脂肪乳改善布比卡因致大鼠心臟毒性機制的研究

張淑娟,孟令群,黃翠影,韓慶波,蔡立松,李 軍*

1.唐山市開灤總醫院手麻科,唐山 063000;2.唐山市婦幼保健院兒內科,唐山 063000

布比卡因(bupivacaine,BPV)是臨床上常用的一種長效酰胺類局部麻醉藥,具有高效、長效、價格低廉等優點[1]。但BPV局部吸收過量或因操作不慎誤入血管會導致血漿藥物濃度迅速升高,一旦超過機體耐受能力,就會引起致命的心臟中毒反應,甚至導致心臟停搏[2]。腎上腺素是治療心血管系統功能衰竭的首選藥物,但其無法糾正由BPV引起的心臟功能抑制,反而會加重臨床患者的中毒癥狀[3]。脂肪乳(lipid emulsion,LE)是能量和脂肪酸的供體,其對臟器的保護作用越來越受到學者們的關注,有研究表明其能夠有效治療由局部麻醉藥引起的全身毒性[4]。近年來,有臨床個案和動物實驗表明,LE對BPV所致的心臟毒性具有良好的救治作用[5-6]。PARTOWNAVID P等[7]認為,LE減輕BPV所致的心臟毒性可能與脂肪酸氧化以及抑制線粒體通透性轉運孔的開放有關。本研究旨在探究LE改善BPV致大鼠心臟毒性的機制。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Ti2型倒置顯微鏡(日本Nikon公司);SEN27103型電子刺激器(美國IonOptix公司);Allegra TM 1E-80K型高速離心機(德國Eppendorf公司);心電圖儀(BL-420 F型生物機能實驗系統,成都泰盟科技有限公司);Tanon 2500型多功能凝膠成像系統(上海天能科技有限公司)。

1.2 試藥

質量濃度為0.234 g·mL-1的LE注射液(華瑞制藥有限公司);質量濃度為5 g·L-1的鹽酸布比卡因注射液(蕪湖康奇制藥有限公司);生理鹽水(四川科倫藥業股份有限公司);應激指標與心肌酶相關指標檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所);BCA蛋白濃度試劑盒(碧云天生物技術研究所);B淋巴細胞瘤-2(B cell lymphoma-2,Bcl2)、Bcl2相關X蛋白(Bcl2 associated X protein,Bax)、cleaved caspase-3、cleaved caspase-9、細胞外調節蛋白激酶1/2(extracellular regulated protein kinases 1/2,ERK1/2)、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)、p38、p-ERK1/2、p-JNK、p-p38和GAPDH一抗(美國Thermo Fisher Scientific公司);HRP標記IgG二抗(英國Abcam公司)。

1.3 動物

50只成年雄性SD大鼠,體質量280～350 g,由醫院實驗動物中心提供,許可證號SCXK(蘇)2018-0315。飼養條件和流程均符合《實驗動物管理條例》,在適宜的條件下[溫度(21±2) ℃,濕度45%～65%,12 h光/暗循環]進行飼養,大鼠自由飲水和進食。適應性喂養7 d后用于實驗。所有實驗均經過醫院實驗動物倫理委員會審批。

2 方法

2.1 分組及實驗模型制備

將30只大鼠分為3組,空白對照組、布比卡因對照組和布比卡因+脂肪乳組。空白對照組不做任何處理;用布比卡因對照組和布比卡因+脂肪乳組構建心臟毒性模型。對用于造模的大鼠,緩慢腹腔注射質量濃度為100 g·L-1的水合氯醛(3 mL·kg-1)進行麻醉,將大鼠以仰臥位固定于手術操作臺上,用3根針式電極針分別插入大鼠左、右上肢及左下肢皮下,監測標準Ⅱ導聯心電圖(electrocardiogram,ECG)。刮凈大鼠左頸部體毛,消毒鋪巾,斜行切開皮膚1～2 cm,鈍性分離皮下組織和肌肉,使其左頸總動脈暴露,阻斷近心端血管,并置入24 G套管針穿刺動脈,置入導管,連接壓力傳感器,用于監測平均動脈壓(mean arterialpressure,MAP)。刮凈大鼠右頸部和大腿根部體毛,消毒鋪巾,斜行切開皮膚1～2 cm,鈍性分離皮下組織和肌肉,使其右頸內動脈、股靜脈暴露,置入24 G套管針,用于給藥。大鼠經20 s靜脈注射質量濃度為5 g·L-1的布比卡因30 mg·kg-1誘發心臟停搏,以構建局麻藥致大鼠心臟毒性模型。復蘇時,布比卡因+脂肪乳組大鼠靜脈注射質量濃度為0.234 g·mL-1的脂肪乳劑5 mL·kg-1,布比卡因對照組靜脈注射生理鹽水負荷量5 mL·kg-1,隨后均以1 mL·kg-1·min-1的速度靜脈輸注3 min。于大鼠自主循環恢復120 min時將其處死,取左心臟組織。

