魚藤素對小鼠神經母細胞瘤細胞惡性行為的作用及其機制

馮玨利,王 瑛,常新捷,步星耀

1.河南科技大學第一附屬醫院小兒外科,洛陽 471000;2.河南省人民醫院神經外科,鄭州 450000

神經母細胞瘤(neuroblastoma,NB)是兒童期最常見的顱外實體惡性腫瘤,可發生于外周交感神經系統的任何部位,局部或轉移性的NB可在無干預情況下自發消退,但大齡兒童即使經過臨床治療仍可死于該病,約占所有兒童癌癥死亡病例的15%[1-2]。魚藤素是一種黃酮類化合物,可以有效抑制線粒體復合體Ⅰ酶的活力[3]。近年的研究顯示,魚藤素對多種腫瘤,如非小細胞肺癌、肝癌、胃癌等,具有良好的抗癌活性[4-6]。目前,有關魚藤素治療NB的研究較少,本研究以小鼠神經母細胞瘤細胞Neuro-2A為實驗對象,探討魚藤素對其惡性生物學行為的影響及作用機制,為魚藤素相關藥物的研發及NB的臨床治療提供實驗依據。

1 儀器與材料

1.1 儀器

全波長酶標儀(美國賽默飛世爾科技有限公司);流式細胞儀(美國BD公司)。

1.2 試藥

魚藤素、脂多糖(lipopolysaccharide,LPS),均購自美國Sigma公司;Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司);兔抗鼠細胞增殖核抗原67(antigen identified by monoclonal antibody 67,Ki67),活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(cleaved-caspase3),均購自美國Santa Cruz公司;兔抗鼠Toll樣受體4(toll-like receptor 4,TLR4),核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB),β-actin抗體以及辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)標記的山羊抗兔IgG抗體均購自英國Abcam公司。

1.3 細胞株

小鼠神經母細胞瘤細胞Neuro-2A細胞系購自中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫。

2 方法

2.1 MTT法檢測細胞增殖情況

取處于對數生長期的Neuro-2A細胞,調整細胞密度為1×105個·mL-1,接種至96孔板,每孔180 μL,培養過夜使細胞貼壁,加入不同濃度的魚藤素20 μL,使其終濃度分別為0、0.01、0.1、1、10、100、1 000 nmol·L-1,設置3個復孔,培養48 h。每孔加質量濃度為5 mg·mL-1的MTT 20 μL,孵育4 h后棄上清,每孔加DMSO 150 μL,室溫避光孵育5 min。用酶標儀檢測490 nm波長處各孔的吸光度值A,實驗重復3次,計算細胞存活率。細胞存活率=(實驗組A值÷對照組A值)×100%。應用Graphpad Prism7軟件計算半數抑制濃度(IC50),并將其作為后續實驗的干預濃度。另取細胞設置對照組、魚藤素組、LPS組和魚藤素+LPS組,魚藤素組、LPS組分別加入15.6 nmol·L-1魚藤素和質量濃度為10 μg·mL-1的LPS,魚藤素+LPS組先加入15.6 nmol·L-1魚藤素作用1 h,再加入質量濃度為10 μg·mL-1的LPS,對照組加入等體積細胞培養液作用48 h,檢測細胞相對活力。細胞相對活力=實驗組A值/對照組A值。

2.2 流式細胞術檢測細胞凋亡

收集各組細胞,調整細胞密度為5×105個·mL-1,用PBS清洗2次,加入Binding Buffer 195 μL重懸細胞,加入Annexin V-FITC 5 μL,混勻后加入PI 10 μL,室溫避光孵育15 min,用流式細胞儀檢測,用CellQuest軟件分析細胞凋亡率,實驗重復3次。

2.3 RT-PCR檢測TLR4/NF-κB通路相關基因mRNA的表達水平

收集各組細胞,用PBS清洗2次,用Trizol試劑提取細胞總RNA,用超微量分光光度計檢測其濃度和純度。

反轉錄體系:5×Mix 4 μL,RNA 1 μg,加雙蒸水至20 μL。反應程序:25 ℃,10 min;42 ℃,30 min;85 ℃,5 min。反轉錄產物稀釋至1 mL作為cDNA。

熒光定量PCR反應體系:2×SYBR Green Master Mix 10 μL,上、下游引物各1 μL,模板cDNA 2 μL,RNase-free ddH2O 6 μL。反應程序:95 ℃預變性60 s;95 ℃,15 s;60 ℃,15 s;72 ℃,45 s,共循環40次。目的基因RT-PCR引物用Primer3.0軟件設計,序列見表1。

