頂空氣相色譜法測定美羅培南的殘留溶劑

周震宇,沈 心

蘇州市藥品檢驗檢測研究中心,蘇州 215104

美羅培南為第2代廣譜碳青霉烯類抗生素,大多數革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌對其敏感,臨床主要用于治療多重耐藥菌感染及各種嚴重感染[1-3]。美羅培南的現行質量標準為《中華人民共和國藥典》(以下簡稱《中國藥典》)2020年版二部[4],采用氣相內標法控制溶劑的殘留量,以乙醇為內標,測定產品中丙酮、乙腈、二氯甲烷、乙酸乙酯和四氫呋喃的殘留量。但通過對美羅培南原料藥合成路線的調研,發現不同生產企業的合成工藝略有不同,部分生產企業除現行標準中限制使用的有機溶劑外,還會使用甲醇和乙醇作為溶媒,兩者均為《中國藥典》2020年版四部[5]通則0861和《藥品注冊的國際技術要求(質量部分)》(ICH Q3C)[6]中明確規定需要控制的溶劑。其中甲醇屬于第二類溶劑,應限制使用;乙醇屬于第三類溶劑,為藥品GMP或其他質量要求限制使用的溶劑。故需增加對這2種有機溶劑殘留量的控制[7]。

本文建立同時測定甲醇、乙醇、丙酮、乙腈、二氯甲烷、乙酸乙酯和四氫呋喃的頂空氣相色譜法[8-13],并對收集到的6家生產企業的美羅培南原料藥進行檢測,經方法學驗證,該方法準確、可靠。相較于現行質量標準和已報道的文獻中的方法[14-16],本文選擇外標法進行定量分析,將原檢測方法中的內標乙醇作為待測組分之一,使目標組分更全面,可覆蓋國內美羅培南原料藥不同生產企業所使用的有機溶劑,且樣品處理步驟便捷,具有廣泛適用性,能夠有效控制產品質量以保證藥品的安全性。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 7890B/7697A型氣相色譜儀、Agilent OpenLab Acquisition CDS 2.4色譜數據處理工作站(美國安捷倫科技有限公司);XSE205DU型電子天平(瑞士梅特勒-托利多公司)。

1.2 試藥

乙腈(批號U3YA1H,體積分數99.99%),甲醇(批號U81G1H,體積分數99.99%)均購自霍尼韋爾中國有限公司;四氫呋喃(批號WXBD0097V,體積分數99.9%,默克Sigma-aldrich公司);無水乙醇(批號20210119,體積分數99.7%),乙酸乙酯(批號20170824,體積分數99.5%),丙酮(批號20140107,體積分數99.5%),二氯甲烷(批號20160307,體積分數99.5%),均購自國藥集團化學試劑有限公司;水為超純水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

以體積分數6%氰丙基苯基-體積分數94%二甲基聚硅氧烷為固定相的毛細管氣相色譜柱(DB-624 30 mm×0.32 mm,1.80 μm);載氣為氮氣;流速為1 mL·min-1;柱溫為40 ℃;進樣口溫度為140 ℃,火焰離子化檢測器(flame ionization detector,FID)溫度為250 ℃;采用頂空分流進樣,分流比為5∶1;頂空瓶平衡溫度為90 ℃,平衡時間為30 min。

2.2 溶液的制備

2.2.1對照品溶液的制備 精密稱定丙酮2.0 g、乙腈170 mg、二氯甲烷240 mg、乙酸乙酯2.0 g、四氫呋喃290 mg、乙醇2.0 g、甲醇1.2 g,置于100 mL量瓶中,用水稀釋至刻度,搖勻;精密量取上述溶液1 mL,置于100 mL量瓶中,用水稀釋至刻度,搖勻;精密量取上述溶液5 mL,置于20 mL頂空瓶中,搖勻,密封,即得。

2.2.2供試品溶液的制備 精密稱定美羅培南細粉0.2 g,置于20 mL頂空瓶中,精密加入水5 mL,搖勻,密封,即得。

2.2.3空白溶液的制備 精密量取水5 mL,置于20 mL頂空瓶中,密封,即得。

2.3 專屬性實驗

取上述對照品溶液、供試品溶液和空白溶液按照2.1項下色譜條件進樣檢測,各組分色譜峰的理論板數均不低于5 000,各色譜峰達到基線分離,空白溶液對測定無干擾。結果見圖1。

