右美托咪定預處理調控PINK1/Parkin通路對H9C2細胞缺氧/復氧損傷線粒體自噬的影響

吳華兵

缺血性心臟病是心血管疾病死亡的主要原因之一，占全部心臟病死亡的50%左右。心肌缺血/缺氧是心臟不能正常工作的一種病理狀態(tài)，由心臟血流灌注減少，導致供氧減少，使得心肌能量代謝異常所致[1-2]。目前，缺血性心臟病的主要治療手段是血流再灌注，而研究表明，血流再灌注治療可導致心肌出現(xiàn)血流再灌注損傷，主要表現(xiàn)為心肌細胞氧化應激損傷，損害心臟功能[3]。因此，探尋有效的預防心肌再灌注損傷的藥物是臨床研究熱點。右美托咪定是一種α2-腎上腺素受體激動劑，研究顯示，其對心肌具有保護作用[4]。羅敏等[5]研究顯示，右美托咪定可抑制心肌缺血再灌注模型大鼠心肌細胞凋亡，減少心肌梗死面積，進而緩解心肌損傷。鄒田田等[6]研究顯示，右美托咪定可通過穩(wěn)定線粒體膜電位抑制高糖誘導的心肌H9C2細胞線粒體損傷及細胞凋亡。線粒體自噬是細胞清除受損線粒體的過程，研究表明，線粒體自噬功能障礙與心肌缺血再灌注氧化應激損傷有關[7]。目前，有關右美托咪定減輕心肌缺血再灌注損傷的機制尚未明確，因此，本研究以右美托咪定干預缺氧/復氧(hypoxia/reoxygenation，H/R)條件下的心肌細胞，觀察其對心肌細胞內(nèi)線粒體自噬的影響，為明確右美托咪定的心肌保護作用提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器 大鼠心肌細胞系H9C2細胞株(bio-73030)購自北京百歐博偉生物技術有限公司；DMEM培養(yǎng)基(CDLG-3719)、3-2(4，5-二甲基噻唑-2)-2-四甲基偶氮噻唑藍(MTT)購自美國Sigma公司；JC-1熒光探針線粒體膜電位檢測試劑盒(J8030)、超氧化物歧化酶(superoxide orgotein dismutase，SOD)活性檢測試劑盒、丙二醛(malonaldehyde，MDA)含量檢測試劑盒均購自南京建成生物研究所；活性氧(reactive oxygen species，ROS)含量測定試劑盒購自上海前塵生物科技有限公司；蛋白提取試劑盒(BC3710-100T)購自上海吉至生化科技有限公司；兔抗微管相關蛋白輕鏈3(microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3)、家蠶隔離體蛋白1(p62)抗體(H00008650-A01)、PTEN誘導激酶1(PTEN induced kinase 1，PINK1)抗體(FNab09992)、E3泛素連接酶(E3 ubiquitin ligase，Parkin)抗體(bs-1865R)、β-actin抗體(ATA40114)、山羊抗兔HRP(SE12-0.1)二抗均購自北京索萊寶科技有限公司。CO2培養(yǎng)箱(型號NHD DYE1738)購自日本Sanyo公司；Elx800酶標儀(型號HSG9832)購自美國Thermo公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 取H9C2細胞解凍、復蘇，于含10%滅活胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)及1%鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基、37 ℃、5%CO2、95%O2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2 d或3 d換液1次，無菌操作，傳代培養(yǎng)。

1.2.2 H/R細胞模型的建立 實驗時棄去細胞培養(yǎng)基，更換飽和的模擬缺氧液，將細胞置于缺氧盒中持續(xù)通入95%N2、5%CO2的混合氣體37 ℃下缺氧3 h，棄去缺氧液，更換飽和的模擬復氧液，持續(xù)通入95%O2、5%CO2的混合氣體37 ℃下復氧3 h[8]。

