基于HPLC多指標(biāo)含量測定及化學(xué)計(jì)量學(xué)的養(yǎng)正消積膠囊質(zhì)量評價(jià)

關(guān)麗文,高鑫磊,楊天明

1.海南省腫瘤醫(yī)院臨床藥學(xué)部,海口 570100;2.海南省腫瘤防治中心,?？?570100;3.?？谑兄扑帍S有限公司質(zhì)量管理部,海口 570100;4.廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院中藥學(xué)院,廣州 510520

養(yǎng)正消積膠囊由女貞子、白花蛇舌草、絞股藍(lán)、黃芪、人參等16味中藥加工而成,具有健脾益腎、化瘀解毒的功效,適用于不宜手術(shù)的脾腎兩虛、瘀毒內(nèi)陰型原發(fā)性肝癌的輔助治療[1],與肝內(nèi)動脈介入灌注加栓塞化療合用,有助于提高介入化療的療效,減輕對白細(xì)胞、肝功能、血紅蛋白的毒性作用,提高患者的生存質(zhì)量,改善脘腹脹滿、納呆食少、神疲乏力、腰膝酸軟、溲赤便溏、疼痛等癥狀[2-4]。該制劑由16味中藥配伍,組方頗為復(fù)雜,同時(shí)每味中藥所含藥效成分也較復(fù)雜,且成分間作用協(xié)同。孫悅等[5]對養(yǎng)正消積膠囊的化學(xué)成分進(jìn)行定性分析,共鑒定出20種脂溶性成分和38種水溶性成分。該制劑現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[6]及相關(guān)文獻(xiàn)[7]均只對君藥女貞子所含齊墩果酸和熊果酸進(jìn)行定量分析,不能從根本上控制產(chǎn)品的內(nèi)在質(zhì)量。多成分或多成分與化學(xué)計(jì)量學(xué)結(jié)合的質(zhì)量控制方法越來越多地應(yīng)用于對中藥及其制劑的質(zhì)量分析中[8-10]。本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜法(high performance liquid chromatography,HPLC)對養(yǎng)正消積膠囊中君藥女貞子的主要成分(紅景天苷、女貞苷、特女貞苷),臣藥絞股藍(lán)的主要代表性成分(絞股藍(lán)皂苷XLIX、絞股藍(lán)皂苷A、絞股藍(lán)皂苷XVII)及佐藥白花蛇舌草的主要活性成分(雞矢藤次苷甲酯、車葉草苷酸、車葉草苷)的含量進(jìn)行同時(shí)檢測,首次建立了養(yǎng)正消積膠囊2種以上成分的質(zhì)量評價(jià)方法,同時(shí)用化學(xué)計(jì)量學(xué)方法對10批養(yǎng)正消積膠囊進(jìn)行聚類分析(cluster analysis,CA)和主成分分析(principal component analysis,PCA),總結(jié)養(yǎng)正消積膠囊質(zhì)量規(guī)律,為全面提高該制劑整體質(zhì)量控制水平提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

1200型HPLC儀(美國安捷倫公司);Venusil XBP C18液相色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);KQ3200E型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);QUINTIX35-1CN型十萬分之一電子天平[賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司]。

1.2 試藥

對照品:紅景天苷(批號110818-202009,質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.6%),女貞苷(批號111918-201703,質(zhì)量分?jǐn)?shù)94.4%),特女貞苷(批號111926-201906,質(zhì)量分?jǐn)?shù)95.0%)和絞股藍(lán)皂苷XLIX(批號112033-201902,質(zhì)量分?jǐn)?shù)97.2%)均購自中國食品藥品檢定研究院;雞矢藤次苷甲酯(批號PRF8091244,質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.6%),車葉草苷酸(批號PRF9071721,質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.5%),車葉草苷(批號PRF9120743,質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.2%),絞股藍(lán)皂苷A(批號PRF8042023,質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.4%)和絞股藍(lán)皂苷XVII(批號PRF10022525,質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.9%)均購自成都普瑞法科技開發(fā)有限公司;乙腈為色譜純,其余試劑為分析純。

養(yǎng)正消積膠囊(規(guī)格:每粒裝0.39 g,批號B1907001、B1908001、B1912001、B1912002、B2009001、B2009002、B2011002、B2103001、B2103002、B2103003,編號依次為S1～S10),購自石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 混合對照品溶液的制備

分別精密稱取對照品紅景天苷、女貞苷、特女貞苷、雞矢藤次苷甲酯、車葉草苷酸、車葉草苷、絞股藍(lán)皂苷XLIX、絞股藍(lán)皂苷A和絞股藍(lán)皂苷XVII適量,用體積分?jǐn)?shù)為50%的甲醇制成質(zhì)量濃度依次為0.302、0.578、0.980、0.178、0.116、0.132、0.410、0.734、0.858 g·L-1的混合對照品儲備液。取儲備液適量,用體積分?jǐn)?shù)為50%的甲醇稀釋20倍得混合對照品溶液(9種成分的質(zhì)量濃度分別為15.1、28.9、49.0、8.9、5.8、6.6、20.5、36.7、42.9 mg·L-1)。

