負載抗菌肽的聚乳酸紡絲纖維體外藥物緩釋性能及抗菌性研究

謝寧，李慧，孫蕓蕓，張晗，朱憲春

(吉林大學口腔醫院正畸科，吉林 長春 130021)

阻生齒指已過萌出期卻在頜骨組織中未萌出的牙齒，上頜前牙阻生對面部美觀的影響較大且會影響咀嚼功能，這對患者的生活和心理健康等會造成負面影響[1]。目前，治療上頜骨內埋伏阻生齒最常用的方法是正畸-外科聯合治療[2]。而對于阻生位置較深的患者，需先行開窗減壓術來消除囊性病變，待其經術前設計的萌出通道自行萌出一段距離后再行助萌術[3]。同時，聚乳酸(PLLA)常被作為聚合物的基質或藥物載體等用于臨床實踐中[4]。并且，熔融紡絲技術是目前制備PLLA纖維最常用且較簡便的方法[5]，但作為一種植入材料，它疏水和非極性的表面特性不利于細胞黏附，且它本身并不具備抗菌性能，故需對其進行表面改性[6]。而抗菌肽(AMPs)具備較好的抗菌活性，可用于臨床治療[7]。其次，HHC-36因其最低抑菌濃度(MIC)比抗生素低，細胞毒性和最低紅細胞溶解度也非常低[8]，故可用于制備植入物涂層。本研究擬利用聚多巴胺(PDA)輔助抗菌肽結合至PLLA纖維制備一種具有持續穩定抗菌效果的改性材料，并研究其抗菌性及促細胞增殖潛能，以構建理想的創口填充材料。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

聚乳酸原材料(長春圣博瑪生物公司)，抗菌肽(HHC-36，KRWWKWWRR，95%純度，上海強耀生物公司)，丙酮(美國Sigma公司，179124)，無水乙醇(美國Sigma公司，459828)，三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(美國Sigma公司，159417)，胰蛋白酶(北京索萊寶公司，T1320)，胰蛋白胨大豆肉湯培養基(北京索萊寶公司，LA0110)，鹽酸多巴胺(上海阿拉丁試劑公司，D103111)，杜氏改良伊格爾培養基(美國Thermo公司，10567014)，胎牛血清(美國Thermo公司，10091)，金黃色葡萄球菌(中國科學院長春應化所，25923)，大腸桿菌(中國科學院長春應化所，8739)，成骨細胞(中國科學院長春應化所，MC3T3-E1)，細胞增殖檢測(CCK-8)試劑盒(上海碧云天生物公司，C0038)，青-鏈霉素(美國Sigma公司，V900929)，FITC(美國Sigma公司，FITC1)，DAPI(美國Sigma公司，10236276001)；X 射線光電子能譜分析儀(ESCALAB 250，美國Thermo公司)，多功能酶標儀(Infinite M200，瑞士Tecan公司)，掃描電子顯微鏡(XL-30，荷蘭Philips公司)，恒溫水箱(DK-420S，上海精宏公司)，真空干燥箱(D2F-6050，上海精宏公司)，水接觸角測定儀(VCA 2000，美國AST公司)，真空冷凍干燥機(FD-1C-50，北京博醫康公司)，微量移液器(Finnpipette F1，美國Thermo公司)，超低溫冰箱(TLE50086A，美國Thermo公司)，超聲波清洗儀(YL-040S，深圳語路公司)。

1.2 熔融紡絲法制備PLLA纖維

將干燥的PLLA顆粒加入到溫度比PLLA聚合物的熔融溫度高10 ℃的預熱加熱管中，并加熱10～15 min。隨后，通過加熱管頂部注入氮氣。當熔體均勻流出時，在紡絲噴嘴的下端加入熱空氣(450 ℃，高于聚合物的熔融溫度)，PLLA的熔化物被高速熱空氣拉長，熔化物到達金屬絲網收集器，此時即可得到PLLA纖維。

1.3 材料改性及分組

將PLLA纖維浸泡在聚多巴胺溶液(2 mg/mL)中，在低溫條件下避光反應24 h，后用去離子水浸泡沖洗原材料3次，每次5 min，直至將表面未結合的聚多巴胺去除，此時材料僅有聚多巴胺接枝，記為PLLA/PDA纖維。將HHC-36溶解在無水乙醇中，制備濃度為1.5 mg/mL的溶液，用移液槍吸取抗菌肽溶液滴至洗凈的PLLA/PDA纖維表面，使其潤濕材料，后置于真空干燥箱中在36.5 ℃下真空干燥20 min，此過程重復10次。最后用PBS溶液輕柔沖洗改性材料，將其表面未結合的抗菌肽洗去，置于冷凍干燥箱中干燥24 h，該組材料為聚多巴胺輔助接枝HHC-36材料組，記為PLLA/DH-36纖維。