1.2.3 細胞分組及處理 取1.2.1制備的對數(shù)生長期的H9C2細胞重懸并接種至24孔板(2.5×105個/孔)上，隨機分成5組。空白對照組：只含H9C2細胞，在37 ℃、5%CO2、95%O2培養(yǎng)箱中以無FBS的培養(yǎng)基正常培養(yǎng)細胞48 h；H/R組：依據(jù)1.2.2操作后，更換為正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h；右美托咪定低劑量組、中劑量組、高劑量組：H/R處理前分別加入0.1 μmol/L、1.0 μmol/L、10.0 μmol/L右美托咪定溶液預處理[9]，后更換為正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.2.4 MTT法檢測各組H9C2細胞增殖能力 取1.2.3各組培養(yǎng)48 h的H9C2細胞重懸并接種至24孔板(2.5×105個/孔)繼續(xù)培養(yǎng)48 h，各孔加MTT 20 μL(5 g/L)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，加入150 μL二甲基亞砜(DMSO)，振蕩、溶解。在酶標儀490 nm處測定各孔細胞光密度(optic density，OD)，重復3次，取平均值。細胞增殖抑制率(%)=(空白對照組OD-實驗組OD)/空白對照組OD×100%。

1.2.5 H9C2細胞氧化應激水平檢測 取1.2.3各組培養(yǎng)48 h的H9C2細胞，重懸并接種至24孔板(2.5×105個/孔)。收集各組培養(yǎng)上清液或細胞，分別采用SOD活性檢測試劑盒、MDA含量檢測試劑盒、ROS含量測定試劑盒檢測培養(yǎng)上清液SOD活性、MDA含量及細胞ROS水平變化。

1.2.6 透射電鏡下觀察細胞自噬體 收集1.2.3各組培養(yǎng)48 h的H9C2細胞，重懸并接種至24孔板(2.5×105個/孔)，胰酶消化(0.25%)，細胞密度達70%～80%時刮取細胞，離心10 min，細胞沉淀采用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)清洗，2.5%戊二酸醛固定，4 ℃冰箱保存過夜，50%乙醇常規(guī)脫水，環(huán)氧樹脂包埋，60 ℃聚合48 h，切片(厚度80 nm)，枸櫞酸鉛染色，置于透射電鏡下觀察細胞中自噬體，采用Image Pro Plus 6.0圖像分析軟件檢測。

1.2.7 JC-1法檢測線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential，MMP) 取1.2.3各組培養(yǎng)48 h的H9C2細胞，重懸并接種至24孔板(2.5×105個/孔)。參照試劑盒說明書配制JC-1染色工作液、緩沖液，并向細胞中加入JC-1染色工作液(0.5 mL)混勻，37 ℃孵育15 min后，離心，棄上清，用JC-1染色緩沖液沖洗，后加入JC-1染色緩沖液(500 μL)重懸，接種至24孔板(2.5×105個/孔)，立即采用多功能酶標儀檢測熒光強度。檢測JC-1單體時(低膜電位下以單體形式存在)激發(fā)光設置為490 nm，發(fā)射光設置為530 nm，呈綠色熒光；檢測JC-1聚合物時(高膜電位下以聚合物形式存在)激發(fā)光設置為530 nm，發(fā)射光設置為590 nm，呈紅色熒光。MMP(%)=紅色熒光強度/綠色熒光強度×100%。

1.2.8 免疫印跡法檢測自噬、PINK1/Parkin通路相關蛋白表達情況 收集1.2.3各組培養(yǎng)48 h的H9C2細胞，以RIPA裂解并提取總蛋白，檢測濃度及純度，行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，轉膜，放入脫脂奶粉(5%)溶液室溫封閉2 h，分別加入一抗LC-3、p62、PINK1、Parkin及內(nèi)參β-actin，均為1∶500的稀釋比，4 ℃過夜，加入HRP標記山羊抗兔二抗(1∶1 000)，室溫孵育1 h，顯影、定影，分析各蛋白含量。

2 結 果

2.1 各組H9C2細胞增殖情況比較 與空白對照組比較，H/R組H9C2細胞增殖抑制率明顯升高(P<0.05)；與H/R組比較，右美托咪定低劑量組、中劑量組、高劑量組H9C2細胞增殖抑制率均明顯降低(P<0.05)，呈劑量依賴性。詳見表1。

