朱砂七堿制前后的化學成分分析

程茜菲,張玩濤,韓小娟,宋小妹

1.陜西國際商貿學院,西安 712046;2.陜西中醫藥大學,西安 712046

朱砂七為蓼科植物毛脈蓼[Polygonumcillinerve(Nakai) Ohwi]的塊根,在我國主要分布于陜西、湖北、四川、貴州和東北等地,在陜西主要分布于秦嶺佛坪和太白山[1],為“太白七藥”之一,且已被《陜西衛生志》列為陜西地道名貴草藥[2]。活性成分研究結果顯示,大黃素為朱砂七的主要活性成分之一,具有抑菌、抗病毒、抗炎和抗潰瘍的活性[3-5]。

《陜西中草藥》記載,朱砂七應用于臨床時,抗菌消炎、順氣活血、涼血止血、鎮痛解痙、止痛止瀉、促進潰瘍愈合應用生品;補腎應用鹽制者;止血應用醋制者;健胃應用堿制者。不同炮制品臨床應用不同,民間治療胃部疾病,如胃炎、消化不良等時常采用堿制者。中藥經炮制后,可能會發生化學成分種類或量的變化,從而使其藥理作用發生變化[6-11]。本研究以指紋圖譜(藥材全貌)結合特征性成分含量測定,對炮制前、后朱砂七化學成分的變化進行分析,為明確朱砂七堿制品臨床治療疾病的藥效物質基礎奠定基礎,為朱砂七臨床合理應用提供理論指導,并為針對朱砂七其他堿制品的研究提供借鑒。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters e2695型高效液相色譜儀、Empower色譜工作站、TE124S型電子分析天平均購自賽多利斯科學儀器(北京)有限公司;Milli-Q Reference超純水儀[默克化工技術(上海)有限公司];超聲清洗器(上海易凈超聲波儀器有限公司)。

1.2 試藥

實驗用朱砂七,生品9批次,購于藥材銷售商;堿制品9批次,自制,均經陜西國際商貿學院雷國蓮教授鑒定為朱砂七的塊根。樣品信息見表1。

表1 樣品信息

大黃素(編號110756-201913)、大黃素甲醚(編號110758-201817)均購自中國藥品生物制品檢定所;甲醇(色譜純,賽默飛世爾科技有限公司);磷酸(分析純,天津市天力化學試劑有限公司);水為超純水;其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱:C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);檢測波長:254 nm;柱溫:35 ℃;流動相:甲醇-10 mL·L-1磷酸水溶液;洗脫方式:梯度洗脫,洗脫程序見表2;進樣量:10 μL。結果見圖1。

注:A.對照品溶液;B.供試品;1～11.共有峰;10.大黃素;11.大黃素甲醚。

表2 洗脫程序

2.2 對照品溶液的制備

2.2.1混合對照品溶液的制備 精密稱取大黃素和大黃素甲醚對照品適量,加甲醇制成每毫升含大黃素0.18 mg、大黃素甲醚0.246 mg的混合對照品溶液。

2.2.2大黃素對照品溶液的配制 精密稱取大黃素對照品適量,加甲醇分別制成質量濃度分別為0.017 8、0.089 0、0.178 0、0.267 0、0.445 0、0.890 0 mg·mL-1的大黃素對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

精密稱定藥材1 g,置于具塞錐形瓶中,精密加入乙醇50 mL,稱定質量,超聲30 min,冷卻至室溫,稱定質量,用上述溶劑補足缺失的質量,混勻,經0.45 μm濾膜過濾,取續濾液,即得。

2.4 方法學考察

2.4.1線性關系考察 將2.2.2項下不同質量濃度大黃素對照品溶液按照2.1項下色譜條件進樣檢測,以質量濃度為橫坐標(x)、峰面積為縱坐標(y)進行線性回歸,得線性回歸方程y=3.7x+1.9×105,r=0.999 8。

2.4.2精密度實驗 將2.2.1項下混合對照品溶液按照2.1項下色譜條件連續測定6次。計算得大黃素和大黃素甲醚對照品峰面積的RSD值均小于2.5%,說明該方法的精密度良好。

