新型吲哚胺-2,3-雙加氧酶1抑制劑的設計及生物活性研究

郁件康，周良*，龔銀華*，卞金磊

(1.蘇州大學附屬第一醫院，江蘇 蘇州 215006；2.中國藥科大學，江蘇 南京 211198)

吲哚胺-2,3-雙加氧酶1(indoleamine-2,3-dioxygenase 1,IDO1)在免疫耐受中發揮著重要作用，近年來被認為是小分子腫瘤免疫療法的新靶點[1]。IDO1是人體內必需氨基酸色氨酸(Trp)代謝的關鍵限速酶，在多種腫瘤組織中過度表達[2]。腫瘤組織中過度表達的IDO1致使腫瘤微環境中Trp耗竭，以此抑制T細胞的增殖分化，從而抑制免疫系統對腫瘤的免疫應答。研究表明聯用IDO1抑制劑，不但可以增強常規化學療法的療效，同時能與放射療法產生協同作用[3]。此外，研究表明ido1基因敲除的小鼠能健康地存活，這說明使用IDO1抑制劑不會產生嚴重的基于機制的副作用。因此，新型IDO1抑制劑的研究和開發對于腫瘤的治療具有重要的意義。

自2006年，報道了首個IDO1與4-苯基咪唑(PIM)的共晶復合結構(PDB代碼:2D0T)后，到目前已有數十個不同配體的IDO1共晶復合結構先后被報道。這些晶體結構的解析為計算機輔助藥物設計(CADD)的方法發現潛在的IDO1抑制劑鋪奠定了基礎。盡管已有多種IDO1抑制劑被報道，然而到目前為止仍未有藥物成功上市。目前在研的IDO1抑制劑中，其骨架主要集中在[5,6]-稠合雜芳族類衍生物、羥脒類衍生物、苯基咪唑類衍生物、醌類衍生物、苯基脲類衍生物和苯基苯磺酰肼類衍生物等6種結構類型上(見圖1)[4-7]。

圖1 處于臨床研究的IDO1小分子抑制劑

為獲得結構新穎具有良好類藥性性質的IDO1抑制劑，前期運用虛擬篩選與活性評價相結合的方法從32個結構各異的化合物中獲得苗頭化合物LVS-019[8]。基于LVS-019在IDO1酶催化口袋中的結合模式，本研究從占據口袋A的部分、連接鏈部分和占據口袋 B的部分3個方面設計并合成3個系列共23個衍生物。希望基于前期虛擬篩選出的苗頭化合物LVS-019與IDO1的結合模式，及其他類已報道的IDO1抑制劑的構效關系，對苗頭化合物LVS-019進行合理結構改造[9]，并對設計合成得到的一系列具有新型骨架結構的小分子化合物進行IDO1抑制活性的初步篩選[10]。同時，通過探索我們希望能為IDO1抑制劑的研究提供新的思路，為今后新型骨架結構的發現與活性較好的IDO1抑制劑的開發提供線索。

1 設計與合成

1.1 化合物的設計 前期為獲得新型骨架的IDO1抑制劑，采用相似性搜索與分子對接相結合的方法發現了一系列結構各異的化合物，同時對這篩選得到的化合物進行IDO1酶抑制活性測定和基于HeLa細胞的IDO1抑制實驗，得到一個含有氰基吡啶結構的新型IDO1抑制劑LVS-019[8]。運用分子對接軟件將LVS-019與IDO1(PDB代碼：4PK5)研究LVS-019在IDO1蛋白活性口袋中的結合模式(見圖2)。可以發現：①吡啶環位于A口袋中，6位異丙基部分與A口袋中周圍氨基酸殘基形成疏水相互作用，氰基與IDO1活性位點中的亞鐵血紅素配位；②硫乙酰胺連接鏈控制末端苯環部分延伸至B口袋；③末端苯環與氨基酸殘基Phe226形成π-π堆疊作用。

