沉默lncRNA SNHG22上調(diào)miR-27a-3p增強乳腺癌細胞的耐藥性

趙曉燕,謝 競,吳 迪,李軍濤

1.鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院乳腺外科,鄭州 450000;2.河南省腫瘤醫(yī)院乳腺科,鄭州 450000

乳腺癌是女性常見的一種惡性腫瘤,多發(fā)生于年輕女性,發(fā)病率呈逐年上升的趨勢。阿霉素(adriamycin,ADM)是用于治療乳腺癌的化療藥物。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是一類不被翻譯成蛋白質(zhì)的RNA,通過吸附于miRNA在腫瘤細胞增殖、遷移、浸潤過程中發(fā)揮調(diào)控作用[1-2],此外,miRNA可增強癌細胞對化療藥物的敏感性[3-4]。長鏈非編碼RNA核仁小RNA宿主基因22(long non-coding RNA small nucleolar RNA host gene 22,lncRNA SNHG22)與卵巢癌的預(yù)后不良和化療耐藥密切相關(guān)[5]。miR-27a作為一種致癌基因,其通過在乳腺癌細胞中表達上調(diào),調(diào)節(jié)細胞的耐藥過程[6]。本研究旨在探討lncRNA SNHG22是否能通過miR-27a調(diào)節(jié)乳腺癌細胞對ADM的耐藥性。

1 儀器與材料

1.1 儀器

超凈工作臺(沈陽市醫(yī)療器械二廠);培養(yǎng)箱(美國NAPCO公司);流式細胞儀(美國Coulter公司)。

1.2 試藥

阿霉素(深圳萬樂藥業(yè)有限公司);MTT試劑盒、GAPDH、P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)抗體均購自美國Abcam公司;乳腺癌耐藥蛋白(breast cancer resistant protein,BCRP/ABCG2)抗體(武漢博士德生物技術(shù)有限公司);含有siSNHG22、siSNHG22-NC、SNHG22、SNHG22-NC的pcDNA3.1重組質(zhì)粒(上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司);HRP標記的山羊抗兔二抗(美國Sigma公司);DMEM培養(yǎng)基(美國Gibco公司)。

1.3 細胞

人乳腺癌細胞株MCF-7,購自中國科學(xué)院上海生物所。

2 方法

2.1 建立MCF-7/ADM耐藥細胞株

將MCF-7細胞培養(yǎng)于含體積分數(shù)10%胎牛血清、100 u·mL-1青霉素和100 u·mL-1鏈霉素的培養(yǎng)基中,置于37 ℃、體積分數(shù)5%二氧化碳、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞達到90%融合時,用胰蛋白酶消化,傳代。

采用ADM低質(zhì)量濃度加量持續(xù)誘導(dǎo)的方法[7]建立MCF-7/ADM耐藥細胞株,ADM的質(zhì)量濃度依次為100、200、300、400、500 ng·mL-1。取處于對數(shù)生長期的MCF-7細胞,制成細胞懸液,細胞密度為5×107個·mL-1,取10 mL細胞懸液接種于培養(yǎng)瓶中,24 h后,加入質(zhì)量濃度為100 ng·mL-1的ADM,置于培養(yǎng)箱中孵育48 h,棄去培養(yǎng)基,用PBS清洗2次,加入新鮮不含ADM的培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h,按照上述步驟反復(fù)培養(yǎng),最終MCF-7/ADM耐藥細胞系可耐受質(zhì)量濃度為500 ng·mL-1的ADM。所有耐藥實驗需在撤去ADM 2周后進行。

2.2 耐藥指數(shù)測定

分別取處于對數(shù)生長期的MCF-7細胞和經(jīng)不同質(zhì)量濃度ADM處理的MCF-7/ADM細胞,制成單細胞懸液,細胞密度為1×105個·mL-1,接種于96孔板,每組設(shè)置5個復(fù)孔,每孔加入細胞懸液100 μL,另設(shè)空白組(僅加入培養(yǎng)基)。將細胞置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后,空白組每孔加入培養(yǎng)基200 μL,MCF-7/ADM組每孔加入含不同質(zhì)量濃度ADM的培養(yǎng)基200 μL,繼續(xù)培養(yǎng)72 h,取出96孔板,每孔加入MTS單溶液20 μL,將96孔板置于酶標儀上,于波長490 nm處測得吸光度(A),計算細胞增殖抑制率。細胞增殖抑制率=(1-實驗孔A值/對照孔A值)×100%。用50%抑制濃度(IC50)計算軟件得出各組IC50值。