1.4 性能表征

1.4.1 掃描電子顯微鏡檢測 使用掃描電子顯微鏡對PLLA纖維片、PLLA/PDA纖維片和PLLA/DH-36纖維片的表面形貌、尺寸進行觀察，確定抗菌肽成功接枝到聚乳酸紡絲纖維上，使用NIH Image J軟件分析材料纖維的直徑大小分布。

1.4.2 XPS檢測 使用能量色散X射線能譜儀檢測PLLA纖維、PLLA/PDA纖維和PLLA/DH-36纖維中C、N、O元素的占比，檢測三種材料中元素是否有含量的變化。

1.4.3 接觸角測試 通過接觸角測定儀檢測接枝抗菌肽前后聚乳酸纖維水接觸角，分析其親水性。將PLLA纖維、PLLA/PDA纖維和PLLA/DH-36纖維壓成薄片，平鋪于潔凈的玻璃板表面，使用接觸角測量系統分別拍攝去離子水與各組材料即刻接觸的圖片及與材料接觸5 s后的圖片。

1.5 藥物體外緩釋試驗

將抗菌肽溶于去離子水中，制備濃度梯度為2～100 mg/mL的19組溶液，在波長450 nm下使用比色皿測試每個梯度濃度溶液的光密度值(OD值)，作出抗菌肽含量的標準曲線。將PLLA/DH-36組材料置于PBS溶液中，在37 ℃恒溫培養箱中于1500 rpm下震動培養30、90、150、270 min及24、72、120、168 h后測試其OD值，根據標準曲線計算抗菌肽的釋放量，同時計算抗菌肽的釋放速率。

1.6 抗菌性能測試

大腸桿菌(ATCC25539，中國科學院長春應用化學研究所)和金黃色葡萄球菌(ATCC25923，中國科學院長春應用化學研究所)用作試驗菌，以評估抗菌棉的體外抗菌活性。

1.6.1 細菌和材料共培養 分別取上述細菌懸浮液(1×108cfu/mL)100 μL置于96孔板中，將20 mg材料置于孔板菌液中，每組設3個平行樣，在37 ℃恒溫培養箱中混合培養。在培養30、60、90、150、270 min及18、24 h后分別測試其在600 nm波長下的OD值，計算3個平行樣的平均OD值，表示菌液濃度。

1.6.2 抑菌環法 用LB液體培養基將S.aureus菌液稀釋100倍，E.coli菌液稀釋200倍后待用。在固體培養皿上涂布200 μL細菌懸浮液(1×108cfu/mL)，將三組材料置于培養皿上，37 ℃溫育14 h。通過觀察各組材料表面及周圍有無細菌區來定性測定抗菌棉對細菌的抑制作用。

1.6.3 細菌活/死染色法 分別將三組材料制成直徑為1 cm的樣品后置于24孔板中，制備1×108cfu/mL的S.aureus菌液，用LB液體培養基將其稀釋100倍后與樣品在37 ℃恒溫培養箱混合培養6 h，之后除去懸液，將樣品用戊二醛溶液固定30 min，置于4 ℃冰箱中過夜保存。將固定好的樣品用PBS溶液輕柔沖洗3次，去除表面懸浮的細菌。每組設3個平行樣。用PBS溶液分別溶解活/死染色的兩種試劑，每種試劑取150 μL，將兩種試劑混合均勻后，取混合液加入含樣品的孔板種，每孔加入20 μL，在37 ℃恒溫培養箱中孵育30 min后置于熒光顯微鏡下觀察細菌形態。

1.7 細胞相容性測試

按照體積比在DMEM培養基中加入1%雙抗和10%胎牛血清制備H-DMEM培養基，用該培養基復蘇MC3T3-E1細胞后，置于恒溫細胞培養箱中培養。將各組樣品經消毒處理后置于96孔板內，取處于對數生長期的細胞以每孔1.5×105個細胞的密度將其接種至96孔板上，于37 ℃，5% CO2細胞培養箱中分別培養1、3、7 d，后用PBS溶液洗滌各孔3次，加入含有10 μL CCK-8的培養液100 μL孵育2 h，使用酶標儀于450 nm波長處檢測各孔的光密度值，并將各組進行對照研究。每組樣品設置3個平行樣，且設置空白對照組。

1.8 統計學分析

所有數據使用Origin 8.0進行處理，使用SPSS 16.0統計軟件對數據進行統計學分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 掃描電鏡分析

使用直徑為400 μm的噴絲頭，接收距離為41.5 cm時，纖維直徑較均勻且其表面光滑沒有未熔融聚合物。用掃描電鏡對各組纖維的形態和直徑進行表征，圖像分析軟件Image J分析纖維直徑的尺寸分布范圍，約為8～16 μm。見圖1。

