Box-Behnken響應面法優化葡萄籽原花青素柔質體的制備工藝

竇 晨,趙聲蘭,丁 雄,林柳任,馬云淑,潘 蕊,程 欣

云南中醫藥大學中藥學院 云南省高校外用給藥系統與制劑技術研究重點實驗室 云南省傣醫藥與彝醫藥重點實驗室,昆明 650500

葡萄籽、葡萄皮作為葡萄酒釀造過程中的邊腳料常被作為廢棄物丟棄,但這些廢棄物中含有豐富的多酚,可作為一種生態可持續和低成本的天然抗氧化劑來源。其中葡萄籽原花青素(grape seed proanthocyanidins,GSP)由于含量高、活性好,具有抗癌[1]、抗菌[2]、抗氧化清除自由基[3]、抗炎[4]、抑制黑色素的生成[5]等藥理學活性,受到了研究者們的廣泛關注。有研究發現,與維生素C和維生素E琥珀酸酯相比,GSP是更有效的抗氧化劑和自由基清除劑[6],萄萄籽中多酚類物質的含量可達5%～8%,在這些多酚類物質中,以原花青素含量最高。GSP主要是由兒茶素、表兒茶素、表兒茶素沒食子酸酯聚合而成的二聚體及多聚體[7]。隨著聚合度不同表現出不同的理化性質,低聚原花青素有較強的抗氧化活性,顏色呈白色或淺黃色。高聚原花青素主要是原花青素縮合后的產物,顏色呈紅色,水溶性較差,抗氧化活性比低聚體低,常用作染色劑、食品著色劑[8]。由于GSP分子結構中的不飽和鍵和強大的抗氧化能力使其易受光、熱、酶、金屬離子、氧氣和酸堿度的影響變得極不穩定[9];并且由于其水溶性小,導致生物利用度降低;其具有澀味和苦味,這些性質限制了原花青素在食品、藥品、化妝品領域的廣泛使用。

脂質體是具有磷脂雙分子層的封閉囊泡狀結構,主要由磷脂或磷脂分子組成,能夠包載具有不同性質(如親水性、親脂性和兩親性)的藥物分子,從而增加被包封藥物分子的穩定性和功能性,增大藥物的溶解度,提高藥物的穩定性。傳統的囊泡體(脂質體和囊泡)不能有效地通過皮膚進行透皮傳遞,而是局限在皮膚的表層,因此添加丙二醇、膽酸鈉作為邊緣活化劑的柔性納米脂質體,由于其具有柔韌性和可變形性,故更容易進行透皮傳遞[10-11]。本實驗采用薄膜分散超聲法[12]制備GSP-LPs,用響應曲面法對其制備工藝進行優化,考察其體外釋放特性,為進一步開發利用GSP奠定基礎。

1 儀器與材料

1.1 儀器

JEM-1400PLUS型透射電子顯微鏡、Brookhaven 190Plus型納米激光粒度儀均購自美國布魯克海文公司;電子天平(奧斯豪儀器有限公司);臺式高速大容量冷凍離心機(湖南湘儀離心機儀器有限公司);紫外可見分光光度計(上海翱藝儀器有限公司);TK-12B型透皮擴散池(上海市鍇凱科技貿易有限公司);FS-300N型超聲波處理器(上海生析超聲儀器有限公司);旋轉蒸發儀(昆明倍捷科技有限公司);SHZ-D(Ⅲ)型循環水式真空泵(鞏義市予化儀器有限責任公司)。

1.2 試藥

原花青素對照品(批號1024K021SX,質量分數≥95%,北京索萊寶科技有限公司);葡萄籽原花青素(批號002200604028,質量分數≥95%,天津市尖峰天然產物研究開發有限公司);大豆卵磷脂(批號1112J021,北京索萊寶科技有限公司);膽固醇(批號624J033),脫氧膽酸鈉(批號909P021,質量分數>99%)均購自北京蘭杰柯科技有限公司;香草醛(批號C10083717,上海麥克林生化科技有限公司);鹽酸(批號20150518)、三氯甲烷(批號20150610)均購自云南楊林工業開發區汕滇藥業有限公司;甲醇(批號20201014,分析純,天津市致遠化學試劑有限公司);1,2-丙二醇(批號C10561784,上海麥克林生化科技有限公司)。

1.3 動物

SPF級KM小鼠,雄性,體質量(20±2) g,購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司,許可證號SCXK(湘)k2017-0005。