2.2 供試品溶液的制備

取養(yǎng)正消積膠囊內(nèi)容物,精密稱定0.5 g,精密加入體積分?jǐn)?shù)50%的甲醇25 mL,稱定質(zhì)量,超聲處理20 min,放冷補(bǔ)質(zhì)量,搖勻,過濾,取續(xù)濾液得養(yǎng)正消積膠囊供試品溶液。取按養(yǎng)正消積膠囊處方和制法分別制備缺女貞子、缺白花蛇舌草、缺絞股藍(lán)的陰性供試品各適量,再按上述方法制得陰性供試品溶液。

2.3 色譜條件與系統(tǒng)適用性

色譜柱:Venusil XBP C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)。柱溫:30 ℃。流動相:乙腈-2 mL·L-1磷酸溶液。梯度洗脫:0～12 min,15.0%乙腈;12～20 min,15.0%→33.0%乙腈;20～30 min,33.0%→65.0%乙腈;30～50 min,65.0%→78.0%乙腈;50～60 min,78.0%→15.0%乙腈。流速:0.9 mL·min-1。檢測波長分別為220 nm(0～21 min檢測紅景天苷、女貞苷和特女貞苷)[11-13]、238 nm(21～32 min檢測雞矢藤次苷甲酯、車葉草苷酸和車葉草苷)[14-18]和203 nm(32～60 min檢測絞股藍(lán)皂苷XLIX、絞股藍(lán)皂苷A和絞股藍(lán)皂苷XVII)[19-21]。進(jìn)樣量:10 μL。在該實(shí)驗(yàn)條件下,理論板數(shù)按所測各成分色譜峰計(jì)均>5 500;養(yǎng)正消積膠囊供試品溶液中所測9種成分與相鄰色譜峰的分離度>1.5;陰性供試品對養(yǎng)正消積膠囊中各成分的檢測無干擾。結(jié)果見圖1。

注:A.混合對照品;B.養(yǎng)正消積膠囊;C.女貞子陰性供試品;D.白花蛇舌草陰性供試品;E.絞股藍(lán)陰性供試品;1.紅景天苷;2.女貞苷;3.特女貞苷;4.雞矢藤次苷甲酯;5.車葉草苷酸;6.車葉草苷;7.絞股藍(lán)皂苷XLIX;8.絞股藍(lán)皂苷A;9.絞股藍(lán)皂苷XVII。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1線性回歸 精密吸取2.1項(xiàng)下儲備液適量,分別用體積分?jǐn)?shù)50%的甲醇溶液稀釋8、10、20、40、100、200倍,搖勻,得一系列混合對照品溶液。精密吸取各混合對照品溶液10 μL,分別注入HPLC儀中,記錄峰面積,以紅景天苷、女貞苷、特女貞苷、雞矢藤次苷甲酯、車葉草苷酸、車葉草苷、絞股藍(lán)皂苷XLIX、絞股藍(lán)皂苷A和絞股藍(lán)皂苷XVII峰面積為y軸,以質(zhì)量濃度為x軸進(jìn)行線性回歸,見表1。結(jié)果表明養(yǎng)正消積膠囊中9種成分在各自質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 線性回歸結(jié)果

2.4.2精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 精密吸取同一份養(yǎng)正消積膠囊供試品溶液10 μL,注入HPLC儀中,記錄色譜峰的峰面積,連續(xù)操作6次,測得紅景天苷、女貞苷、特女貞苷、雞矢藤次苷甲酯、車葉草苷酸、車葉草苷、絞股藍(lán)皂苷XLIX、絞股藍(lán)皂苷A和絞股藍(lán)皂苷XVII峰面積的RSD值依次為1.01%、0.86%、0.53%、1.29%、1.34%、1.16%、0.97%、0.62%、0.59%,表明該條件下儀器的精密度良好。

取同一批養(yǎng)正消積膠囊,按照2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液6份,各精密吸取10 μL,注入HPLC儀中,記錄色譜峰的峰面積并用外標(biāo)法計(jì)算各成分的含量。計(jì)算得9種成分含量的RSD值依次為1.57%、1.36%、1.02%、1.74%、1.85%、1.80%、1.23%、1.15%、1.06%,表明該方法的重復(fù)性良好。取同一份養(yǎng)正消積膠囊供試品溶液,分別于0、2、5、9、14、24 h精密吸取10 μL,注入HPLC儀中,記錄色譜峰的峰面積,結(jié)果顯示,養(yǎng)正消積膠囊供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定,9種成分峰面積的RSD值依次為0.98%、0.83%、0.59%、1.31%、1.28%、1.20%、1.02%、0.65%、0.58%。