2.4.3重復性實驗 取藥材(P9)6份,按照2.3項下方法制備供試品溶液,按照2.1項下色譜條件進行測定。計算得6份樣品11個共有峰峰面積的RSD值均小于3.5%,說明該方法的重復性良好。

2.4.4穩定性實驗 取藥材(P9)1份,按照2.3項下方法制備供試品溶液,按照2.1項下色譜條件,分別于0、2、4、8、12、24 h進行測定。計算得11個共有峰峰面積的RSD值均小于3.5%,說明供試品溶液在12 h內穩定性良好。

2.4.5回收率實驗 取藥材(P9)共9份,于每份樣品中加入大黃素對照品適量,按照2.3項下方法制備供試品溶液,按照2.1項下色譜條件進行測定。結果顯示,回收率在95%～105%范圍內,RSD值為1.19%,說明該方法的準確度良好。結果見表3。

表3 回收率實驗結果

2.5 樣品含量測定

將18批樣品(生品和堿制品),按照2.3項下方法制備供試品溶液,按照2.1項下色譜條件進樣測定,記錄色譜圖,并根據大黃素線性回歸方程計算樣品中大黃素的含量。結果見表4。

表4 樣品中大黃素的含量

3 分析

3.1 指紋圖譜

采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價軟件”(2012版)對朱砂七生品和堿制品圖譜進行分析,朱砂七生品及對照指紋圖譜見圖2,由相似度計算結果可知,生品與其對照指紋圖譜R相似度值均>0.98。朱砂七堿制品及對照指紋圖譜見圖3,由相似度計算結果可知,堿制品色譜圖與其對照指紋圖譜R相似度值均>0.93。朱砂七生品、堿制品色譜圖與生成的對照譜圖R見圖4,由相似度計算結果可知,三者相似度值均>0.897,經比較,朱砂七生品與堿制品色譜圖相似度降低,說明朱砂七通過堿制后化學成分有一定變化。

圖2 9批次朱砂七生品及對照指紋圖譜

圖3 9批次朱砂七堿制品及對照指紋圖譜

圖4 朱砂七生品、堿制品及對照指紋圖譜

3.2 特征性成分(大黃素)含量分析

用SPSS 17.0軟件,以大黃素含量為評價指標,對朱砂七生品和堿制品進行分析。用平方Euclidean distance方法[12-13]進行聚類分析。結果見圖5。

根據圖5可知,當閾值大于20時,S1、S2、S3、S5、S6、S9、P3、P5、P7、P8 10批藥材聚為第一類,其中包含生品6批、堿制品4批;S4、S7、S8、P1、P2、P4、P6、P9 8批聚為第二類,其中包含生品3批、堿制品5批。根據分類結果可知,第一類中生品批次相對較多,第二類中堿制品批次較多,說明大黃素含量在朱砂七不同堿制品中存在一定的差異。通過藥材來源信息可知,堿制品均為實驗室自制。通過對比可知,除生品S5經炮制后大黃素含量無明顯增加外,其他批次的生品經炮制后大黃素的含量均有不同程度的增加,增加最大幅度為13.7 mg·g-1,最小幅度為1.2 mg·g-1。結果見表5。

圖5 聚類分析結果

表5 朱砂七堿制前后大黃素含量的變化

4 討論

中藥化學成分是其治療疾病的物質基礎,不同炮制品臨床應用不同,與其化學成分的差異有一定相關性。本研究通過指紋圖譜和單個成分(大黃素)定性、定量分析發現,朱砂七堿制前、后整體化學成分發生變化,且堿制后大黃素的含量增加。

根據古書記載和民間應用,用朱砂七堿制品治療胃部疾病。目前在針對朱砂七藥理作用的研究中,實驗藥物多用朱砂七總大黃素提取物[14-15],藥理研究表明朱砂七總大黃素具有抗炎作用。大黃素為朱砂七總大黃素重要組成成分之一,已有多篇文獻報道,大黃素具有抑菌[16-17]、抗病毒[18]、抗炎[19]和抗潰瘍活性[20]。

因此,本研究可初步闡明大黃素為朱砂七堿制品治療疾病的物質基礎,為朱砂七堿制品化學成分的研究提供思路,也可為朱砂七質量控制、質量管理提供科學依據。