2 方法與結果

2.1 香草醛鹽酸顯色法測定原花青素含量

2.1.1香草醛鹽酸顯色法實驗原理 基于酚醛縮合反應,原花青素分子中的間苯三酚在酸催化下與香草醛(香蘭素C8H8O3)發生縮合而形成有色的碳正離子,使原花青素分子產生紅色的發光基團[13](λ=500 nm)。原花青素或(+)-兒茶素可作為對照品。(+)-兒茶素或(-)-表兒茶素單體及其低聚體等都能參加反應,可同時測定單體和聚合體的總含量。

2.1.2顯色劑的配制 精密稱定2 g香草醛置于50 mL量瓶中,加入甲醇溶解,定容至50 mL,再加入1.5 mL鹽酸,混勻,即得。

2.1.3最大吸收波長的確定[14]配制一定質量濃度的原花青素對照品的甲醇溶液,取0.5 mL,置于試管中,加入3 mL香草醛甲醇溶液及1.5 mL鹽酸,搖勻,于20 ℃恒溫水浴中避光反應15 min后,以試劑為空白對照溶液,用紫外可見分光光度計在400～800 nm的波長范圍內進行全波長掃描。結果顯示,其在500 nm波長處有最大吸收。見圖1。

注:a.GSP甲醇溶液的吸收峰;b.甲醇溶液的吸收峰。

2.2 測定原花青素含量紫外分光光度法的建立

2.2.1線性關系考察 精密稱定葡萄籽原花青素對照品5.36 mg,加入甲醇定容至10 mL,梯度稀釋配制成質量濃度為0.05～0.46 mg·mL-1的對照品溶液。分別精密量取0.5 mL不同質量濃度的對照品溶液置于試管中,分別精密量取3 mL體積分數為4%的香草醛甲醇溶液及1.5 mL鹽酸加入試管中,充分搖勻,于20 ℃水浴中反應15 min后,于500 nm處測定其吸光度值,繪制吸光度-質量濃度標準曲線。數據分析后擬合的標準曲線為y=1.997x+0.014 7(R2=0.999 4)。表明原花青素質量濃度在0.05～0.45 mg·mL-1范圍內線性關系良好。

2.2.2精密度實驗 配制質量濃度分別為0.5、0.25、0.125 mg·mL-1的葡萄籽原花青素樣品溶液,連續6次測定其吸光度值,平均吸光度值分別為0.642、0.313、0.155,RSD值分別為0.14%、0.24%、0.33%。表明儀器的精密度良好。

2.2.3穩定性實驗 取1 mL 2.3.1項下制備的葡萄籽原花青素柔質體,加入一定量的甲醇超聲破乳后靜置至上清液澄清,用同法處理的空白脂質體調零,分別于0、2、4、6、8、12 h測定其在500 nm處的吸光度值,吸光度值分別為0.663、0.668、0.664、0.678、0.666、0.668,RSD值為0.84%。表明樣品在12 h內穩定性良好。

2.2.4加樣回收率實驗 配制質量濃度分別為0.69、1.45、2.17 mg·mL-1的葡萄籽原花青素對照品溶液,取1 mL空白脂質體3份分別加入2 mL不同質量濃度的對照品溶液,再分別加入一定量的甲醇超聲破乳后,取澄清上清液0.5 mL。根據2.2.1項下的方法測定其吸光度值(A),根據回歸方程計算得藥物含量(m)。加樣回收率=(加入量/測得量)×100%。結果見表1。

表1 加樣回收率實驗結果

2.3 GSP-LPs的制備

2.3.1薄膜分散超聲法制備葡萄籽原花青素柔質體 精密稱取處方量的卵磷脂、膽固醇溶于15 mL氯仿,脫氧膽酸鈉置于5 mL甲醇中超聲溶解。將上述2個組分置于圓底燒瓶中混合均勻,于40 ℃水浴減壓旋轉蒸發除去有機溶劑,直至在瓶壁形成透明、干燥、均勻的脂質薄膜。精密稱取處方量葡萄籽原花青素溶于6 mL水中,作為水相,將水相置于圓底燒瓶中,于40 ℃水浴中旋轉水合30 min,將所得混合液置于超聲波處理器中,超聲混勻(150～180 W,5 min),用0.22 μm微孔濾膜過濾即得,置于4 ℃密封保存。