表1 RT-PCR引物序列

2.4 Western blot檢測蛋白表達水平

收集各組細胞,加入RIPA裂解液后于冰上孵育0.5 h,以3 000 r·min-1(離心半徑10 cm)4 ℃離心5 min,取上清,用BCA法檢測蛋白濃度。加5×SDS loading buffer,金屬浴95 ℃加熱10 min,使蛋白變性,用體積分數10%的SDS-PAGE分離目的蛋白,用轉膜儀將其轉移至PVDF膜,用質量濃度50 g·L-1的脫脂奶粉室溫封閉1 h,分別加入1∶1 000稀釋的Ki67、cleaved-caspase3、TLR4、NF-κB p65和p-p65抗體,4 ℃孵育過夜,用TBST洗膜3次,加入1∶2 000稀釋的經HRP標記的二抗,室溫孵育1 h,用TBST洗膜3次,滴加ECL化學發光液,于暗室曝光顯影,用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值,計算目的蛋白的相對表達量。目的蛋白的相對表達量=目的蛋白條帶灰度值/內參β-actin蛋白條帶灰度值。

2.5 統計學方法

3 結果

3.1 魚藤素對Neuro-2A細胞的生長抑制作用

不同濃度的魚藤素作用于Neuro-2A細胞48 h后,細胞的生長受到明顯抑制,隨著魚藤素濃度的升高,細胞的存活率降低(P<0.05)。魚藤素作用48 h對Neuro-2A細胞的IC50為15.6 nmol·L-1,后續實驗選擇15.6 nmol·L-1魚藤素進行處理。結果見表2。

表2 各組細胞存活率的比較

3.2 各組Neuro-2A細胞相對活力的比較

細胞相對活力組間比較,差異有統計學意義(P<0.05)。與對照組比較,魚藤素組細胞的相對活力降低,LPS組細胞的相對活力增強(P<0.05);與魚藤素組比較,魚藤素+LPS組細胞的相對活力增強(P<0.05);與LPS組比較,魚藤素+LPS組細胞的相對活力降低(P<0.05)。結果見表3。

表3 各組細胞相對活力的比較

3.3 各組Neuro-2A細胞凋亡率的比較

細胞凋亡率組間比較,差異有統計學意義(P<0.05)。與對照組比較,魚藤素組細胞的凋亡率升高,LPS組細胞的凋亡率降低(P<0.05);與魚藤素組比較,魚藤素+LPS組細胞的凋亡率降低(P<0.05);與LPS組比較,魚藤素+LPS組細胞的凋亡率升高(P<0.05)。結果見表4。

表4 各組細胞凋亡率的比較

3.4 各組Neuro-2A細胞中TLR4、NF-κB mRNA表達水平的比較

比較各組細胞TLR4 mRNA的相對表達量,組間差異有統計學意義(P<0.05)。與對照組比較,魚藤素組TLR4 mRNA的相對表達量降低,LPS組升高(P<0.05);與魚藤素組比較,魚藤素+LPS組升高(P<0.05);與LPS組比較,魚藤素+LPS組降低(P<0.05)。各組細胞NF-κB mRNA的相對表達量比較,差異無統計學意義(P>0.05)。結果見表5。

表5 各組細胞TLR4、NF-κB mRNA表達水平的比較

3.5 各組細胞蛋白表達水平的比較

比較各組細胞Ki67、cleaved-caspase3、TLR4、p-p65蛋白的相對表達量,組間差異有統計學意義(P<0.05)。與對照組比較,魚藤素組Ki67、TLR4、p-p65蛋白的相對表達量降低,cleaved-caspase3蛋白的相對表達量升高(P<0.05),LPS組Ki67、TLR4、p-p65蛋白的相對表達量升高,cleaved-caspase3蛋白的相對表達量降低(P<0.05);與魚藤素組比較,魚藤素+LPS組Ki67、TLR4、p-p65蛋白的相對表達量升高,cleaved-caspase3蛋白的相對表達量降低(P<0.05);與LPS組比較,魚藤素+LPS組Ki67、TLR4、p-p65蛋白的相對表達量降低,cleaved-caspase3蛋白的相對表達量升高(P<0.05),各組細胞NF-κB p65蛋白的相對表達量比較,差異無統計學意義(P>0.05)。結果見表6和圖1。