圖2 LVS-019與IDO1活性位點關鍵氨基酸殘基分析

綜上所述，本論文基于LVS-019在IDO1活性口袋中的作用模式，擬在A部分引入不同取代的氰基吡啶環和不同取代的喹啉環、連接鏈部分引入多種環狀片段、B部分引入不同取代基進行化合物設計，探索各部分對IDO1抑制活性的影響(見圖3)。

1.2 化合物的合成 化合物的合成如圖4所示。首先，以2-氯-3-腈基吡啶與新戊酸為原料，通過Menisci反應得到中間體4a。同時，以4-氨基哌啶-1-羧酸叔丁酯與取代酰氯為原料，通過縮合反應得到中間體2，隨后脫除Boc保護得到關鍵中間體3。中間體3與2-氯-3-氰基吡啶(4a)發生取代反應得到終產物6a～6e(結構見表1)。具體合成過程參考實驗部分，所有終產物都經過核磁與質譜確證。

(i)AgNO3,(NH4)2S2O8,H2SO4,0 ℃ to rt；(ii)CH2Cl2,0 ℃ to rt;(iii)HCl,EtOAc,rt;(iv)Et3N,DMF,80 ℃

2 化合物的IDO1抑制活性及結果討論

根據文獻報道，可采用如CCK-8法來測定抗腫瘤增殖活性獲取IC50值。考慮研究實際，目前通過檢測在不同濃度的IDO1抑制劑作用下產生的色氨酸代謝物犬尿氨酸的吸光度計算得到各個IDO1抑制劑的IC50值，進而對其進行初步的IDO1抑制活性評價。其中化合物6a～6c和6e的活性與LVS-019相比有1.2～3倍的提高。將連接鏈延長一個碳原子長度合成的化合物6e的IDO1抑制活性優于6a～6d，與LVS-019相比活性提高了3倍左右。將6b～6d進行結構和活性的對比，發現在末端苯環對位引入氯原子的IDO1抑制活性較引入氟原子或溴原子提高2倍左右。

通過以上工作我們對構效關系進行初步總結：①連接鏈部分為環己烯乙酰胺時，有利于IDO1抑制活性的提高，但引入氮雜環或縮短、增加連接鏈的長度會使IDO1抑制活性有不同程度的下降；②B部分為芳香環時，IDO1抑制活性保持；當B部分為苯環時，苯環上引入單鹵素取代基特別是氯原子取代時，有利于IDO1抑制活性的提高。

3 代表化合物的初步藥代動力學實驗

基于較好的體外IDO酶綜合抑制結果，我們選取具有代表性的化合物6e進行了理化性質考察及成藥性評價來進一步驗證改造方向的合理性(見表2)。我們測試了并計算了化合物的水溶性(S)、透膜性(Caco-2透膜實驗)、極性表面積(polar surface area,PSA)。如表2所示，化合物6e在水溶性上與先導化合物LVS-019相比有了6倍左右的提高。在隨后的Caco-2透膜性實驗中，化合物表現出了中等的水平(Papp A-B2.94× 10-6cm·s-1)，且無明顯的外排作用，但就透膜作用來說具有良好的成藥性。

表2 代表性化合物6e理化性質與成藥性考察

隨后我們對6e進行了初步藥代動力學(Pharmacokinetic,PK)評價，結果如表3所示。整體來看，代表化合物6e相比于LVS-019來說均顯著提高的PK性質。靜脈給藥途徑中(iv,15 mg·kg-1)，化合物6e半衰期為1.66 h，AUC為1 902 ng·mL-1·h。在口服給藥途徑中(po,50 mg·kg-1)，化合物6e半衰期為1.91 h，口服生物利用度[F(%)]達到31%。化合物LVS-019則表現出了較快的清除率，以及隨之的較短保留時間(po t1/2=0.34 h)。總體來說，代表化合物6e的初步體內藥代動力學實驗呈現出良好的成藥性，顯示出代表化合物作為口服藥物具有一定潛力，值得進一步研究。