耐藥指數(shù)=耐藥細胞IC50值÷親本細胞IC50

2.3 細胞轉(zhuǎn)染

取處于對數(shù)生長期的MCF-7/ADM細胞(用質(zhì)量濃度為500 ng·mL-1的ADM處理),隨機分為MCF-7/ADM組、si-NC組、si-SNHG22組、SNHG22 -NC組和SNHG22組。制成細胞密度為1×105個·mL-1的細胞懸液,接種于96孔板,每孔加入細胞懸液1 mL。置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng),待細胞貼壁生長后,si-NC組轉(zhuǎn)染陰性對照質(zhì)粒,si-SNHG22組轉(zhuǎn)染SNHG22沉默質(zhì)粒,SNHG22-NC組轉(zhuǎn)染SNHG22過表達陰性對照質(zhì)粒,SNHG22組轉(zhuǎn)染SNHG22過表達質(zhì)粒。24 h后,在顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效果,當(dāng)轉(zhuǎn)染成功率達到85%時,進行后續(xù)實驗。

2.4 MTT法檢測細胞存活率

轉(zhuǎn)染成功后繼續(xù)培養(yǎng)24 h,加入質(zhì)量濃度為5 mg·mL-1的MTT 20 μL,37 ℃避光振蕩10 min,置于酶標儀上,測定490 nm波長處的吸光度(A),計算細胞存活率。細胞存活率=(藥物組A值/空白組A值)×100%。

2.5 流式細胞儀檢測細胞凋亡率

轉(zhuǎn)染成功后繼續(xù)培養(yǎng)24 h,用胰蛋白酶消化,以3 000 r·min-1離心10 min,離心半徑為8 cm,收集細胞。用500 μL binding buffer重懸細胞,加入annexin V-FITC結(jié)合液5 μL,混勻,再加入碘化丙啶10 μL混勻,避光冰浴15 min,用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

2.6 雙熒光素酶報告基因檢測lncRNA SNHG22和miR-27a-3p的靶向關(guān)系

通過生物信息學(xué)分析軟件檢測到SNHG22與miR-27a-3p存在結(jié)合位點。將該結(jié)合位點的序列片段進行克隆,插入熒光素酶報告基因質(zhì)粒中,構(gòu)建野生型SNHG22報告基因質(zhì)粒(SNHG22-wt)和突變型SNHG22報告基因質(zhì)粒(SNHG22-mut)。將2種質(zhì)粒分別與miR-27a-3p mimic和miR-27a-3p mimic-NC共轉(zhuǎn)染到MCF-7/ADM細胞,培養(yǎng)24 h后,以3 000 r·min-1離心15 min,離心半徑為8 cm,用熒光素酶試劑盒檢測各組細胞熒光素酶的活性。以海參熒光素酶的發(fā)光強度與螢火蟲熒光素酶發(fā)光強度的比值反映SNHG22與miR-27a-3p的結(jié)合強度。

2.7 qRT-PCR檢測miR-27a-3p和lncRNA SNH G22的表達

轉(zhuǎn)染成功后繼續(xù)培養(yǎng)24 h,用胰蛋白酶消化,以3 000 r·min-1離心15 min,離心半徑8 cm,收集細胞。用Trizol試劑盒提取細胞中的總RNA,按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書中的步驟逆轉(zhuǎn)錄出cDNA,配制熒光定量PCR反應(yīng)體系,95 ℃ 2 min;95 ℃ 30 s;58 ℃ 40 s;共40個循環(huán)。用熒光定量PCR儀測定lncRNA SNHG22和miR-27a-3p的表達水平,所有組均進行5次重復(fù)操作。分別以GAPDH和U6為內(nèi)參,用2-CT法計算lncRNA SNHG22和miR-27a-3p相對表達水平。引物序列見表1。