2.2 各組大鼠心電圖測定

緩慢腹腔注射質量濃度為100 g·L-1的水合氯醛(3 mL·kg-1)麻醉大鼠,將大鼠以仰臥位固定于手術操作臺上,將心電圖儀針狀電極與大鼠連接,記錄各組大鼠的心電圖。

2.3 心臟毒性大鼠心肌組織病理學形態評估

心肌組織標本用質量濃度為100 g·L-1的中性福爾馬林固定,用石蠟包埋,5 μm厚度切片,用蘇木精和伊紅染色,通過HE染色切片觀察心肌組織病理變化,由2名資深的組織病理工作者隨機盲評。

2.4 應激指標與心肌酶相關指標檢測

處死各組大鼠前,進行腹主動脈取血,分離血清,用試劑盒檢測血清氧化應激指標超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)的活性,丙二醛(malondialdehyde,MDA)、谷胱甘肽(glutathione,GSH)、NADPH氧化酶-2(NADPH oxidase 2,NOX-2)和一氧化氮水平及心肌酶相關指標肌酸激酶同工酶MB(creatine kinase MB,CK-MB)、心肌肌鈣蛋白T(cardiac troponin-T,cTn-T)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)和腦鈉肽(brain natriuretic peptide,BNP)的水平。

2.5 Western blot檢測心肌組織凋亡相關蛋白與絲裂原活化蛋白激酶信號通路相關蛋白的表達

取適量心肌組織加入RIPA裂解,置于冰上振蕩40 min,4 ℃12 000 r·min-1離心10 min,取上清,用BCA法檢測樣品蛋白濃度,定量至50～70 μg;經SDS-PAGE電泳,并轉移至聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜,加入質量濃度為50 g·L-1脫脂牛奶,封閉1.5 h,分別加入一抗稀釋液[Bcl2(1∶1 000)、Bax(1∶2 000)、cleaved caspase-3(1∶2 000)、cleaved caspase-9(1∶2 000)、ERK1/2(1∶2 000)、JNK(1∶1 000)、p38(1∶1 000)、p-ERK1/2(1∶250)、p-JNK(1∶1 000)、p-p38(1∶1 000)和GAPDH(1∶10 000)],4 ℃孵育過夜,加入辣根過氧化酶標記的二抗,室溫孵育1.5 h,滴加ECL發光液,反應30 s,用多功能凝膠成像系統進行檢測,并用Image J軟件計算灰度值。

2.6 統計學方法

3 結果

3.1 LE對BPV致心臟毒性大鼠心電圖的影響

與空白對照組比較,布比卡因對照組大鼠的心電圖出現明顯異常,表現為ST段改變,給予LE處理后,大鼠心電圖異常明顯改善。結果見圖1。

注:A.空白對照組;B.布比卡因對照組;C.布比卡因+脂肪乳組。

3.2 LE對BPV致心臟毒性大鼠心肌組織病理學的影響

空白對照組大鼠心肌細胞結構完整,心肌纖維排列整齊,心肌細胞未出現萎縮或肥大;布比卡因對照組大鼠心肌細胞出現明顯肥大、壞死,損傷嚴重,心肌纖維排列紊亂,出現炎性細胞浸潤;給予LE處理后,大鼠心肌細胞肥大、壞死明顯減輕,心肌纖維排列較整齊,炎性細胞浸潤明顯減輕。結果見圖2。

