白藜蘆醇苷對IgA腎病大鼠炎性因子及腎功能的影響

于建軍,王 慧,員文靜,曲礦云,徐亞沛

1.黃河三門峽醫院腎內科,三門峽 472000;2.黃河三門峽醫院急診科,三門峽 472000;3.鄭州市第三人民醫院腎內科,鄭州 450000

IgA腎病是一種常見的原發性腎小球腎炎疾病,主要特征為多聚IgA分子及其免疫復合物在腎小球系膜沉積[1]。炎性反應與IgA腎病的發生和發展密切相關,腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白細胞介素(interleukin,IL)-6和IL-1β等炎癥因子可促進IgA的沉積[2]。白藜蘆醇苷是廣泛存在于植物內的一種多酚類化合物,具有抗氧化、抗炎等作用[3-4]。研究表明,白藜蘆醇苷可通過減輕炎性反應、減少血清中肌酐和血尿素氮的含量,從而防止腎缺血再灌注損傷的發生[5]。本研究用動物實驗驗證白藜蘆醇苷對IgA腎病大鼠腎的保護作用,以及對炎性反應的影響。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Axio Vert.A1型光學顯微鏡[卡爾蔡司光學(中國)有限公司];MultiskanTMFC型酶標儀(美國賽默飛世爾科技有限公司);AU5800型生化分析儀(貝克曼庫爾特商貿有限公司);化學發光成像儀(美國Invitorgen公司)。

1.2 試藥

白藜蘆醇苷(批號190126,上海阿拉丁生化科技股份有限公司);TNF-α、IL-6和IL-1βELISA試劑盒(批號分別為190315、190221、190417,廈門慧嘉生物科技有限公司);葡萄球菌腸毒素B(批號SYA041,北京百奧萊博科技有限公司);FITC標記的IgA抗體(批號190323,北京邁瑞達科技有限公司);兔抗大鼠Notch1、Jagged1一抗和山羊抗兔二抗(批號分別為ab167441、ab7771、ab109489,美國Abcam公司)。

1.3 動物

SPF級雄性SD大鼠48只,8周齡,體質量(220±10) g,購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。所有大鼠均飼養于溫度為(25±2) ℃、濕度為50%～60%的SPF環境中,高壓滅菌的水和飼料隨意飲食。本實驗方案經鄭州市第三人民醫院實驗動物中心批準。

2 方法

2.1 實驗動物分組和建模

將48只雄性SD大鼠隨機分為4組:空白對照組、IgA腎病模型組、白藜蘆醇苷組和氯沙坦組,每組12只。參照文獻中的方法[6]建立IgA腎病模型。大鼠適應性飼養1周后,IgA腎病模型組、白藜蘆醇苷組和氯沙坦組大鼠灌服牛血清白蛋白100 mg·kg-1·d-1。6周后,尾靜脈注射經生理鹽水稀釋的牛血清白蛋白10 mg·kg-1,每周1次,連續注射3次。自第8周起,尾靜脈注射葡萄球菌腸毒素B 0.4 mg·kg-1,每周1次,連續注射3次。自第9周起,白藜蘆醇苷組以20 mg·kg-1·d-1白藜蘆醇灌胃,氯沙坦組以16.8 mg·kg-1·d-1氯沙坦灌胃,2種藥品均用生理鹽水溶解后灌入。空白對照組和IgA腎病模型組灌入等體積的生理鹽水,連續處理8周。

2.2 24 h尿蛋白檢測

末次干預后,收集所有大鼠24 h的尿液,記錄尿量。采用尿蛋白試劑盒(比色法)檢測尿蛋白的濃度。24 h尿蛋白=尿蛋白濃度×24 h尿量。

2.3 ELISA檢測血清中炎性因子IL-1β、IL-6和TNF-α的水平以及血肌酐、尿素氮的含量

各組大鼠灌胃8周后,用戊巴比妥鈉麻醉,腹主動脈采血8 mL,37 ℃水浴30 min后,以3 000 r·min-1離心5 min,分離上清液,保存于-20 ℃。IL-1β、IL-6和TNF-α的檢測根據ELISA試劑盒說明書進行操作,將對照品梯度稀釋后,每組設置5個復孔,依次加入100 μL樣品,孔板覆膜后置于37 ℃孵育。孵育1 h后,棄去上清液,依次加入抗體工作液和酶結合液,37 ℃孵育30 min。加入顯色液,避光孵育10 min,加入終止液,用酶標儀檢測各孔在450 nm波長處的吸光度(A)。血肌酐、尿素氮的含量用全自動生化分析儀進行檢測。