表1 各組H9C2細胞增殖抑制率比較(±s，n=6)

2.2 各組H9C2細胞氧化應激水平比較 與空白對照組比較，H/R組H9C2細胞SOD活性明顯降低(P<0.05)，MDA含量、ROS水平明顯升高(P<0.05)；與H/R組比較，右美托咪定低劑量組、中劑量組、高劑量組H9C2細胞SOD活性明顯升高(P<0.05)，MDA含量、ROS水平明顯降低(P<0.05)，呈劑量依賴性。詳見表2。

表2 各組H9C2細胞氧化應激水平比較(±s，n=6)

2.3 透射電鏡下觀察線粒體自噬結果 與空白對照組比較，H/R組H9C2細胞自噬小體數(shù)量明顯增多；與H/R組比較，右美托咪定低劑量組、中劑量組、高劑量組H9C2細胞自噬小體數(shù)量明顯減少，呈劑量依賴性。詳見圖1。

圖1 各組H9C2細胞線粒體自噬情況比較(標尺：2 μm，×8 000)

2.4 各組H9C2細胞MMP比較 JC-1法檢測結果顯示，與空白對照組比較，H/R組H9C2細胞MMP水平明顯降低(P<0.05)；與H/R組比較，右美托咪定低劑量組、中劑量組、高劑量組心肌H9C2細胞MMP水平明顯升高(P<0.05)，呈劑量依賴性。詳見圖2、表3。

圖2 各組H9C2細胞JC-1染色(×200)

表3 各組H9C2細胞MMP 比較(±s，n=6) 單位：%

2.5 各組H9C2細胞自噬相關蛋白表達變化 與空白對照組比較，H/R組H9C2細胞LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值升高(P<0.05)，p62蛋白表達明顯降低(P<0.05)；與H/R組比較，右美托咪定低劑量組、中劑量組、高劑量組心肌H9C2細胞LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值明顯降低(P<0.05)，p62蛋白表達明顯升高(P<0.05)，呈劑量依賴性。詳見圖3、表4。

圖3 各組H9C2細胞自噬相關蛋白表達條帶圖

表4 各組H9C2細胞自噬相關蛋白表達水平比較(±s，n=6)

2.6 各組H9C2細胞PINK1/Parkin信號通路蛋白表達比較 與空白對照組比較，H/R組H9C2細胞PINK1、Parkin蛋白表達明顯升高(P<0.05)；與H/R組比較，右美托咪定低劑量組、中劑量組、高劑量組心肌H9C2細胞PINK1、Parkin蛋白表達明顯降低(P<0.05)，呈劑量依賴性。詳見圖4、表5。

圖4 各組H9C2細胞PINK1、Parkin蛋白表達條帶圖

表5 各組H9C2細胞PINK1、Parkin蛋白表達比較(±s，n=6)

3 討 論

缺血性心臟病是國際公認的公共健康問題之一，心肌缺血/再灌注是其主要治療策略，然而缺血心肌在恢復血流灌注后極易引起缺血再灌注損傷，仍然是阻礙缺血性心臟病治療的一大難題[10]，因此，如何防治缺血再灌注損傷具有重要的現(xiàn)實意義。右美托咪定屬于高選擇性的α2腎上腺素能受體激動劑，是一種手術全身麻醉輔助藥，有鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、抗炎及抗氧化作用[11]。心肌細胞缺氧使得心肌細胞膜受損，再復氧時產(chǎn)生大量氧自由基，使細胞內(nèi)的抗氧化酶(如SOD)活性降低，導致ROS含量升高，引起脂質發(fā)生過氧化，破壞細胞結構，同時會生成大量MDA，導致細胞發(fā)生氧化應激從而損傷[12]。王茜等[13]研究顯示，右美托咪定能夠減輕缺血性心臟病病人體外循環(huán)瓣膜置換術中心肌缺血再灌注損傷。吳志林等[14]研究顯示，右美托咪定能夠抑制心肌缺血再灌注損傷模型大鼠心肌細胞氧化應激從而改善心肌缺血再灌注損傷。目前，有關右美托咪定對心肌細胞缺血再灌注損傷保護作用的機制尚未明確。研究表明，細胞氧化應激損傷在缺血再灌注誘導的線粒體自噬途徑中發(fā)揮重要作用，且適度自噬可促進細胞存活，過度自噬可誘導細胞凋亡[15]。因此，本研究建立H/R條件下體外培養(yǎng)的心肌H9C2細胞損傷模型，用右美托咪定進行干預，結果顯示，右美托咪定處理后，H/R引發(fā)的高增殖抑制率、MDA、ROS水平明顯降低，而SOD水平明顯升高，且呈一定劑量依賴性。說明右美托咪定可能促進H/R條件下H9C2細胞增殖，抑制細胞氧化應激，以緩解心肌損傷。