注:A.空白對照組;B.布比卡因對照組;C.布比卡因+脂肪乳組;*表示廣泛分離和破壞的壞死心肌纖維區域。

3.3 LE對BPV致心臟毒性大鼠心肌酶相關指標的影響

與空白對照組比較,布比卡因對照組大鼠血清CK-MB、cTn-T、LDH和BNP的水平明顯升高(P<0.05);與布比卡因對照組相比,布比卡因+脂肪乳組大鼠血清CK-MB、cTn-T、LDH和BNP的水平明顯降低(P<0.05)。結果見表1。

表1 各組大鼠心肌酶相關指標比較

3.4 LE對BPV致心臟毒性大鼠應激指標的影響

與空白對照組比較,布比卡因對照組大鼠血清SOD活性、GSH水平明顯降低(P<0.05),MDA、NOX-2和一氧化氮水平明顯升高(P<0.05);與布比卡因對照組相比,布比卡因+脂肪乳組大鼠血清SOD活性、GSH水平明顯升高(P<0.05),MDA、NOX-2和一氧化氮水平明顯降低(P<0.05)。結果見表2。

表2 各組大鼠應激指標比較

3.5 LE對BPV致心臟毒性大鼠心肌組織凋亡相關蛋白表達的影響

與空白對照組比較,布比卡因對照組大鼠心肌組織Bcl2蛋白的表達水平明顯降低(P<0.05),Bax、cleaved caspase-3和cleaved caspase-9蛋白的表達水平明顯升高(P<0.05);給予LE處理后,Bcl2蛋白的表達水平明顯升高(P<0.05),Bax、cleaved caspase-3和cleaved caspase-9蛋白的表達水平明顯降低(P<0.05)。結果見圖3。

注:A.凋亡相關蛋白Western blot檢測結果;B.凋亡相關蛋白相對表達量的比較,與空白對照組比較,*P<0.05;與布比卡因對照組比較,#P<0.05。

3.6 LE對BPV致心臟毒性大鼠心肌組織MAPK信號通路的影響

與空白對照組相比,布比卡因對照組大鼠心肌組織ERK1/2、JNK和p38的磷酸化水平升高(P<0.05);給予LE處理后,ERK1/2、JNK和p-38的磷酸化水平明顯降低(P<0.05)。結果見圖4。

注:A～C.p-ERK1/2、ERK1/2、p-JNK、JNK、p-p38和p38 Western blot檢測結果;D～F.p-ERK1/2、ERK1/2、p-JNK、JNK、p-p38和p38蛋白相對表達量的比較,與空白對照組比較,*P<0.05;與布比卡因對照組比較,#P<0.05。

4 討論

BPV一旦誤入血管將會發生嚴重的不良反應,尤其是對心臟和大腦的影響更大[8]。BPV致心臟毒性可引起心臟停搏,目前認為BPV引起心臟驟停的機制主要有兩點:第一,通過影響心臟電傳導引起室性心率失常;第二,通過抑制線粒體產生ATP,從而抑制心肌能量代謝過程[9-10]。因此尋找一種治療BPV致心臟毒性的有效方法具有重要的臨床意義。

動物實驗及離體心臟模型實驗[11-12]結果表明,LE治療可降低BPV誘導所致的細胞死亡,促進心臟功能的恢復。有臨床個案報道,LE能夠復蘇酰胺類局部麻醉藥物中毒導致的心臟停搏[13]。但目前LE救治局部麻醉藥物所致心臟毒性的確切機制尚不完全清楚。本研究通過靜脈注射質量濃度為5 g·L-1的BPV誘發心臟停搏,構建大鼠心臟毒性模型,結果表明,BPV致心臟毒性大鼠的心電圖發生明顯異常,心肌組織出現明顯損傷,血清CK-MB、cTn-T、LDH和BNP的水平明顯升高,提示BPV致大鼠心臟毒性模型建立成功。為探討LE對BPV致心臟毒性大鼠的影響,通過靜脈注射質量濃度為0.234 g·mL-1的LE進行復蘇,結果顯示,大鼠心電圖異常及心肌組織損傷明顯改善,血清CK-MB、cTn-T、LDH和BNP的水平明顯降低,提示LE對BPV致心臟毒性具有緩解作用,可明顯改善大鼠心肌功能。CK-MB、cTn-T、LDH和BNP是用于診斷再灌注損傷和心肌缺血的重要標志物,OUYANG B等[14]的研究結果亦表明,CK-MB、cTn-T和LDH的水平降低提示心臟功能好轉。