2.4 HE染色觀察腎組織病理學變化

取血后,剝離腎臟,取每組6只大鼠的腎臟放入福爾馬林中固定24 h。經過常規脫水、浸蠟、包埋和切片(厚度4 μm)后,進行HE染色。于光學顯微鏡下觀察各組大鼠腎組織的病理學變化。

2.5 免疫熒光法檢測腎組織中IgA沉淀情況

腎切片用磷酸鹽緩沖生理鹽水(phosphate buffered saline,PBS)漂洗3次,每次3 min,滴加經異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)標記的IgA抗體(1∶50),37 ℃孵育1 h后,用PBS漂洗3次,每次5 min,用甘油封片。于熒光顯微鏡下觀察IgA沉淀情況。

2.6 Western blot檢測腎組織中Notch信號通路蛋白的表達水平

將各組剩余6只大鼠的腎組織制成勻漿(90 Hz,5 min),加入放射免疫沉淀測定(radioimmunoprecipitation assay,RIPA)緩沖液和苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonylfluoride or phenylmethylsulfonyl fluorid,PMSF)抑制蛋白降解液(100∶1)將樣本裂解后提取各組總蛋白。用BCA試劑檢測蛋白質的總濃度,將各組總蛋白的濃度調為一致后,將其于100 ℃進行變性后保存于-20 ℃。用SDS-PAGE電泳分離總蛋白后,將其轉至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene difluoride,PVDF)膜。用質量濃度為50 g·L-1的脫脂牛奶封閉2 h,用TBST洗滌3次,每次10 min后,將其放入對應的一抗(Notch1、Jagged1和GAPDH)和一抗稀釋混懸液(1∶1 000)中,4 ℃孵育過夜。再用TBST洗滌3次,放入二抗和二抗稀釋液(1∶4 000)混懸液中,室溫孵育2 h。用TBST洗滌3次,每次10 min,將超敏發光液ECL滴在PVDF膜上,放入化學發光成像儀進行蛋白顯影。用Image J軟件分析結果,以GAPDH為內參對蛋白表達量進行標準化。

2.7 統計學方法

3 結果

3.1 各組大鼠24 h尿蛋白的比較

與空白對照組[(37.89±1.94) μg]比較,IgA腎病模型組24 h尿蛋白[(225.37±4.84) μg]顯著增加(P<0.05)。與IgA腎病模型組比較,白藜蘆醇苷組[(84.37±2.51) μg]和氯沙坦組[(72.27±1.81) μg]24 h尿蛋白顯著降低(P<0.05)。氯沙坦組24 h尿蛋白與白藜蘆醇苷組比較,差異無統計學意義(P>0.05)。

3.2 各組大鼠血清炎性因子的比較

IgA腎病模型組大鼠血清中IL-1β、IL-6和TNF-α的水平明顯高于空白對照組(P<0.05)。白藜蘆醇苷組和氯沙坦組IL-1β、IL-6和TNF-α的水平均顯著低于IgA腎病模型組(P<0.05);氯沙坦組IL-1β、IL-6和TNF-α的水平與白藜蘆醇苷組比較,差異無統計學意義(P>0.05)。結果見表1。

表1 大鼠血清炎性因子含量的比較

3.3 各組大鼠腎功能指標的比較

IgA腎病模型組大鼠血清中血肌酐、尿素氮的含量均明顯高于空白對照組(P<0.05)。白藜蘆醇苷組和氯沙坦組血肌酐、尿素氮的含量均顯著低于IgA腎病模型組(P<0.05);氯沙坦組血肌酐、尿素氮含量與白藜蘆醇苷組比較,差異無統計學意義(P>0.05)。結果見表2。

表2 大鼠血肌酐、尿素氮含量的比較

3.4 各組大鼠腎組織病理學的比較

HE染色結果見圖1。由圖1可見,空白對照組大鼠腎小球結構清晰,系膜細胞和基質未出現增生現象。IgA腎病模型組大鼠腎組織腎小球系膜細胞和基質發生彌漫性增生,局灶性系膜細胞增生,腎小管灶狀萎縮,伴有纖維化。

注:A.空白對照組;B.IgA腎病模型組;C.白藜蘆醇苷組;D.氯沙坦組。

白藜蘆醇苷組和氯沙坦組腎小球系膜細胞和基質彌漫性增生情況減輕,局灶性系膜細胞增生較少,無纖維化。

3.5 各組大鼠組織IgA沉積的比較

空白對照組大鼠腎小球系膜區無明顯IgA免疫復合物沉積。IgA腎病模型組、白藜蘆醇苷組和氯沙坦組均可見IgA免疫復合物沉積,IgA腎病模型組熒光強度顯著高于白藜蘆醇苷組和氯沙坦組。結果見圖2。