2.3.2包封率、載藥量測定方法 精密量取1 mL 2.3.1項下制備的柔質體,加入1.2 mL 1 mol·mL-1鹽酸溶液靜置使其絮凝[15-16],以18 000 r·min-1離心20 min后,取上清液,以溶劑調零,測定上清液的吸光度值(A1)。另精密量取1 mL柔質體,加入甲醇超聲使其破乳后靜置至上清液澄清,棄去底部白色絮狀沉淀,用同法處理的空白脂質體調零,測定吸光度值(A2)。將A1、A2帶入2.2.1項下的回歸方程,計算出游離藥物含量M1及總藥量M總,脂質體總質量記為M2,根據公式計算出脂質體的包封率和載藥量。包封率(EE)=[(M總-M1)/M總]×100%。載藥量=[(M總-M1)/M2]×100%。

2.3.3處方工藝優選 通過查閱文獻及單因素實驗[17],確立了對脂質體包封率影響比較顯著的3個因素,即卵磷脂的質量濃度(x1)、卵磷脂與膽固醇的比(x2)、膽酸鈉的用量(x3),將其作為響應面的3個因素,并將包封率(y1)、粒徑(y2)、PDI(y3)作為響應值,實驗結果見表2。

據《后漢書》《三國志》載，陶謙與曹操對戰地點是在徐州，治所后來遷到山東郯城；陶謙死后，劉備接任徐州牧時，治所應已移至下邳，因為呂布是從劉備手中奪了下邳，并自封徐州刺史，治所就在下邳。直到魏明帝時，徐州刺史部治所才移到彭城（徐州）。但《三國演義》中，說劉備、呂布的治所都是在徐州，這樣，為了解釋呂布何以是在下邳被縊死，就不得不添補一些情節。《三國演義》作者被認為是明朝吳貫中；明洪武年間，下邳縣已屬邳州，并另建新城，古下邳城的重要性大大降低。吳貫中不知是誤會，還是有意，將戰爭重心移到了徐州，這與歷史不符。

表2 GSP-LPs優選的響應曲面實驗結果

根據各指標的擬合方程,固定一個因素水平,用Design-Expert 8.0.6軟件分別繪制各評價指標與另外2個考察因素的三維曲面圖,見圖2。根據響應曲面擬合結果得最優處方為x1=12.5 mg·mL-1,x2=15∶1,x3=15 mg。根據該優化處方制備5批樣品,結果包封率為70.79%±0.02%,載藥量為1.16%±0.01%,PDI為0.26±0.01,與預測值(包封率70.25%,PDI=0.224)比較,偏差均<5%。實測粒徑為(156.47±7.03) nm,雖然與預期粒徑(167.43 nm)存在一定差別,但保持著較小的粒徑范圍。說明擬合方程所建立的模型具有良好的預測性,工藝穩定、可行。

圖2 各因素對GSP-LPs的PDI、包封率和粒徑影響的三維響應曲面圖

2.3.4GSP-LPs的粒徑及Zeta電位檢測 取適量制備的GSP-LPs混懸液,加適量水稀釋后,用激光粒度儀測定其粒徑、PDI及Zeta電位。葡萄籽原花青素柔質體的粒徑為(156.47±7.03) nm,PDI為(0.26±0.01),電位為(-42.35±4.00) mV (n=5),制得的柔質體粒徑分布均勻,且集中分布于100～150 nm范圍內,穩定性良好。結果見圖3。

注:A.GSP-LPs的Zeta電位;B.粒徑分布。

2.3.5GSP-LPs的外觀及形態觀察 將2.3.1項下制備的空白柔質體(blank flexiblenano-liposomes,B-LPs)及GSP-LPs混懸液置于透明西林瓶中,觀察其外觀,葡萄籽原花青素柔質體為紅棕色乳液。吸取1滴柔質體混懸液置于載玻片上,將銅網倒扣于液體上,用醋酸鈾對樣品進行負染,待樣品晾干后,在TEM透射電鏡下進行觀察。結果見圖4。由圖4可見,柔質體形態為類圓球形且分布均勻。

注:A.GSP-LPs透射電鏡圖(×80 000);B.GSP-LPs的外觀。

2.4 體外經皮滲透實驗

2.4.1離體小鼠皮膚的制備 將昆明種小鼠脫頸椎處死后,固定于木板上,用剃須機小心剔除腹部毛,立即剪下其腹部皮膚,剝離皮下組織及脂肪,將其浸泡于生理鹽水中,選取表皮完整無破損的皮膚置于-80 ℃保存,備用。

