白質、膳食纖維、維生素、花青素等營養健康成份，是高附加值食品或保健品開發的重要原料[14]。大多數品質性狀，如籽粒蛋白質、淀粉組成、黃酮等功能成份，是受不同基因型，環境條件以及生長發育階段影響的復雜性狀[15]，目前缺少大麥基因型和環境條件與籽粒GABA含量差異的系統研究，以及對富含GABA優良品種資源的挖掘利用?！緮M解決的關鍵問題】本研究通過多點田間栽培試驗，對大麥不同基因型、不同種植環境與籽粒γ-氨基丁酸含量的相關性進行評價，鑒定篩選優良種質資源，從而為GABA高含量的優質專用大麥種植規劃和新品種培育提供科學依據和物質材料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗供試材料為358份栽培大麥品種，包含267份裸大麥和91份皮大麥材料，其中不同粒色裸大麥及份數見表1。2017—2019年將供試材料種植于四川什邡(104°09′E、31°10′N，海拔500 m，灌漿期氣溫21～28 ℃，降雨量281.7～327.5 mm)。2019—2020年，從什邡收獲的材料中選取46份淺粒色(黃/白色)裸大麥和58份深粒色裸大麥，繼續種植于云南元謀(101°35′～102°06′E、25°23′～26°06′N，海拔1100 m，灌漿期氣溫20～30 ℃，降雨量214.6～227.8 mm)和西藏拉薩(91°06′E，29°36′N，海拔3650 m，灌漿期氣溫12～24 ℃，降雨量302.2～344.7 mm)，進一步了解種植環境對大麥籽粒GABA累積的影響。3個環境點種植，每一材料種植2行，行長1.5 m，行距0.25 m，株距3～5 cm。供試材料按隨機區組排列，3次重復。采用當地常規水肥(底肥復合肥30～40 kg/667 m2，追施尿素5～15 kg/667 m2)及田間管理，于大麥完熟期收獲種子。

表1 供試大麥材料分組及GABA含量

1.2 試驗方法

1.2.1 GABA標準曲線繪制 參考Tojiro等[16]的比色方法，稍作改動。稱取10 mg GABA標準品，加入10 mL蒸餾水配制成1.0 mg/mL GABA標準溶液。用移液槍吸取0.00、0.05、0.10、0.15、0.20和0.25 mL標準溶液于10 mL的帶蓋試管內，并分別加入蒸餾水1.00、0.95、0.90、0.85、0.80、0.75 mL使每管溶液最終體積達到1 mL，得到不同濃度梯度的GABA標準溶液。向GABA標準溶液中依次加入0.2 mol/L硼酸鹽緩沖液(pH 9.0) 0.6 mL、5%苯酚溶液2 mL、7%次氯酸鈉溶液1 mL，搖勻后沸水浴加熱5～10 min，直到顏色變成藍綠色，放入冰浴冷卻至室溫，最后加入60%的乙醇2 mL搖勻靜置。在波長645 nm處測定溶液的吸光度。以吸光度為橫坐標，GABA含量為縱坐標，繪制標準曲線。

1.2.2 γ-氨基丁酸的提取及含量測定 將樣品籽粒于70 ℃烘干后粉碎，過400目篩備用。準確稱取150 mg面粉置于2 mL離心管中，加入1.5 mL蒸餾水于MIX-25P迷你混合儀上震蕩浸提4 h。12 000 r/min離心5 min，取1 mL上清液于10 mL的帶塞試管內，按照1.2.1方法顯色反應后在645 nm下測吸光值，通過標準曲線計算出樣品GABA的含量。

1.3 數據處理分析

采用Excel 2007進行試驗數據整理和圖表制作，利用SPSS 11.5軟件進行統計分析， LSD方法對各樣本平均數進行差異顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1 標準曲線

將不同濃度梯度的GABA標準溶液，經顯色反應后于室溫下645 nm波長處測定吸光度(圖1)。結果發現，GABA含量(y)與645 nm處吸光度(x)具有以下線性關系：y=0.0965x-0.0001，其R2=0.9989，表明該方法準確可靠，可用于供試材料的GABA含量測定。

圖1 GABA標準曲線

2.2 大麥品種間籽粒GABA含量的差異

什邡種植點358份供試材料的籽粒GABA含量變異幅度較大(0.062～1.038 mg/g)，平均值為0.552±0.176，大部分材料GABA含量位于0.45～0.66 mg/g，占總量的61%，表現為數量性狀的正態分布特點(圖2)。如表1所示，裸大麥平均GABA含量為(0.574±0.173)mg/g(變異幅度0.215～1.038 mg/g)，皮大麥平均GABA含量為(0.488±0.169)mg/g(變異幅度0.062～1.014 mg/g)，前者GABA含量極顯著高于后者(P<0.01)。根據籽粒顏色，將裸大麥材料劃分為黃/白粒、蘭粒、紫粒和黑粒4組，每組對應的平均GABA含量高低順序為紫粒>黑粒>蘭粒>黃/白粒，其值分別為(0.618±0.179)、(0.593±0.192)、(0.580±0.166)、(0.537±0.149)mg/g，表明籽粒顏色越深GABA含量越高，其中紫粒GABA含量極顯著高于黃/白粒，而蘭粒與黑粒差異不顯著。

圖2 不同大麥品種(系)GABA含量分布(什邡)