研究證實,BPV致心臟毒性的潛在機制與心肌細胞氧化應激密切相關[15-16]。SOD是一種重要的抗氧化酶,能夠催化超氧自由基還原為過氧化氫;GSH可直接清除活性氧,間接作為抗氧化酶的輔助因子,SOD、GSH均屬于機體酶類抗氧化系統[17]。MDA含量能夠提示組織脂質過氧化程度,從而反映細胞受損程度[18]。NOX-2主要分布于心肌細胞,其水平上升提示心肌組織氧化應激增強[19]。在心肌細胞中,一氧化氮可調節心肌細胞的收縮功能,但其含量過多則生成過氧硝酸鹽對機體產生毒性[20]。本研究結果顯示,LE可使大鼠血清SOD活性、GSH水平升高,MDA、NOX-2和一氧化氮水平降低,提示LE能夠減輕BPV所致的心肌應激損傷。YANG L等[21]通過觀察LE對BVP致H9C2心肌細胞毒性的作用發現,BPV可明顯提高H9C2心肌細胞氧化應激水平,并引起線粒體功能障礙,LE可顯著逆轉由BVP導致的H9C2心肌細胞毒性。

線粒體對于細胞凋亡有著極其重要的作用,其中bcl-2蛋白家族是主要的凋亡調控因子,包括促凋亡蛋白Bax、caspase-3和抗凋亡蛋白Bcl2,凋亡過程中Bcl2的表達下調,Bax和caspase-3的表達上調[22]。Bax通過增加線粒體膜通透性轉換孔的活性,促進細胞色素C的釋放,從而介導細胞凋亡;而Bcl2通過影響心肌細胞線粒體的通透性,抑制細胞凋亡,從而保護線粒體的結構和功能[23]。caspase是凋亡過程中必不可少的部分,線粒體釋放細胞色素C進入細胞質,并活化caspase-9,進而激活caspase-3,最終導致細胞凋亡[24]。本研究中,與空白對照組比較,布比卡因對照組大鼠心肌組織中Bcl2蛋白的表達水平明顯降低,Bax、cleaved caspase-3和cleaved caspase-9蛋白的表達水平明顯升高,反映了凋亡在BPV致大鼠心臟毒性中的作用。給予LE處理后,Bcl2蛋白的表達水平明顯升高,Bax、cleaved caspase-3和cleaved caspase-9蛋白的表達水平明顯降低,表明LE在BPV致心臟毒性大鼠中發揮抗凋亡作用,從而保護心肌細胞的完整性,最終減輕心肌損傷。林婷婷等[25]研究發現,LE減輕大鼠BPV心臟毒性的機制可能與抑制線粒體介導的細胞凋亡有關,本研究的結果與之相符。

MAPKs家族是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,除了調控炎癥介質之外,還可參與細胞增殖、分化和凋亡等多種生理過程的調控[26]。MAPK信號通路涉及ERK1/2、JNK、p38 3條亞通路。有研究表明,活性氧可通過激活JNK和p38MAPK,從而促進細胞凋亡[27]。既往的研究顯示,MAPK信號通路參與BPV誘導的細胞凋亡過程[28]。本研究的結果也證實MAPK信號通路在BPV致大鼠心臟毒性中的作用。而給予LE處理后,顯著抑制BPV誘導的MAPKs活化,提示LE的心臟保護作用可能與調控MAPK信號通路有關。這與PEREIRA S等[29]的研究結果一致,輸注脂質可減輕肥胖相關疾病引起的肝臟胰島素抵抗,這可能與抑制p38MAPK信號通路有關。但LE對BPV致大鼠心臟毒性的作用機制有待進一步研究。

綜上所述,LE可改善BPV致大鼠心臟毒性,減輕心肌應激損傷,其機制可能與調控MAPK信號通路抑制細胞凋亡有關。