不同齡SD大鼠自發性良性前列腺增生的研究

馬 允,侯冰燕,張 志,劉 穎,王文地,侯俊玲,3*,王文全,,3*

1.中國醫學科學院北京協和醫學院藥用植物研究所,北京 100193;2.北京中醫藥大學中藥學院,北京 102488;3.中藥材規范化生產教育部工程研究中心,北京 102488

良性前列腺增生(benign prostatic hyperplasia,BPH)是一種在中老年男性群體中的常見疾病,是由于過渡區和尿道周圍的上皮組織和纖維肌肉組織的增生失調而導致的前列腺的良性擴大[1]。建立BPH模型應綜合考慮發病機制和致病因素,由于BPH的確切發病機制仍未完全闡明,故自發性BPH模型最為接近人類實際臨床狀況,是研究BPH相關疾病較為理想的動物模型。目前研究較完備的可作為自發性BPH模型的實驗動物有犬類和靈長類動物[2-3]。SD大鼠屬于封閉群動物,在基因、毒理、代謝遺傳多樣性方面都比較接近于人類,且其衰老機制也與人類有諸多相似之處[4-5]。目前自然老化大鼠在BPH的藥效研究中也有應用[6],但對于大鼠BPH發生情況與其年齡的相關性仍缺乏系統研究。本文選取4、8、12月齡3個年齡段的SD大鼠,分別對其表觀指標臟器指數和BPH相關生化指標進行分析,旨在為SD大鼠自發性BPH模型的研究奠定理論基礎。

1 儀器與材料

1.1 儀器

FA2004N型電子分析天平(北京賽多利斯科學儀器有限公司);TDL5M型臺式低速冷凍離心機(湖南赫西儀器裝備有限公司);Multiskan MK3型酶標儀[賽默飛世爾(上海)分析儀器有限公司];DEM-3型自動洗板機(北京拓普分析儀器有限公司);SKP-02.600型電熱恒溫培養箱(黃石市恒豐醫療器械有限公司);JJ-12J型脫水機、JB-P5型包埋機均購自武漢俊杰電子有限公司;RM2016型病理切片機(上海徠卡儀器有限公司);B032型熒光倒置生物顯微鏡(尼康儀器上海有限公司)。

1.2 試藥

雙氫睪酮(dihydrotestosterone,DHT),睪酮(testosterone,T),表皮生長因子(epidermal growth factor,EGF),胰島素樣生長因子(insulin-like growth factor-1,IGF-1),B細胞淋巴瘤因子2(B-cell lymphoma factor 2,BCL-2),凋亡因子(BCL-2 associated X,BAX),超氧化歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和丙二醛(malondialdehyde,MDA)試劑盒,均購自上海酶聯生物科技有限公司;水合氯醛(批號20201017,陜西養元神生物科技有限公司);100 mL·L-1中性福爾馬林溶液(批號20201212,北京益利精細化學品有限公司)。

1.3 動物

2、6、10月齡的SPF級雄性SD大鼠各6只,體質量分別為490～650 g、550～850 g和450～600 g,購自斯貝福(北京)生物技術有限公司,許可證號SCXK(京)2019-0010。動物被安置在(22±2) ℃、相對濕度55%±5%的層流氣流室中。在12 h明暗交替的循環中,給大鼠提供標準的實驗室飲食,保證其自由飲水,所有大鼠于常規條件下適應性飼養2個月后用于實驗。

2 方法

2.1 實驗方法

將2、6、10月齡SD大鼠適應性飼養2個月,保證各年齡段大鼠生長環境完全一致后,將此時的4、8、12月齡雄性SD大鼠各6只禁食12 h,用體積分數為10%的水合氯醛按照0.003 mL·g-1進行腹腔注射麻醉,腹主動脈取血,血樣于常溫下靜置2 h,以4 000 r·min-1離心15 min,收集血清,儲存于-80 ℃,用DHT、T、EGF、IGF-1、BAX和BCl-2的ELISA試劑盒檢測各組大鼠血清中各指標的含量。仔細采集各組大鼠的前列腺、睪丸、肝臟、腎臟、脾臟和胸腺,將各器官表面液及組織液吸干,稱質量,計算臟器指數。臟器指數=臟器質量(mg)/體質量(g)。

將整個前列腺組織縱向一分為二,一半用100 mL·L-1中性福爾馬林溶液固定,進行常規組織處理和HE染色;另一半稱質量后,加入9倍體積的生理鹽水,冰水浴條件下制備勻漿,以2 500 r·min-1,離心10 min,取上清液。用SOD和MDA的ELISA試劑盒檢測各組大鼠前列腺組織內SOD及MDA的含量。