2.2 XPS分析

用XPS分別對PLLA組、PLLA/PDA組、PLLA/DH-36組樣品進行表征，觀察材料表面的官能團及N、O元素的含量變化。如圖2， PLLA組N含量為3.68%，PLLA/PDA組N含量為14.61%，PLLA/DH-36組N含量為17.08%。樣品中N元素含量的上升證明聚多巴胺輔助抗菌肽接枝成功。

2.3 親水性檢測

去離子水液滴和纖維表面之間測得的接觸角能反映材料表面潤濕性。接觸角值越小，表明材料表面的潤濕性越高，親水性也越強。如表1所示，在去離子水與樣品即刻接觸時，PLLA組纖維的水接觸角為123.63°，PLLA/PDA組纖維的接觸角為109.13°，而PLLA/DH-36組纖維的接觸角為0°；去離子水與樣品接觸5 s后，PLLA組纖維的接觸角為123.12°，而PLLA/PDA組纖維的接觸角迅速下降為0°，PLLA/DH-36組纖維的接觸角仍為0°。這表明了經改性的纖維表面親水性增強，潤濕性較好，有利于細胞黏附。

2.4 體外緩釋行為

根據抗菌肽的釋放實驗結果顯示，抗菌肽HHC-36在PBS溶液中能穩定釋放，其釋放量隨時間變化而持續增加；釋放速率初始時急速增大，在150 min時達至峰值，隨后逐漸下降，3 d后速率趨于平穩。見圖3。研究表明，在150 min內抗菌肽能完全發揮殺菌效果，抑制細菌的生長及增殖。

表1 樣品的接觸角表征

2.5 體外抗菌性能

微生物感染會阻礙創口愈合過程，因此紡絲棉具有抗菌能力十分重要。使用傷口感染的常見菌E.coli和S.aureus評估紡絲棉的抗菌能力。如圖4及圖5所示，細菌與材料共培養的結果，PLLA/DH-36組的細菌濃度始終保持在一個較低的水平，表明該組材料抑制金黃色葡萄球菌和大腸桿菌生長的效果較PLLA組及PLLA/PDA組顯著；但是在抑菌環實驗中，PLLA/DH-36組并沒有產生期望中的抑菌環，與其他兩組并無明顯差異，這可能與用于抑菌環實驗的材料表面較干燥，抗菌肽很難從其纖維表面游離出來而發揮抑菌效果有關，這說明PLLA/DH-36組材料的原位抗菌效果較好，不會產生全身毒性反應。細菌的活/死染色實驗證明，PLLA/DH-36組材料表面的死細菌數量較PLLA組多，活細菌數較少，這也證明其具有良好的抗菌性能。見圖6。

2.6 細胞相容性實驗

對于填充材料來說，良好的細胞相容性是其必備的性能，本研究通過CCK-8實驗定量評估3種材料的細胞毒性。如圖7所示，培養1 d時，與空白對照組相比，3組材料的細胞增殖率均較低；在培養3 d時，與PLLA/PDA組相比，PLLA/DH-36組表現出細胞毒性，但它與PLLA組的細胞毒性無明顯差異；在培養3 d后，3組材料的細胞毒性均表現出下降趨勢，恢復其良好的生物相容性，細胞增殖速率高于空白對照組。該結果表示經PDA和HHC-36改性后的材料并沒有改變PLLA纖維良好的細胞相容性，細胞毒性未增加。通過熒光顯微鏡觀察經DAPI-FITC染色的材料發現，PLLA/DH-36組材料表面的細胞存活率與PLLA組并無明顯差異，這與CCK-8實驗的結果相似。見圖8。

3 討論

對于阻生尖牙的位置較深者，若直接行開窗助萌術則會造成較大創口。因此需利用外科中治療囊腫時使用的開窗減壓術，待其萌出到合適位置后再行助萌術，輔助阻生牙萌出到牙列正常位置[9]。但該愈合過程持續時間較長，需要定期沖洗創口、更換引流條來避免萌出道愈合和繼發感染，這會給患者的生活造成不便[10]。為減輕患者的痛苦，縮短治療時間，擬研究一種具有抗菌效果、可降解的填充材料應用到開窗減壓術中。