表3 代表化合物6e初步PK考察

4 實驗部分

4.1 儀器與試藥 本文涉及的化學合成所使用的試劑(除特殊說明外)均為市場上銷售的化學純或分析純產品，不經處理直接使用。化合物純化所使用的薄層層析板采用青島海浪硅膠干燥劑廠生產的硅膠GF254薄層板，柱層析硅膠采用青島海浪硅膠干燥劑廠生產的100～200目或200～300目硅膠。未經特殊說明，本文所使用的柱層析方法為濕法裝柱、干法上樣，洗脫劑的比例為體積比，所使用的石油醚沸程為60～90 ℃。

化合物結構確證所使用的儀器包括：Nicolet Impact 410 型(KBr壓片)紅外測定儀、GC-MS-QP2010型質譜儀、Agilent technologies 6520 Accurate-Mass Q-TOF LC/MS高分辨質譜儀、AV-300 BRUKER核磁共振儀、X-4數字顯示顯微熔點測定儀。

4.2 化合物6a～6g的合成

4.2.1 4-(4-硝基苯甲酰氨基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(2a)的制備 將1-Boc-4-氨基哌啶(2.00 g,9.99 mmol,1 eq)溶解于20 mL的二氯甲烷中，于0 ℃下逐滴滴加對硝基苯甲酰氯(2.04 g,10.98 mmol,1.1 eq)，滴加完畢后，室溫下攪拌5 h，TLC檢測反應完全。后處理：反應液用1 mol·L-1稀鹽酸溶液洗滌一次，水洗滌一次，再用飽和氯化鈉溶液洗滌一次后，有機相減壓蒸除溶劑得2a(2.74 g,78.5%)，為白色固體。HRMS(m/z):C17H23N3O5計算值350.171 0,(M+H)+,實際值350.171 5。

4.2.2 4-硝基-N-(哌啶-4-)苯甲酰胺(3a)的制備 2a(2.00 g,5.72 mmol,1 eq)溶解于20 mL 的乙酸乙酯中，于室溫下通入干燥的氯化氫氣體，反應過夜，TLC檢測反應完全。后處理：將反應液抽濾，濾餅干燥得3a(1.35 g,82.5%)，為白色固體。HRMS(m/z):C12H15N3O3計算值250.118 6,(M+H)+,實際值250.119 3。

4.2.3 4-(4-氟苯甲酰氨基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(2b)的制備 將1-Boc-4-氨基哌啶(2.00 g,9.99 mmol,1 eq)溶解于20 mL的二氯甲烷中，于0 ℃下逐滴滴加對氟苯甲酰氯(1.74 g,10.98 mmol,1.1 eq)，滴加完畢后，室溫下攪拌5 h，TLC檢測反應完全。后處理：反應液用1 mol·L-1稀鹽酸溶液洗滌一次，水洗滌一次，再用飽和氯化鈉溶液洗滌一次后，有機相減壓蒸除溶劑得2b(2.73 g,84.9%)，為白色固體。HRMS(m/z):C17H23FN2O3計算值323.176 5,(M+H)+,實際值323.176 9。

4.2.4 4-氟-N-(哌啶-4-)苯甲酰胺(3b)的制備 將2h(2.00 g,6.20 mmol,1 eq)溶解于20 mL 的乙酸乙酯中，于室溫下通入干燥的氯化氫氣體，反應過夜，TLC檢測反應完全。后處理：將反應液抽濾，濾餅干燥得3b(1.42 g,88.5%)，為白色固體。HRMS(m/z):C12H15FN2O計算值223.124 1,(M+H)+,實際值223.124 2。