2.4.3加樣回收率測定 取已知9種成分含量的同一批養(yǎng)正消積膠囊內(nèi)容物9份,每份精密稱定0.25 g,隨機(jī)均分成3組,精密加入混合對照品溶液(9種成分的質(zhì)量濃度分別為0.209、0.435、0.801、0.116、0.079、0.107、0.283、0.514、0.709 g·L-1)0.8、1.0和1.2 mL,再按照2.2項(xiàng)下方法制成加樣供試品溶液,各精密吸取10 μL,注入HPLC儀中,記錄色譜峰的峰面積,計(jì)算得9種成分的平均加樣回收率及RSD值。結(jié)果見表2。

表2 9種成分的加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.5 含量測定

取養(yǎng)正消積膠囊10批,按照2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液,各精密吸取10 μL,注入HPLC儀中,采用外標(biāo)法計(jì)算各成分的含量。結(jié)果見表3。

3 化學(xué)計(jì)量學(xué)質(zhì)量評價(jià)模式的建立

3.1 聚類分析

用SPSS 26.0軟件對10批養(yǎng)正消積膠囊進(jìn)行CA,將表3中的數(shù)據(jù)導(dǎo)入系統(tǒng),以9種成分的含量為變量,進(jìn)行了聚類分析(聚類方法:組間聯(lián)接;度量區(qū)間:Euclidean距離),見圖2。結(jié)果顯示,10批養(yǎng)正消積膠囊供試品聚為3類,S1～S4為第Ⅰ類,S5～S7為第Ⅱ類,S8～S10為第Ⅲ類。

圖2 聚類分析結(jié)果

表2(續(xù)) 9種成分的加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表3 含量測定結(jié)果 (n=3)

從分類結(jié)果可以看出,養(yǎng)正消積膠囊中紅景天苷、女貞苷、特女貞苷、雞矢藤次苷甲酯、車葉草苷酸、車葉草苷、絞股藍(lán)皂苷XLIX、絞股藍(lán)皂苷A和絞股藍(lán)皂苷XVII含量差異與該制劑生產(chǎn)中所用原藥材種屬、產(chǎn)地以及初加工方法等相關(guān),要求生產(chǎn)企業(yè)穩(wěn)定原藥材來源,從源頭上保證產(chǎn)品質(zhì)量和臨床療效。

3.2 主成分分析

將表3中的數(shù)據(jù)導(dǎo)入SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)軟件,進(jìn)行PCA分析。結(jié)果見表4、表5和圖3。由表4可知,前2種主成分的特征值均大于1,分別為6.540、1.130,對方差的貢獻(xiàn)率分別為72.668%、12.559%,累計(jì)方差貢獻(xiàn)率為85.227%,表明選取前2種主成分即可評價(jià)養(yǎng)正消積膠囊的質(zhì)量。由表5可知,紅景天苷、女貞苷、特女貞苷、雞矢藤次苷甲酯、車葉草苷酸、車葉草苷、絞股藍(lán)皂苷XLIX和絞股藍(lán)皂苷XVII對第一主成分的影響較大;絞股藍(lán)皂苷A在第二主成分有明顯正負(fù)荷值。由圖3可見,10批養(yǎng)正消積膠囊供試品聚為2類,S1～S4為第Ⅰ類,S5～S7為第Ⅱ類,S8～S10為第Ⅲ類,主成分分析散點(diǎn)圖顯示的結(jié)果與聚類分析的結(jié)果一致。

表4 各成分解釋的總方差

表5 養(yǎng)正消積膠囊中9種成分含量測定的相關(guān)性分析

圖3 樣品得分圖

4 討論

4.1 檢測波長的確定

取2.1項(xiàng)下混合對照品溶液,在200～400 nm范圍內(nèi)進(jìn)行紫外光譜掃描,結(jié)果顯示,紅景天苷、女貞苷和特女貞苷在220和280 nm附近有較大的吸收值,雞矢藤次苷甲酯、車葉草苷酸和車葉草苷的最大吸收值出現(xiàn)在230～240nm范圍內(nèi),絞股藍(lán)皂苷XLIX、絞股藍(lán)皂苷A和絞股藍(lán)皂苷XVII呈現(xiàn)末端吸收,綜合考慮各成分的檢測靈敏度并結(jié)合雜質(zhì)干擾情況,最終選用220 nm檢測紅景天苷、女貞苷和特女貞苷,238 nm檢測雞矢藤次苷甲酯、車葉草苷酸和車葉草苷,203 nm檢測絞股藍(lán)皂苷XLIX、絞股藍(lán)皂苷A和絞股藍(lán)皂苷XVII。