2.3 不同種植環境下裸大麥GABA含量的變化特征

從供試材料中選取46份淺粒色(黃/白色)裸大麥和58份深粒色裸大麥，在地理位置相近但海拔差距極大的四川什邡、云南元謀和西藏拉薩3個地點繼續種植。從圖3可以看出，同一批供試材料在不同種植地點的GABA含量集中分布范圍不一樣，在四川、云南和西藏種植點大多數材料的GABA含量范圍分別為0.4～0.69、0.7～0.89和0.8～0.99 mg/g，而且GABA高含量(≥1.0 mg/g)的材料在四川僅有2份，而云南有27份，西藏達到32份，表明種植地點海拔高度對大麥籽粒GABA含量有正向促進作用。如圖4所示，裸大麥淺粒色組平均GABA含量分別為(0.496±0.133)、(0.765±0.191)和(0.907±0.259)mg/g，深粒色組平均GABA含量分別為(0.603±0.179)、(0.864±0.231)和(0.917±0.312)mg/g。統計學分析表明，供試材料3個種植點的平均GABA含量隨海拔高度增加明顯提高，含量高低順序為：西藏拉薩>云南元謀>四川什邡。其中淺粒色組GABA含量變化與總體趨勢一致，表現為隨環境海拔升高含量增加，且差異均達顯著水平；深粒色組GABA含量也表現出隨海拔升高含量增加的變化趨勢，而云南與西藏2個環境點之間差異未達到顯著水平。進一步分析發現，在四川和云南2個種植地點，深粒色組平均GABA含量均顯著高于淺粒色組，分別高出21.73%和12.91%，而在西藏種植點2個粒色組之間沒有差異，表明在相對低海拔的區域，裸大麥GABA含量受籽粒顏色的影響較大，而在高海拔地區受海拔高度的影響更顯著。上述結果表明，大麥(青稞)籽粒GABA含量是受遺傳控制和環境強烈影響的復雜數量性狀。值得一提的是，通過2年的重復試驗，我們從平均GABA含量>0.8 mg/g的材料中篩選到4份材料表現出較好的環境穩定性，其GABA含量在不同環境點之間差異不大(表2)。

圖3 3個環境種植點裸大麥GABA含量分布

圖4 3個環境種植點裸大麥平均GABA含量

表2 環境穩定GABA含量較高的大麥品種

3 討 論

γ-氨基丁酸廣泛存在于各種植物及其不同組織中，擔任著代謝物質和信號分子的雙重角色，參與了植物的pH調節、能源物質調節、C/N平衡調節以及防御系統調節，在植物生長發育過程中起著重要的生物學保護功能[17-19]。相關研究表明，低溫、低氧等環境脅迫能顯著增加發芽谷物GABA含量[20]，大麥和小麥耐低溫冷害脅迫能力與GABA含量密切相關，耐寒品種GABA含量顯著高于不耐寒品種[21]。施用外源GABA能提高植物抗氧化防護酶活性，有效緩解酸性土壤中鋁離子對根系帶來的氧化傷害，通過增加脯氨酸和酚類等物質的含量，以及提高植物抗氧化系統能力從而增強其鹽脅迫耐性[22-24]。與前人研究結果一致[12-13]，本研究供試大麥不同基因型間GABA含量變異較大，且裸大麥顯著高于皮大麥，深色籽粒高于淺色籽粒。以谷氨酸或谷氨酸鹽為底物的谷氨酸脫羧酶催化作用是GABA合成的主要途徑，本研究證實大麥籽粒GABA含量與籽粒顏色密切相關，表明GABA合成途徑可能與粒色相關的代謝途徑存在交叉作用。進一步研究發現，總體上海拔高度對兩組粒色裸大麥的GABA含量有明顯的正向促進作用。在海拔相對較低的四川、云南種植點，深粒色組平均GABA含量顯著高于淺粒色組，表明籽粒顏色對GABA含量的影響較大。隨著環境海拔升高，在西藏種植點深粒色組GABA含量增幅較小，而淺粒色組增幅顯著且幾乎等同于深粒色組，表明在高海拔環境下海拔高度是影響大麥GABA含量的主要環境因子，而籽粒顏色對GABA含量的影響減弱甚至消失。因此，高原農區獨特的自然環境條件有利于大麥籽粒GABA的累積，這為優質專用大麥種植區劃和產業發展提供了科學依據。

籽粒GABA含量不僅受種子發育階段溫、光、水等環境條件的影響，還受到復雜遺傳系統的控制。生物體內GABA的合成途徑主要來自GABA支路[26]，即谷氨酸經限速酶谷氨酸脫羧酶(Glutamate decarboxylase, GAD)催化脫去α位上的羧基形成GABA。水稻不同品種發芽糙米GABA生成量與GAD的酶活性呈極顯著正相關[11]，本研究發現大麥品種間GABA含量還與GAD基因表達水平相關(未發表數據)。本試驗鑒定篩選到的GABA含量高且受環境影響小的大麥材料，為后續開展高GABA含量的大麥新品種培育及分子機制研究提供了重要的資源材料。

4 結 論

采用比色方法，對在什邡、元謀和拉薩不同地點種植的358份大麥材料籽粒γ-氨基丁酸含量進行了檢測與分析。研究發現，大麥不同基因型之間GABA含量差異較大，裸大麥GABA含量顯著高于皮大麥。在相對低海拔的環境下籽粒顏色與GABA含量密切相關，海拔高度對GABA含量有正向促進作用，是高海拔環境下影響籽粒GABA含量的主要環境因子。大麥(青稞)籽粒GABA含量是受遺傳控制和環境強烈影響的復雜數量性狀，同時鑒定篩選到4份環境表現穩定的GABA高含量資源材料。研究結果為優質專用大麥品種培育和種植區劃提供理論依據和物質材料。