表6 各組細胞蛋白表達水平的比較

圖1 各組細胞Ki67、cleaved-caspase3和TLR4/NF-κB通路蛋白的表達水平

4 討論

NB是一種胚胎惡性腫瘤,可影響兒童早期腎上腺髓質和椎旁交感神經節的正常發育,占所有兒童期惡性腫瘤的8%～10%,其起源于神經嵴的腎上腺嗜鉻細胞和交感神經元,具有基因組異常、腫瘤間和瘤內異質性等生物學特征[7-8]。ACKERMANN S等[9]根據NB基因組測序結果及分子特征將其分為端粒維持陰性和陽性2種表型。NB的發病機制包括原癌基因激活、擴增,抑癌基因失活或雜合性缺失,部分基因(如神經生長因子)表達失控,神經生長因子及多種信號轉導途徑(酪氨酸激酶受體介導的細胞信號途徑)異常,腫瘤細胞惡性增殖、凋亡失常等。由于NB原發腫瘤小、惡性程度高、進展快,由于診斷時多為中晚期且NB部分侵襲性和高危NB患者療效差、預后不佳,故也被稱為兒童腫瘤之王。NB的臨床治療手段包括手術、放療、化療、免疫治療、造血干細胞移植以及多方式聯合治療等,但治療效果仍不理想,5年生存率僅為70%,其中,高危NB患者的治愈率低于40%[10]。因此,尋找低毒、高效、溫和的新藥物對提高NB的治療效果、改善患者預后意義重大。

魚藤素是一種從魚藤屬或灰葉屬植物中提取的天然化合物,具有多種生物學效應,藥理學研究證實,魚藤素可通過阻滯細胞周期,誘導細胞凋亡,抑制血管生成,阻礙細胞遷移、侵襲以及調控新陳代謝等發揮抑瘤作用[11]。WANG A等[12]研究發現,魚藤素可以誘導p53上調的凋亡調節物介導的肺癌細胞凋亡并增強其對阿霉素的敏感性。ZHENG W等[13]研究表明,魚藤素可以抑制人胰腺癌細胞的增殖、遷移、侵襲,誘導細胞發生凋亡。LI W等[14]研究顯示,魚藤素通過下調B細胞特異性小鼠白血病病毒插入位點1基因的表達,抑制體內和體外非小細胞肺癌細胞的生長。本研究選取處于對數生長期的小鼠神經母細胞瘤細胞Neuro-2A,經魚藤素處理后發現,細胞存活率降低、凋亡率升高、細胞增殖標志蛋白Ki67的表達下調、cleaved-caspase3蛋白的表達上調,提示魚藤素可以抑制小鼠神經母細胞瘤細胞增殖,誘導其發生凋亡。

TLR亞型TLR4是一種重要的模式識別受體,可以識別病原相關分子模式并與其他輔助受體結合形成復合物傳遞信號,經過系列信號級聯反應使核因子κB抑制劑激酶活化,降解核因子κBα,并釋放轉錄因子NF-κB,由細胞質轉位至細胞核,刺激下游信號分子的表達[15]。NF-κB與炎癥因子、細胞增殖、細胞凋亡以及細胞外基質交聯密切相關,參與多種信號的轉導,NF-κB p65、NF-κB p50是其常見的作用形式[16-17]。FEI W等[18]研究顯示,板栗殼提取物可通過調控TLR4/NF-κB途徑抑制肝癌細胞增殖,減輕炎癥反應。ZHOU W等[19]研究發現,半乳糖凝集素3可通過激活TLR4/NF-κB信號轉導途徑促進肺腺癌細胞增殖。此外,ZHANG R等[20]研究表明,穿心蓮內酯可通過抑制TLR4/NF-κB信號通路抑制人結腸癌細胞增殖,并誘導細胞凋亡。本研究結果顯示,魚藤素可下調Neuro-2A細胞TLR4基因的轉錄,下調TLR4、p-p65蛋白的表達,而TLR4/NF-κB通路激動劑LPS則表現相反的作用效果。用魚藤素和激動劑同時處理Neuro-2A細胞后,激動劑對通路相關基因轉錄和蛋白表達的促進作用被逆轉,表明魚藤素可能通過抑制TLR4/NF-κB信號通路,調控增殖、凋亡相關基因的表達,抑制小鼠神經母細胞瘤細胞株Neuro-2A的增殖,誘導細胞凋亡。

綜上所述,魚藤素可以抑制Neuro-2A細胞的增殖,誘導其發生凋亡,可能與抑制TLR4/NF-κB信號通路、調控細胞增殖、凋亡相關蛋白的表達有關,為魚藤素相關藥物的研發及應用于NB的臨床治療提供理論支持。