4.2 指標(biāo)性成分的選擇

養(yǎng)正消積膠囊由女貞子、白花蛇舌草、絞股藍(lán)、黃芪、人參、靈芝、莪術(shù)、炒白術(shù)、茯苓、土鱉蟲、半枝蓮、白英、蛇莓、雞內(nèi)金、茵陳和徐長卿加工而成。方中黃芪補(bǔ)氣固表,女貞子滋補(bǔ)肝腎,兩者共為君藥,具有提高免疫的功能;人參大補(bǔ)元?dú)?靈芝補(bǔ)陰益精,絞股藍(lán)清熱利濕、解毒消腫,莪術(shù)破血行氣,以上4味藥共為臣藥;白術(shù)和茯苓補(bǔ)脾益氣,半枝蓮、白花蛇舌草、白英和蛇莓可以清熱解毒、散結(jié)消腫、化瘀止血,茵陳清濕熱,雞內(nèi)金消食健脾,土鱉蟲破血逐瘀,以上9味藥共為佐藥;徐長卿解毒止痛,引藥力直達(dá)病灶,為其使藥。諸藥合用,共奏健脾益腎、化瘀解毒之功。為全面評價(jià)養(yǎng)正消積膠囊的內(nèi)在整體質(zhì)量,本實(shí)驗(yàn)選取君藥女貞子的主要成分(紅景天苷、女貞苷、特女貞苷)臣藥絞股藍(lán)的主要代表性成分(絞股藍(lán)皂苷XLIX、絞股藍(lán)皂苷A、絞股藍(lán)皂苷XVII)及佐藥白花蛇舌草的主要活性成分(雞矢藤次苷甲酯、車葉草苷酸、車葉草苷)作為指標(biāo)性成分,采用HPLC法,結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)對其進(jìn)行分析。

4.3 供試品制備方法的優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)在優(yōu)化供試品制備方法時(shí),提取方法采用超聲和回流提取,提取溶劑選用甲醇[16,19-20]、體積分?jǐn)?shù)為70%的甲醇[11]、體積分?jǐn)?shù)為50%的甲醇[17,21]和稀乙醇[8]。結(jié)果顯示,用體積分?jǐn)?shù)為50%的甲醇進(jìn)行超聲提取時(shí),養(yǎng)正消積膠囊中各成分含量較高,且背景干擾少。同時(shí),對提取時(shí)間(10、20、30、40 min)進(jìn)行優(yōu)化,結(jié)果顯示,提取時(shí)間為20 min時(shí),各成分的提取率與提取時(shí)間30 min相當(dāng),30 min以后,出現(xiàn)較多的雜質(zhì)干擾。最終選取體積分?jǐn)?shù)為50%的甲醇提取時(shí)間20 min為供試品提取方法。

4.4 流動相的優(yōu)化篩選

本實(shí)驗(yàn)在篩選流動相時(shí),分別考察了以乙腈-水[19]、乙腈-1 mL·L-1磷酸溶液[12]、乙腈-1 mL·L-1乙酸溶液[15,18]、乙腈-3 mL·L-1甲酸溶液[16]為流動相時(shí)養(yǎng)正消積膠囊中9種成分的分離效果。結(jié)果顯示,乙腈-1 mL·L-1磷酸溶液相對于其他3組流動相,分離度好,基線平穩(wěn),但在變換波長至203 nm檢測絞股藍(lán)皂苷XLIX、絞股藍(lán)皂苷A和絞股藍(lán)皂苷XVII時(shí),基線漂移嚴(yán)重,色譜峰不能正常積分。遂對磷酸溶液的濃度進(jìn)行了探究,同時(shí)對比等度洗脫與梯度洗脫,發(fā)現(xiàn)將乙腈-2 mL·L-1磷酸溶液作為流動相時(shí),可達(dá)到基線分離、各成分響應(yīng)值大的目的,故選擇2.3項(xiàng)下條件對養(yǎng)正消積膠囊中紅景天苷、女貞苷、特女貞苷、雞矢藤次苷甲酯、車葉草苷酸、車葉草苷、絞股藍(lán)皂苷XLIX、絞股藍(lán)皂苷A和絞股藍(lán)皂苷XVII的含量進(jìn)行同時(shí)檢測。

本實(shí)驗(yàn)建立檢測養(yǎng)正消積膠囊中紅景天苷、女貞苷、特女貞苷、雞矢藤次苷甲酯、車葉草苷酸、車葉草苷、絞股藍(lán)皂苷XLIX、絞股藍(lán)皂苷A和絞股藍(lán)皂苷XVII含量的HPLC法,首次應(yīng)用聚類分析和主成分分析,對10批養(yǎng)正消積膠囊中9種成分進(jìn)行降維分析,為多方位評價(jià)養(yǎng)正消積膠囊的內(nèi)在質(zhì)量提供快捷、有效的方法。