4.2.5 4-(4-氯苯甲酰氨基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(2c)的制備 將1-Boc-4-氨基哌啶(2.00 g,9.99 mmol,1 eq)溶解于20 mL的二氯甲烷中，于0 ℃下逐滴滴加對氯苯甲酰氯(1.92 g,10.98 mmol,1.1 eq)，滴加完畢后，室溫下攪拌5 h，TLC檢測反應完全。后處理：反應液用1 mol·L-1稀鹽酸溶液洗滌一次，水洗滌一次，再用飽和氯化鈉溶液洗滌一次后，有機相減壓蒸除溶劑得2c(2.88 g,85.1%)，為白色固體。HRMS(m/z):C17H23ClN2O3計算值339.147 0,(M+H)+,實際值339.147 3。

4.2.6 4-氯-N-(哌啶-4-)苯甲酰胺(3c)的制備 將2i(2.00 g,5.90 mmol,1 eq)溶解于20 mL 的乙酸乙酯中，于室溫下通入干燥的氯化氫氣體，反應過夜，TLC檢測反應完全。后處理：將反應液抽濾，濾餅干燥得3c(1.47 g,90.4%)，為白色固體。HRMS(m/z):C12H15ClN2O計算值239.094 6,(M+H)+,實際值239.095 5。

4.2.7 4-(4-溴苯甲酰氨基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(2d)的制備 將1-Boc-4-氨基哌啶(2.00 g,9.99 mmol,1 eq)溶解于20 mL的二氯甲烷中，于0 ℃下逐滴滴加對溴苯甲酰氯(2.41 g,10.98 mmol,1.1 eq)，滴加完畢后，室溫下攪拌5 h，TLC檢測反應完全。后處理：反應液用1 mol·L-1稀鹽酸溶液洗滌一次，水洗滌一次，再用飽和氯化鈉溶液洗滌一次后，有機相減壓蒸除溶劑得2d(3.21 g,83.9%)，為白色固體。HRMS(m/z):C17H23BrN2O3計算值383.096 5,(M+H)+,實際值383.096 5。

4.2.8 4-溴-N-(哌啶-4-)苯甲酰胺(3e)的制備 將2j(2.00 g,5.21 mmol,1 eq)溶解于20 mL 的乙酸乙酯中，于室溫下通入干燥的氯化氫氣體，反應過夜，TLC檢測反應完全。后處理：將反應液抽濾，濾餅干燥得3e(1.54 g,92.3%)，為白色固體。HRMS(m/z):C12H15BrN2O計算值283.044 1,(M+H)+,實際值283.044 4。

4.2.9N-(1-(6-(叔丁基)-3-氰基吡啶-2-)哌啶-4-基)-4-硝基苯甲酰胺(6a)的制備 將4a(0.33 g,1.70 mmol,1 eq)、3a(0.53 g,1.86 mmol,1.1 eq)和三乙胺(0.38 g,3.72 mmol,2.2 eq)溶解于DMF中，于80 ℃下反應5 h，TLC檢測反應完全。后處理：將反應液倒入水中，抽濾，濾餅柱層析得6a(0.52 g,75.3%)，為淡黃色固體。m.p.127～129 ℃。1H-NMR(300 MHz,CDCl3-d6),δ:8.31(d,J=9.0 Hz,2H,Ar-H),7.95(d,J=9.0 Hz,2H,Ar-H),7.72(d,J=6.0 Hz,1H,Ar-H),6.82(d,J=9.0 Hz,1H,Ar-H),6.16-6.13(m,1H,-NH-),4.46-4.34(m,2H,-N-CH-),4.31-4.28(m,1H,-CH-),3.25-3.17(m,2H,-N-CH-),2.24-2.19(m,2H,-CH-),1.72-1.63(m,2H,-CH-),1.30(s,9H,-CH3)ppm;13C-NMR(75 MHz,CDCl3-d6),δ:172.2,164.4,159.1,149.0,143.3,139.7,127.7,123.2,118.1,109.4,90.9,47.3,46.8,37.7,31.4,29.1 ppm;HRMS(m/z):C22H25N5O3計算值 408.203 0,(M+H)+,實際值408.201 8。