線粒體自噬是真核細胞通過自噬選擇性地將受損線粒體降解的過程，此過程中，線粒體膜包裹細胞內(nèi)需降解的多余或受損線粒體、蛋白質等成分形成自噬體，后者與溶酶體融合形成自噬溶酶體以降解自噬體中包裹的內(nèi)容物實現(xiàn)代謝需要及線粒體更新，調控細胞存活與凋亡[16]。近年來，研究表明，線粒體自噬異常與缺血性心臟病關系密切[17]。盧長青等[18]體外研究顯示，五味子乙素可能通過抑制心肌H9C2細胞線粒體自噬抑制細胞凋亡，進而保護小鼠心肌缺血再灌注損傷。線粒體產(chǎn)生能量時會將電化學勢能儲存于線粒體內(nèi)膜形成MMP，當線粒體受損時MMP降低是誘發(fā)線粒體自噬的重要因素[19]。LC-3、p62是自噬體形成的標志性蛋白，研究顯示自噬激活時LC-3可酶解部分多肽形成LC3-Ⅰ，后者與自噬泡表面磷脂乙酰醇胺結合形成LC3-Ⅱ，其含量多少可評價自噬強弱，而p62是自噬底物并可被LC3-Ⅱ降解，也用于評定自噬活性[20]。本研究結果顯示，與空白對照組比較，H/R組H9C2細胞MMP水平、p62蛋白表達均顯著降低，自噬小體數(shù)量、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值明顯升高，說明H/R條件下H9C2細胞線粒體自噬活性較大。當加入不同劑量右美托咪定處理后，H9C2細胞線粒體自噬體生成減少，線粒體自噬活性減弱，呈劑量依賴性。說明右美托咪定可能通過減弱H/R條件下H9C2細胞線粒體過度自噬保護細胞。

PINK1/Parkin通路是介導線粒體自噬的主要通路，PINK1是細胞線粒體外膜蛋白，正常情況下，其在外膜維持較低水平，當線粒體損傷時發(fā)生去極化，使PINK1大量聚集于線粒體外膜，并募集胞漿Parkin蛋白，促使Parkin蛋白轉移到線粒體上被磷酸化激活，促進線粒體自噬[21]。李想[22]研究顯示，栝樓薤白半夏湯能抑制PINK1/Parkin通路介導的線粒體自噬激活，從而保護缺血再灌注大鼠心臟。本研究結果顯示，與空白對照組比較，H/R組H9C2細胞PINK1、Parkin蛋白表達明顯升高，說明H/R條件下H9C2細胞PINK1/Parkin通路被激活。當加入不同劑量右美托咪定處理后，H9C2細胞PINK1/Parkin通路活化受抑制，且受抑制程度呈劑量依賴性。說明右美托咪定可能通過抑制PINK1/Parkin通路介導的H9C2細胞線粒體過度自噬，抑制細胞氧化應激損傷從而保護細胞。

綜上所述，右美托咪定可能通過抑制PINK1/Parkin通路介導的線粒體過度自噬，抑制H/R條件下細胞氧化應激損傷以保護細胞。由于細胞實驗具有一定局限性，后期將進一步開展動物實驗驗證H/R條件下右美托咪定對PINK1/Parkin通路介導的H9C2細胞線粒體自噬的影響，為臨床治療提供更可靠的依據(jù)。