注:A.空白對照組;B.IgA腎病模型組;C.白藜蘆醇苷組;D.氯沙坦組。

3.6 各組大鼠腎組織Notch信號通路關鍵蛋白表達水平的比較

Western blot結果顯示,與空白對照組比較,IgA腎病模型組Notch1、Jagged1蛋白的表達量顯著上升(P<0.05);與IgA腎病模型組比較,白藜蘆醇苷組和氯沙坦組Notch1、Jagged1蛋白的表達量顯著降低(P<0.05);白藜蘆醇苷組與氯沙坦組Notch1、Jagged1蛋白的表達量差異無統計學意義(P>0.05)。結果見圖3。

注:A.Western blot檢測4組大鼠Notch1、Jagged1蛋白的表達量;B.4組大鼠Notch1、Jagged1蛋白表達量統計。與空白對照組比較,*P<0.05;與IgA腎病模型組比較,#P<0.05。

4 討論

IgA腎病是臨床常見的原發性腎小球疾病,發病率占原發性腎小球疾病的26%～34%[7]。IgA腎病的主要病理機制是腎小球系膜區IgA免疫復合物沉積,腎小球系膜細胞增殖導致腎功能損害,從而使腎功能指標出現異常(血肌酐、尿素氮和24 h尿蛋白增加)[8]。研究表明,炎性因子IL-1β、IL-6和TNF-α參與腎病的發生和發展,主要是由于炎性因子刺激血管內皮因子的分泌,使腎小球系膜細胞增生,增加腎小球內皮細胞通透性,加重腎功能的損傷,影響氮質代謝廢物的排泄,使肌酐、尿素氮和24 h尿蛋白水平升高[9-11]。

白藜蘆醇苷是具有抗氧化功能的多酚類化合物[12]。白藜蘆醇苷可使肌酐、尿素氮和24 h尿蛋白的水平下降,從而延緩糖尿病腎病的進展[13]。研究表明,白藜蘆醇苷能夠減輕炎性反應,防止腎缺血再灌注損傷的發生[14],但白藜蘆醇苷對IgA腎病的作用機制尚不清楚。基于此,本研究探究白藜蘆醇苷對IgA腎病大鼠腎功能的影響。本實驗結果顯示,用白藜蘆醇苷干預IgA腎病大鼠模型后,腎病大鼠腎功能指標肌酐、尿素氮和24 h尿蛋白含量顯著降低。HE染色和IgA結果顯示,白藜蘆醇苷可以減輕IgA腎病大鼠腎組織的損傷,并減少IgA的沉積。藜蘆醇苷組大鼠肌酐、尿素氮和24 h尿蛋白的含量以及IgA沉淀與氯沙坦組無明顯差異,提示白藜蘆醇苷與氯沙坦一樣,具有修復腎功能的作用。

炎性反應會引起機體發生氧化應激反應,直接損傷腎小管內皮細胞,導致腎小球微血管損傷,促進系膜區異常蛋白的沉積,從而加重腎功能損傷[15-16]。白藜蘆醇苷可以降低IgA腎病大鼠炎性因子IL-1β、IL-6和TNF-α的水平,且與氯沙坦組相比差異無統計學意義。為了進一步探究白藜蘆醇苷對IgA腎病大鼠作用的機制,本研究檢測了IgA腎病大鼠腎組織中Notch信號通路中關鍵蛋白的表達水平。Notch信號通路與腎病關系密切,其表達水平異常會引起腎間質纖維化和致硬化[17-18]。研究顯示,Notch1可以通過促進Jagged1的表達,激活炎性因子的分泌,導致IgA腎病的加重[19-20]。本研究結果顯示,白藜蘆醇苷通過抑制IgA腎病大鼠腎組織中Notch信號通路中關鍵蛋白Notch1、Jagged1的表達水平,減輕炎癥反應。

綜上所述,白藜蘆醇苷可抑制Notch信號通路,抑制炎性因子IL-1β、IL-6和TNF-α的表達,減輕腎組織中IgA的沉積,并降低肌酐、尿素氮和24 h尿蛋白的含量,從而發揮對腎功能的修復作用。本研究僅討論了白藜蘆醇苷在IgA腎病大鼠體內的影響,未來將探究白藜蘆醇苷在體外實驗中的作用,進一步驗證上述結論。