4.2.10N-(1-(6-(叔丁基)-3-氰基吡啶-2-)哌啶-4-基)-4-氟苯甲酰胺(6b)的制備 將4a(0.32 g,1.64 mmol,1 eq)、3b(0.47 g,1.80 mmol,1.1 eq)和三乙胺(0.36 g,3.60 mmol,2.2 eq)溶解于DMF中，于80 ℃下反應5 h，TLC檢測反應完全。后處理：將反應液倒入水中，抽濾，濾餅柱層析得6b(0.39 g,62.6%)，為淡黃色固體。m.p.136～138 ℃。1H-NMR(300 MHz,CDCl3-d6),δ:7.80-7.75(dd,J=9.0 Hz,J=6.0 Hz,2H,Ar-H),7.69(d,J=9.0 Hz,1H,Ar-H),7.14-7.09(m,2H,Ar-H),6.79(d,J=9.0 Hz,1H,Ar-H),5.97(d,J=6.0 Hz,1H,-NH-),4.41(d,J=12.0 Hz,2H,-N-CH-),4.27-4.25(m,1H,-CH-),3.19(t,J=12.0 Hz,2H,-N-CH-),2.18(d,J=12.0 Hz,2H,-CH-),1.67-1.63(m,2H,-CH-),1.31(s,9H,-CH3)ppm;13C-NMR(75 MHz,CDCl3-d6),δ:172.1,165.8,165.3,162.5,159.1,143.3,130.3,128.8,128.7,118.2,115.1,114.9,109.2,90.9,46.9,46.7,37.7,31.6,29.1 ppm;HRMS(m/z):C22H25FN4O 計算值381.208 5,(M+H)+,實際值381.209 6.

4.2.11N-(1-(6-(叔丁基)-3-氰基吡啶-2-)哌啶-4-基)-4-氯苯甲酰胺(6c)的制備 將4a(0.34 g,1.75 mmol,1 eq)、3c(0.53 g,1.92 mmol,1.1 eq)和三乙胺(0.39 g,3.84 mmol,2.2 eq)溶解于DMF中，于80 ℃下反應5 h，TLC檢測反應完全。后處理：將反應液倒入水中，抽濾，濾餅柱層析得6c(0.36 g,51.6%)，為淡黃色固體。m.p.153～155 ℃。1H-NMR(300 MHz,CDCl3-d6),δ:7.72-7.68(m,3H,Ar-H),7.41(d,J=9.0 Hz,2H,Ar-H),6.79(d,J=9.0 Hz,1H,Ar-H),5.98(d,J=6.0 Hz,1H,-NH-),4.43-4.38(d,J=15.0 Hz,2H,-N-CH-),4.31-4.21(m,1H,-CH-),3.24-3.14(m,2H,-N-CH-),2.20-2.15(dd,J=12.0 Hz,J=3.0 Hz,2H,-CH-),1.68-1.63(m,2H,-CH-),1.31(s,9H,-CH3)ppm;13C-NMR(75 MHz,CDCl3-d6),δ:172.1,165.3,159.1,143.3,132.4,128.2,127.9,121.7,118.1,109.3,90.9,46.9,46.7,37.7,31.6,29.1 ppm;HRMS(m/z):C22H25ClN4O計算值397.179 0,(M+H)+,實際值397.179 6。