表1 lncRNA SNHG22和miR-27a-3p引物序列

2.8 蛋白印跡法檢測耐藥蛋白的表達

轉(zhuǎn)染成功后繼續(xù)培養(yǎng)24 h,收集細胞,加入裂解液,于冰上靜置30 min。用BCA試劑盒測定蛋白濃度,加入蛋白上樣緩沖液,100 ℃煮沸10 min,使蛋白變性,配制濃縮膠和分離膠,每個樣品上樣20 μL。120 V恒壓電泳1.5 h后,取下凝膠進行濕轉(zhuǎn),0.3 A恒流濕轉(zhuǎn)2 h。室溫封閉1 h,加入P-gp、BCRP、GAPDH一抗(1∶1 000),置于4 ℃孵育過夜,用TBST洗膜3次,每次5 min,加入二抗(1∶5 000)室溫孵育2 h,用TBST洗膜3次,每次5 min。用ECL法顯色,用Image J軟件分析各蛋白條帶灰度值,以目的蛋白條帶灰度值與GAPDH條帶灰度值的比值作為目的蛋白的表達量。

2.9 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 耐藥指數(shù)測定結(jié)果

MCF-7細胞經(jīng)不同質(zhì)量濃度ADM處理后,均出現(xiàn)耐藥性,且耐藥指數(shù)隨ADM質(zhì)量濃度的增大而升高。結(jié)果見表2。

表2 各組耐藥指數(shù)比較

3.2 lncRNA SNHG22相對表達量檢測結(jié)果

lncRNA SNHG22相對表達量組間比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);與MCF-7/ADM組和si-NC組比較,si-SNHG22組lncRNA SNHG22的相對表達量降低(P<0.05);與MCF-7/ADM組和SNHG22-NC組比較,SNHG22組lncRNA SNHG22的相對表達量升高(P<0.05);與si-SNHG22組比較,SNHG22組lncRNA SNHG22的相對表達量升高(P<0.05)。結(jié)果見表3。

表3 各組細胞lncRNA SNHG22表達水平比較

3.3 細胞存活率檢測結(jié)果

與MCF-7/ADM組比較,si-NC組、si-SNHG22組、SNHG22-NC組細胞存活率的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);與si-SNHG22組比較,SNHG22組細胞的存活率降低(P<0.05)。結(jié)果見表4。

表4 各組細胞存活率比較

3.4 細胞凋亡率檢測結(jié)果

與MCF-7/ADM組和si-NC組比較,si-SNHG22組細胞的凋亡率降低(P<0.05);與MCF-7/ADM組和SNHG22-NC組比較,SNHG22組細胞的凋亡率升高(P<0.05);與si-SNHG22組比較,SNHG22組細胞的凋亡率升高(P<0.05)。結(jié)果見表5。

表5 各組細胞凋亡率比較

3.5 雙熒光素酶報告基因檢測結(jié)果

轉(zhuǎn)染miR-27a-3p mimic可明顯抑制SNHG22-wt相對熒光素酶活性,對SNHG22-mut無明顯影響。結(jié)果見圖1、表6。

圖1 lncRNA SNHG22與miR-27a-3p的結(jié)合位點

表6 各組相對熒光素酶活性比較

3.6 miR-27a-3p相對表達量檢測結(jié)果

miR-27a-3p相對表達量組間比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);與MCF-7/ADM組和si-NC組比較,si-SNHG22組miR-27a-3p的相對表達量升高(P<0.05);與MCF-7/ADM組和SNHG22-NC組比較,SNHG22組miR-27a-3p的相對表達量降低(P<0.05);與si-SNHG22組比較,SNHG22組miR-27a-3p的相對表達量降低(P<0.05)。結(jié)果見表7。

表7 各組細胞miR-27a-3p表達量的比較

3.7 耐藥蛋白P-gp、BCRP表達量檢測結(jié)果

P-gp、BCRP蛋白相對表達量組間比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);與MCF-7/ADM組和si-NC組比較,si-SNHG22組P-gp、BCRP蛋白的相對表達量升高(P<0.05);與MCF-7/ADM組和SNHG22-NC組比較,SNHG22組P-gp、BCRP蛋白的相對表達量降低(P<0.05);與si-SNHG22組比較,SNHG22組P-gp、BCRP蛋白的相對表達量降低(P<0.05)。結(jié)果見表8、圖2。