2.2 統計學方法

3 結果與分析

3.1 不同月齡SD大鼠臟器指數的變化

前列腺指數是臨床診斷BPH的重要表觀指標,在動物實驗中,也可直接反映實驗動物是否出現前列腺增生[7-8]。結果顯示,8月齡組大鼠的前列腺指數較4月齡組有升高趨勢,12月齡組大鼠的前列腺指數顯著高于4月齡組(P<0.01),12月齡組與8月齡組相比差異無統計學意義。從表觀指標前列腺指數來看,SD大鼠可能從12月齡或者更早即出現了一定程度的自發性BPH。一般采用雄激素誘導法等方法造模后,BPH大鼠的睪丸指數升高,實驗中8月齡組大鼠的睪丸指數較4月齡組顯著降低(P<0.01);12月齡組大鼠的睪丸指數顯著低于4月齡組(P<0.05),但與8月齡組大鼠相比差異無統計學意義。實驗中大鼠睪丸指數隨月齡增長而降低,呈現出與人工造模不同的變化趨勢。由于BPH是老年性疾病,腎臟、脾臟和胸腺等組織器官的質量變化可在一定程度上反映動物的衰老情況,故可參考肝臟指數、腎臟指數和脾指數等表觀指標衡量動物的衰老情況[9]。不同年齡的大鼠中12月齡組的肝臟指數、腎臟指數和脾指數均為最低,但各組間的差異無統計學意義。胸腺是重要的免疫器官之一,與動物體內的體液免疫和細胞免疫均有關系,其體積萎縮減小和質量下降均可導致動物免疫功能的下降[10]。實驗中8月齡組和12月齡組大鼠的胸腺指數較4月齡組顯著降低(P<0.001)。結果見表1。

表1 各組大鼠臟器指數的比較

3.2 不同月齡SD大鼠血清生化指標的變化

目前的激素內分泌學說、生長因子學說和細胞凋亡學說等均在一定程度上解釋了BPH的發病機制[11]。在激素內分泌學說中,雄激素可通過促進與抑制前列腺細胞的增殖和凋亡而導致前列腺增生,T和DHT都屬于雄激素,T作用于前列腺細胞,在5α-還原酶的催化作用下轉化為DHT,而DHT與雄激素受體的結合量是T的4～5倍[12],其在增生前列腺組織中的濃度一般高于正常組織。本實驗中DHT的表達量隨大鼠年齡的增長有升高趨勢,但各組間的差異無統計學意義;各組間T表達量的差異也無統計學意義。

生長因子在前列腺的增生過程中發揮著重要作用,EGF通過作用于細胞膜上的受體,促進細胞分裂從而導致前列腺上皮細胞增生[13]。IGF-1可促進前列腺上皮細胞發生有絲分裂并且具有抗細胞凋亡的作用[14],一般在BPH中,EGF和IGF-1的表達量顯著升高。本實驗中,與4月齡組比較,8、12月齡組大鼠EGF的表達量顯著升高(P<0.01),12月齡組與8月齡組相比有升高趨勢但差異無統計學意義;與4月齡組比較,8、12月齡組大鼠IGF-1的表達量顯著降低(P<0.01),12月齡組與8月齡組相比有降低趨勢但差異無統計學意義。

越來越多的研究表明,細胞凋亡的減少是BPH的重要致病因素,BAX屬于細胞凋亡促進基因,其表達量降低會導致細胞凋亡的減少,BCL-2屬于細胞凋亡抑制基因,其表達量升高同樣會導致細胞凋亡的減少[15]。本實驗中,與4月齡比較,8月齡組大鼠和12月齡大鼠BAX的表達量顯著降低,其中12月齡組比8月齡的降低趨勢更加明顯,12月齡組與8月齡組相比顯著降低(P<0.05);BCl-2的表達量隨年齡增長有下降趨勢,但各組間的差異無統計學意義。結果見表2。

表2 各組大鼠血清生化指標的比較

3.3 不同月齡SD大鼠前列腺組織內生化指標的變化

研究表明,男性BPH患者血漿中氧化應激標志物的含量增加,氧化應激在BPH發生中的作用仍未完全闡明,但兩者存在密切聯系[16]。SOD是體內一種具有清除自由基作用的重要抗氧化酶,自由基作用于脂質發生過氧化反應,其產物MDA具有細胞毒性[17-18]。與4月齡組相比,8、12月齡組大鼠SOD的表達量有下降趨勢,標準差偏高表明SOD表達量個體差異較大,各組間比較差異無統計學意義;8月齡組大鼠MDA的表達量顯著高于4月齡組(P<0.05),其他各組間的差異無統計學意義。結果見表3。