4.2.12N-(1-(6-(叔丁基)-3-氰基吡啶-2-)哌啶-4-基)-4-溴苯甲酰胺(6d)的制備 將4a(0.32 g,1.64 mmol,1 eq)、3d(0.58 g,1.81 mmol,1.1 eq)和三乙胺(0.37 g,3.62 mmol,2.2 eq)溶解于DMF中，于80 ℃下反應5 h，TLC檢測反應完全。后處理：將反應液倒入水中，抽濾，濾餅柱層析得6d(0.33 g,45.5%)，為淡黃色固體。m.p.188～190 ℃。1H-NMR(300 MHz,CDCl3-d6),δ:7.70(d,J=6.0 Hz,1H,Ar-H),7.65-7.56(dd,J=12.0 Hz,J=9.0 Hz,4H,Ar-H),6.80(d,J=6.0 Hz,1H,Ar-H),5.99(d,J=6.0 Hz,1H,-NH-),4.41(d,J=12.0 Hz,2H,-N-CH-),4.27-4.26(m,1H,-CH-),3.23-3.15(m,2H,-N-CH-),2.17(d,J=12.0 Hz,2H,-CH-),1.72-1.60(q,J=12.0 Hz,2H,-CH-),1.31(s,9H,-CH3)ppm;13C-NMR(75 MHz,CDCl3-d6),δ:172.1,165.3,159.1,143.3,132.9,131.3,128.0,125.6,118.1,109.3,90.9,46.9,46.7,37.3,31.6,29.1 ppm;HRMS(m/z):C22H25BrN4O計算值441.128 5,(M+H)+,實際值441.128 8。

4.2.13N-(1-(6-(叔丁基)-3-氰基吡啶-2-基)哌啶-4-基)-2-苯基乙酰胺(6e)的制備 將4a(0.32 g,1.64 mmol,1 eq)、3e(0.46 g,1.81 mmol,1.1 eq)和三乙胺(0.37 g,3.62 mmol,2.2 eq)溶解于DMF中，于80 ℃下反應5 h，TLC檢測反應完全。后處理：將反應液倒入水中，抽濾，濾餅柱層析得6e(0.33 g,53.3%)，為淡黃色固體。m.p.138～140 ℃。1H-NMR(300 MHz,CDCl3-d6),δ:7.67(d,J=9.0 Hz,1H,Ar-H),7.38-7.28(m,5H,Ar-H),5.32(t,J=6.0 Hz,1H,-NH-),4.29(d,J=12.0 Hz,2H,-N-CH-),4.13-4.00(m,1H,-CH-),3.60(s,2H,-CH2-),3.16-3.07(m,2H,-N-CH-),2.03-1.98(m,2H,-CH-),1.49-1.40(m,2H,-CH-),1.30(s,9H,-CH3)ppm;13C-NMR(75 MHz,CDCl3-d6),δ:172.0,169.8,159.0,143.3,134.3,128.8,128.5,126.8,118.1,109.1,90.7,46.5,46.3,43.4,37.6,31.4,29.1 ppm;HRMS(m/z):C23H28N4O計算值377.233 6,(M+H)+,實際值 377.234 0。

5 結論

本文基于前期研究獲得的具有氰基吡啶結構的IDO1抑制劑LVS-019，該化合物在IDO1酶抑制活性測定和基于HeLa細胞的IDO1抑制實驗中測得其具有良好的IDO1抑制活性，且在MTT比色法測定細胞毒性實驗中LVS-019對HeLa細胞的毒性遠小于Epacadostat。我們運用分子對接軟件將LVS-019與IDO1(PDB代碼：4PK5)進行分子對接觀察LVS-019在IDO1蛋白活性口袋中的結合模式。基于LVS-019在IDO1活性口袋中的占據情況，設計并合成一系列衍生物，其結構經HRMS和NMR確證。并得到初步構效關系：①連接鏈部分為環己烯乙酰胺時，有利于IDO1抑制活性的提高，但引入氮雜環或縮短、增加連接鏈的長度會使IDO1抑制活性有不同程度的下降；②B部分為芳香環時，IDO1抑制活性保持；當B部分為苯環時，苯環上引入單鹵素取代基特別是氯原子取代時，有利于IDO1抑制活性的提高。其中最優化合物6e表現出良好的藥代性質，具有成為口服抗腫瘤藥物的潛力。本論文的研究希望能為后期IDO1抑制劑的結構修飾與改造提供理論依據。