抗菌肽是一種具有廣譜抗菌活性的氨基酸肽，對革蘭陽性菌、革蘭陰性菌、真菌等的生長都具有良好抑制效果，且其發揮作用的速度很快。研究[11]表明，含抗菌肽的涂層可以通過接觸殺死微生物細胞或通過局部釋放其活性成分來防止生物膜的形成，且它可與抗微生物化合物的協同作用以達到抗生物膜感染的效果。它可以通過多重機制發揮抗菌性能，是抗生素的有效替代物[7]。其中HHC-36更是性能最強的短鏈肽之一，結構簡單，可大規模制備，臨床前景應用廣泛。目前對用HHC-36修飾PLLA纖維表面的研究較少，對于其效果及相應的細胞毒性并不十分明確。貽貝啟發性的多巴胺(DA)是人體內眾所周知的一種神經遞質，它可與多種物質結合，能在弱堿性溶液環境中，在氧氣的參與下發生自聚合反應形成聚多巴胺(PDA)薄膜[12]。更重要的是，PDA薄膜可作為二級反應平臺介導可控的多種大分子活性聚合反應，為PDA在表面改性方面的應用提供了基礎[13]。以往有研究[14-15]證明，PDA可在多種材料表面形成涂層。目前 PDA自聚合機理尚未研究清楚，但是接枝藥物是明確的。PDA分子中存在的兒茶酚基團，多巴醌結構和氨基基團，能夠和活性藥物的氨基，羧基等基團發生化學共價結合反應，從而將藥物固定在材料表面[16-17]。同時因為PLLA纖維是具有三維立體結構的材料，其立體結構有助于聚多巴胺輔助抗菌肽在其表面的吸附。

本研究通過聚多巴胺將HHC-36接枝于PLLA纖維表面，通過其表面形貌等理化性能表征、抗菌性能、細胞相容性、動物實驗等來評估改性纖維的性能。為PLLA仿生棉在醫學填充材料領域的應用提供實驗依據。實驗結果顯示，經電鏡掃描后發現纖維直徑較均勻且其表面光滑沒有未熔融聚合物，說明聚乳酸紡絲纖維改性成功；其次，XPS檢測顯示PLLA組N含量為3.68%，PLLA/PDA組N含量為14.61%，PLLA/DH-36組N含量為17.08%，該結果表明樣品中N元素含量的上升，亦證明聚多巴胺輔助抗菌肽接枝成功；另外，親水性檢測顯示，在去離子水與樣品即刻接觸時，PLLA組纖維的水接觸角為123.63°，PLLA/PDA組纖維的接觸角為109.13°，而PLLA/DH-36組纖維的接觸角為0°，去離子水與樣品接觸5 s后，PLLA組纖維的接觸角為123.12°，而PLLA/PDA組纖維的接觸角迅速下降為0°，PLLA/DH-36組纖維的接觸角仍為0°，而去離子水液滴和纖維表面之間測得的接觸角能反映材料表面潤濕性，且接觸角值越小，表明材料表面的潤濕性越高，親水性也越強，說明經改性的纖維表面親水性增強，潤濕性較好，有利于細胞黏附，這與之前研究[18]一致。

抗菌性能中，PLLA/DH-36組材料不能如其他研究產生較明確的的抑菌環，可能由于用于抑菌環實驗的材料表面較干燥，抗菌肽不不能順利從其表面游離出來所致，表明改性材料的原位抑菌效果較好，只會在植入局部發生抗菌反應，不會引起宿主較嚴重的全身反應。PLLA/DH-36對金葡菌和大腸桿菌的抑制效果均較好，在材料與菌液共培養的實驗中，培養18 h時的細菌濃度較之前有小幅度上升，可能由于前后觀察的時間間隔較久，細菌濃度有所提高，24 h時的細菌濃度較18 h繼續下降也證明了改性材料在24 h時仍有抗菌效果。細菌活/死染色實驗的結果不易觀察的原因可能是PLLA/DH-36材料具有三維立體結構，細菌在該結構里附著，纖維交織處染色成團加深，不易看到單個較明顯的細菌形態。這在掃描電鏡觀測材料表面細菌及細胞形態中也有發生，導致該部分觀察結果缺如。在后續實驗中可將材料壓制成實片、在其表面接種細菌和細胞后再進行觀測。細胞相容性實驗表明，改性后的PLLA/DH-36組材料的細胞毒性較原始PLLA組材料并未增加，依舊保留PLLA纖維良好的生物相容性，而3 d內所觀測到的細胞毒性可能由于AMPs的突然釋放有關，說明PLLA/DH-36組材料具有良好的生物安全性，對于臨床來說具有重要意義。

綜上，作為一種高分子材料，經改性后的PLLA/DH-36具有良好的機械性能、抗菌活性、生物相容性等特點，對E.coli和S.aureus生長的抑制效果很好，可通過多種機制殺菌，而S.aureus是口腔環境的常居菌，可通過生物膜感染導致許多種慢性疾病，改性材料能對其發揮抑制作用，有利于它作為填充材料用于阻生齒導致的囊腫開窗減壓術后。這種改性的PLLA/DH-36材料具有的良好性能為抗菌肽修飾纖維表面的基礎研究奠定了基礎，也為改性材料作為填充材料應用于口腔臨床提供了科學依據。