注:A.空白溶液;B.對照品溶液;C.廠家A供試品溶液;D.廠家F供試品溶液;1.甲醇;2.乙醇;3.丙酮;4.乙腈;5.二氯甲烷;6.乙酸乙酯;7.四氫呋喃。

2.4 線性與范圍

配制含丙酮、乙腈、二氯甲烷、乙酸乙酯、四氫呋喃、乙醇和甲醇的質量濃度分別為41.08、3.59、5.06、104.67、5.71、41.47、24.02 mg·mL-1的混合對照品儲備液,逐級稀釋配制線性系列溶液,按照2.1項下方法進行檢測,記錄色譜峰面積,以峰面積為橫坐標(x)、質量濃度為縱坐標(y)進行線性回歸。結果見表1。

表1 各組分線性關系、定量限和檢測限

2.5 精密度實驗

取對照品溶液,重復進樣6次,記錄峰面積。計算得丙酮、乙腈、二氯甲烷、乙酸乙酯、乙醇、甲醇和四氫呋喃峰面積的RSD值分別為3.81%、2.65%、5.33%、4.37%、2.19%、1.04%、4.12%,表明儀器具有良好的精密度。

2.6 重復性實驗

平行制備6份供試品溶液(廠家A,批號821048 02),6份樣品均僅檢出丙酮,丙酮殘留量的RSD值為2.50%,表明該方法的重復性良好。

2.7 穩定性實驗

取對照品溶液,分別于室溫下放置0、2、4、6、8、24 h,按照2.1項下方法測定,結果丙酮、乙腈、二氯甲烷、乙酸乙酯、乙醇、甲醇和四氫呋喃峰面積的RSD值分別為4.70%、3.64%、6.10%、5.70%、3.16%、2.54%、5.19%,表明對照品溶液在24 h內基本穩定。

2.8 回收率實驗

精密稱定供試品(廠家A,批號82104802)細粉約0.2 g,共9份,置于20 mL頂空瓶中,按低、中、高3個質量濃度分別精密加入丙酮、乙腈、二氯甲烷、乙酸乙酯、乙醇、甲醇和四氫呋喃混合對照品溶液5 mL,密塞,搖勻,按照2.1項下色譜條件檢測,用外標法以峰面積計算加樣回收率。結果見表2。

表2 殘留溶劑回收率實驗結果

2.9 樣品測定結果

對由6家美羅培南原料藥生產企業提供的原料藥樣品進行殘留溶劑檢測,結果見表3。

表2(續) 殘留溶劑回收率實驗結果

表3 各生產企業美羅培南殘留溶劑測定結果

由表3可知,由于各生產企業美羅培南原料藥生產工藝存在差異,故各生產企業殘留溶劑控制情況各有不同,本文建立的美羅培南殘留溶劑測定法可有效區別美羅培南的生產工藝,控制溶劑的殘留量。

3 討論

3.1 方法的選擇

由于部分企業在美羅培南的合成過程中使用乙醇,產品中可能會有一定量的乙醇殘留,與現行執行標準中選擇乙醇作為內標相沖突,現行標準對部分企業生產的美羅培南原料藥殘留溶劑的測定結果存在干擾。因此,建立頂空氣相外標法,同時測定甲醇、乙醇、丙酮、乙腈、二氯甲烷、乙酸乙酯和四氫呋喃含量,具有更廣泛的適用性。

3.2 溶劑的選擇

現行質量標準中對照品以水作溶劑,美羅培南以質量濃度為10 g·L-1的碳酸鈉溶液作溶劑,新增甲醇和乙醇2個組分,溶液中的鈉鹽可能會影響頂空瓶內的蒸汽壓,影響最終的檢測結果。經實驗對比發現,碳酸鈉的存在會對乙醇和乙酸乙酯的出峰造成影響,與以水作溶劑的對照品溶液相比,以質量濃度為10 g·L-1的碳酸鈉溶液為溶劑的對照品溶液中,乙醇峰增大約0.5倍,乙酸乙酯峰消失,不同溶劑對供試品溶液的測定結果無影響,因此統一選擇水作為溶劑。

3.3 限度討論

參考現行質量標準及《中國藥典》2020年版四部通則0861殘留溶劑測定法[17-18],7種有機溶劑的限度分別為甲醇0.3%、乙醇0.5%、丙酮0.5%、乙腈0.041%、二氯甲烷0.06%、乙酸乙酯0.5%、四氫呋喃0.072%。參考ICH Q3C指導原則[19-20],生產企業也可以根據制劑的日用量及殘留溶劑的每日允許最大暴露量(permitted daily exposure,PDE)進行風險評估后,確立限度,建議各生產企業可適當收緊限度。