2.4.2經皮滲透實驗 采用Franz透皮擴散池法,以游離GSP為對照進行GSP-LPs體外經皮滲透實驗。首先將預處理好的鼠皮固定于透皮杯上,使角質層面向供給池,用夾子夾緊。再加入體積分數為30%的乙醇溶液-生理鹽水,將其作為接收介質并排出氣泡,于水浴溫度(32±0.5) ℃、轉速300 r·min-1的條件下進行實驗。分別于0.5、1、2、4、6、8、12、24、48、72 h取樣2 mL,同時補加等量同溫度的接收介質。最后將接收液用0.22 μm的微孔濾膜過濾后,計算原花青素在不同時間點單位面積的累積透過量(Q),以時間(t)為橫坐標(x)、單位面積的累積透過量(Q)為縱坐標(y)做圖。結果見圖5。

圖5 GSP、GSP-LPs藥物單位面積累積透過量曲線

分別采用零級釋放動力學方程、一級釋放動力學方程、Higuchi方程、Weibull方程、Ritger-peppas方程對體外釋放結果進行擬合。結果見表3。結果顯示,以Weibull方程擬合時GSP、GSP-LPs均具有較高的擬合度,其相關系數分別為0.998 4、0.997 5,表明二者的釋放規律符合Weibull方程。

表3 GSP、GSP-LPs藥物單位面積累積透過量曲線方程擬合

2.4.3藥物的體外釋放考察 精密量取葡萄籽原花青素柔質體、原花青素溶液2 mL,置于透析袋(相對分子質量100 000)中,以8 mL體積分數為30%的乙醇溶液-生理鹽水為釋放介質,于Franz體外透皮擴散池上以300 r·min-1的轉速恒溫(37±0.5) ℃進行實驗。分別于0.5、2、4、6、8、12、24、48、72、96 h取樣2 mL,同時補加等量同溫度的釋放介質,接收液用0.22 μm的微孔濾膜過濾后,取0.5 mL于500 nm處測定藥物的吸光度值,計算藥物的累積釋放量。

累積釋放率=累積釋放量/投藥量。

以時間為橫坐標(x)、藥物累積釋放率為縱坐標(y)作圖,結果見圖6。

圖6 GSP、GSP-LPs藥物累積釋放率曲線

分別采用零級釋放動力學方程、一級釋放動力學方程、Higuchi方程、Weibull方程、Ritger-peppas方程對體外釋放結果進行擬合。結果見表4。結果顯示,以Weibull方程擬合時GSP、GSP-LPs均具有較高的擬合度,其相關系數分別為0.998 9、0.998 1,表明二者的釋放規律均符合Weibull方程。

表4 GSP、GSP-LPs藥物累積釋放率曲線方程擬合

3 討論

葡萄籽原花青素由于具有清除自由基、抗氧化活性而成為具有開發潛力的天然抗氧化劑來源。通過劑型設計可以減少藥物自身存在的缺點,增加藥物的生物利用度,使葡萄籽原花青素得到進一步開發、利用。將GSP包載于脂質體后可以增加其溶解度、提高其穩定性,有利于將其開發為緩控釋制劑。有研究表明,由于原花青素的抗氧化效果,將其包載于脂質體可以減少磷脂雙分子層的氧化,同時可以增加藥物的穩定性[18],并且能夠掩蓋葡萄籽原花青素的苦味和澀味,可作為食品和飲料工業中的抗氧化劑[19],使其具有廣泛的應用前景。

在本研究中采用脫氧膽酸鈉作為膜軟化劑制備脂質體,將脫氧膽酸鈉溶于有機系,能夠大大縮短制備過程中的膜洗脫時間,增大脂質體的包封率。在實驗中發現,GSP-LPs的粒徑會隨膽固醇用量的增加逐漸變大,另外延長超聲時間、增大超聲功率可以顯著減小其粒徑,但仍需根據實際情況調整。采用響應曲面法優化GSP-LPs的制備工藝,實驗結果準確、可靠。透皮釋放實驗結果顯示其釋放符合Weibull釋放規律。與游離的藥物相比,GSP-LPs顯著延長了藥物的釋放時間,有望將其制備為緩釋制劑,使GSP得到進一步的開發、利用。