表8 各組細胞P-gp、BCRP蛋白相對表達量比較

注:A.MCF-7/ADM組;B.si-NC組;C.si-SNHG22組;D.SNHG22-NC組;E.SNHG22組。

4 討論

乳腺癌是一種高度異質(zhì)性的惡性腫瘤,在組織形態(tài)、生物學(xué)行為及免疫表型等方面存在巨大差異,給醫(yī)療系統(tǒng)和個人帶來了沉重的負擔(dān)[8]。目前,對于癌癥的治療常以手術(shù)切除為主,化療為輔,但長時間應(yīng)用化療藥物,導(dǎo)致癌細胞出現(xiàn)耐藥性,極大降低化療藥物的治療效果。癌細胞多藥耐藥機制復(fù)雜,多種因素可導(dǎo)致癌細胞出現(xiàn)耐藥性,多藥耐藥蛋白高表達是主要原因,參芪扶正注射液通過降低多藥耐藥相關(guān)蛋白7增強非小細胞肺癌對紫杉醇和吉西他濱的敏感性[9]。

通過將質(zhì)量濃度遞增的ADM持續(xù)作用于乳腺癌MCF-7細胞,建立MCF-7/ADM耐藥細胞株,檢測耐藥指數(shù)。結(jié)果顯示,MCF-7/ADM細胞的耐藥性隨ADM質(zhì)量濃度的提高逐漸增強。lncRNA CASC9促進非小細胞肺癌對吉非替尼的耐藥性[10];lncRNA ZXF1表達水平升高促進肺癌細胞順鉑耐藥[11];lncRNA PCAT-1沉默增強非小細胞肺癌細胞對吉非替尼的敏感性[12]。lncRNA SNHG22已被報道通過結(jié)合miRNA,促進骨肉瘤細胞、食管癌細胞及甲狀腺癌細胞的增殖和遷移[13-15]。本實驗的結(jié)果表明,沉默lncRNA SNHG22對細胞生存率無影響,過表達可降低細胞生存率,沉默lncRNA SNHG22細胞凋亡率降低,過表達后凋亡率升高。實驗結(jié)果提示lncRNA SNHG22參與調(diào)控MCF-7/ADM細胞的耐藥性。

miR-27a是細胞內(nèi)高度保守的非編碼RNA,在前列腺癌、肝癌以及骨肉瘤的耐藥過程中具有調(diào)節(jié)作用,靶向調(diào)控miR-27a的表達或作用于其上、下游信號可逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥性[16-18]。熒光素酶報告基因檢測法證明lncRNA SNHG22與miR-27a-3p具有結(jié)合位點,沉默lncRNA SNHG22能夠使MCF-7/ADM細胞中miR-27a-3p的表達水平上調(diào)。P-gp和BCRP蛋白是與耐藥性密切相關(guān)的蛋白質(zhì)。P-gp是一種多藥耐藥泵,具有同時結(jié)合多種藥物分子的能力,它的混雜性是癌細胞產(chǎn)生多藥耐藥性的主要原因,通過外轉(zhuǎn)運機制將多種藥物分子泵出細胞外,從而降低腫瘤細胞對藥物的敏感度[19]。BCRP作為一種ATP依賴性藥物外排轉(zhuǎn)運蛋白,廣泛存在于細胞膜上,其可能主要通過參與膜內(nèi)、外藥物轉(zhuǎn)運發(fā)揮作用[20]。本研究中,沉默lncRNA SNHG22后,P-gp和BCRP蛋白的表達量升高,而lncRNA SNHG22過表達則降低P-gp和BCRP蛋白的表達量。實驗結(jié)果表明,lncRNA SNHG22可調(diào)節(jié)P-gp和BCRP蛋白的表達水平。

綜上所述,沉默lncRNA SNHG22增強乳腺癌MCF-7細胞的耐藥性,其可能的機制是上調(diào)miR-27a-3p,提高P-gp和BCRP蛋白的表達水平,為臨床治療乳腺癌提供潛在的治療靶點。