表3 各組大鼠前列腺組織生化指標的比較

3.4 不同月齡SD大鼠前列腺組織的病理變化

4月齡組光鏡下可見前列腺組織表現正常,上皮細胞排列整齊,呈立方狀或柱狀,腺腔內表面光滑,基本無乳頭狀向內突起;8月齡組上皮細胞排列較整齊,腺體增生不明顯,有少量間質,腺腔內有少部分乳頭狀向內突起;12月齡組上皮細胞及組織間隙出現增生,腺上皮細胞排列較紊亂,部分細胞呈高柱狀,間質較多,腺腔內有較多乳頭狀向內突起。4月齡組前列腺組織基本無增生,8、12月齡組增生程度遞增。結果見圖1。

注:A.4月齡組;B.8月齡組;C.12月齡組。

4 討論與結論

BPH的發生與年齡密切相關,有研究指出[19],隨著年齡的增長前列腺的體積逐漸增大,因此選擇年齡合適的實驗動物對于BPH的藥效研究有重要意義。關于實驗大鼠與人類年齡的相關性存在多種理論[20],本文通過非線性縮放理論計算SD大鼠的年齡[21],實驗大鼠的平均壽命為2～3歲[22],本實驗中4月齡SD大鼠相當于人類年齡16歲左右;8月齡相當于22歲左右;12月齡相當于40歲左右。但是要注意實驗動物的年齡并不完全是人類年齡的微縮版,考慮年齡因素時應當結合解剖學、生理學和生物學現象綜合分析。目前臨床上普遍應用表觀指標、生化指標和病理指標來判斷前列腺增生程度。因此,本文通過結合表觀指標、生化指標和病理指標對3個年齡段SD大鼠的自發性的前列腺增生程度進行系統分析。

依據表觀指標前列腺指數,12月齡SD大鼠的前列腺即出現一定程度的增生;依據病理指標,隨年齡增長,SD大鼠的前列腺組織增生程度逐漸加重;但生化指標結果顯示,并非全部檢測因子都達到BPH病理狀態,DHT、T、SOD以及MDA雖未達到病理狀態但有向病理狀態變化的趨勢。本實驗中,DHT的表達量隨大鼠月齡的增長有升高趨勢,但各組間的差異無統計學意義;各組間T表達量的差異無統計學意義,可能在雄激素指標的表達量上12月齡SD大鼠還未出現顯著性增長;BAX的表達量隨年齡增長逐漸降低,8月齡開始出現明顯降低,12月齡降低更加明顯;各組間BCl-2表達量的差異無統計學意義,可能在BCl-2的表達量上12月齡SD大鼠還未出現顯著性增長;EGF的表達量隨年齡增長而升高,8月齡開始即出現顯著性升高;IGF-1的表達量卻隨年齡的增長而降低,8月齡即出現明顯降低。IGF-1具有通過與特異性受體結合,發揮調節機體代謝、促進細胞增殖分裂、降低血糖及調節免疫等作用[22],研究顯示血循環中IGF-1的水平隨衰老下降[23],但其促細胞分裂作用是一把雙刃劍,既可以促進胎兒生長發育,維持成人體內合成與代謝,也會增加正常細胞轉化為腫瘤細胞的風險以及促進BPH的發生,目前普遍認為其在BPH模型的前列腺組織中呈現高表達[24-26]。本實驗中SD大鼠的IGF-1表達量隨年齡增長而下降,表現出了與自然衰老相同、與人工造模相反的變化趨勢。由于IGF-1的調節機制極為復雜,其在糖尿病和高血壓患者血液中表達水平的升降也曾爭議多年,因此老年BPH患者的確切IGF-1水平仍有待進一步研究。

綜上所述,本實驗中12月齡SD大鼠的前列腺組織出現一定程度的自發性增生,EGF和BAX的表達量均符合BPH病理狀態的變化,DHT、SOD和MDA的表達量雖未完全達到病理狀態,但呈現向病理狀態變化的趨勢,由此推斷12月齡SD大鼠存在自發性BPH。但要注意的是,BPH的發生、發展是多種因素共同作用的結果,前列腺組織增生是眾多生化指標綜合作用的表觀反映,并不局限于本實驗所檢測的生化指標,因此雖然本實驗中12月齡組SD大鼠有部分生化指標的表達量未達到BPH病理狀態,但其前列腺組織仍然出現增生。

自發性BPH大鼠模型由于其發病機制最為貼近臨床,故在BPH的治療及預防的研究中有較大應用價值。考慮本次實驗所用SD大鼠最大為12月齡,在年齡上仍有一定局限性,后續將選用更高月齡SD大鼠進行自發性BPH模型的研究。