齊墩果酸納米結構脂質載體的制備與藥效學評價

邢小燕,董 舒,果秋婷

1.咸陽職業技術學院,咸陽 712000;2.咸陽市中心醫院,咸陽 712000

齊墩果酸(oleanolic acid,OA)是從女貞子果實中提取分離得到的一種五環三萜類化合物,具有廣譜抗菌活性[1],臨床上已用于肺炎、急性扁桃體炎、牙周炎以及泌尿系統感染等疾病的治療,近年來的研究發現齊墩果酸能夠抑制血糖升高[2]。齊墩果酸在水中的溶解性較差,且是P-糖蛋白(P-gp)的底物,存在外排現象[3],其口服生物利用度較差。已有文獻報道將齊墩果酸制成不同種類的藥物遞送系統以提高藥物的溶解性,包括固體分散體[4]、納米混懸劑[5]、脂質體[6]、環糊精包合物[7]以及納米粒[8]等。納米結構脂質載體(nanostructured lipid carriers,NLCs)為新一代脂質納米給藥系統,它是將生物相容性良好的固體脂質與液體脂質作為載體,將藥物包裹在混合脂質中,以增加藥物的溶解度和生物利用度[9]。聚乙二醇1 000維生素E琥珀酸酯(D-α-tocopherol polyethyleneglycol 1 000 succinate,TPGS)親水/親脂平衡(hydrophile lipophilic balance,HLB)值為13.2,具有一定的乳化和增溶作用[10],更重要的是,TPGS能夠逆轉P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)對藥物的外排作用,可提高藥物的生物利用度[11]。本研究將齊墩果酸制備成納米結構脂質載體(OA-NLCs),同時在處方中加入TPGS對OA-NLCs進行修飾,并通過Caco-2細胞單層模型、藥效學實驗評價TPGS-OA-NLCs的藥物吸收效果,為改善齊墩果酸的臨床療效提供一種有效的解決方案。

1 儀器與材料

1.1 儀器

DH92-IIN型超聲波破碎儀(上海狄昊實業有限公司);JEOL JEM-2100型透射電子顯微鏡(日本電子株式會社);Zetasizer Nano ZS 90型激光粒度測定儀(英國Malvern公司);DF-101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(鞏義市予華儀器有限責任公司);LC-100型高效液相色譜系統(上海伍豐科學儀器有限公司)。

1.2 試藥

齊墩果酸原料藥(質量分數為90.5%,批號1900214,艾美捷科技有限公司);齊墩果酸對照品(質量分數為91.1%,批號110709-201808,中國食品藥品檢定研究院);山崳酸甘油酯(compritol-888 ATO,德國巴斯夫公司);丙二醇單辛酸酯(capryol 90,嘉法獅上海貿易有限公司);泊洛沙姆188(德國巴斯夫公司);TPGS(杭州樂信康寧醫藥科技有限公司);乙醇(國藥集團化學試劑有限公司)。

1.3 細胞

Caco-2細胞購自空軍軍醫大學細胞中心。

1.4 動物

SD大鼠購自空軍軍醫大學實驗動物中心,合格證號2145801474,許可證號SX-2007-004。

2 方法與結果

2.1 OA-NLCs與TPGS-OA-NLCs的制備

本研究采用改進的熱熔乳化-超聲波法制備OA-NLCs[12]。制備工藝:①稱取處方量的Compritol-888 ATO 1.0 g和Capryol 90 0.5 g,加入5 mL乙醇中,攪拌溶解,再加入齊墩果酸原料藥0.2 g,攪拌溶解,得到透明狀油性溶液,放入75 ℃水浴中保溫;②稱取泊洛沙姆188 0.4 g加入純化水20 mL中,攪拌溶解,得到透明狀水相溶液,將溶液平均分成2份,一份置于75 ℃水浴中保溫,另一份置于冰水浴(0～5 ℃)中保存,備用;③維持75 ℃恒溫水浴,將油相溶液滴入熱的水相溶液中,高速磁力攪拌,并在50 ℃減壓下用旋轉蒸發儀除去乙醇;④將混合物加入冷的水相溶液中,持續磁力攪拌30 min,形成乳狀液體;⑤將混合物加入超聲玻璃管中,通過超聲波細胞破碎儀超聲處理,超聲參數設置為超聲5 s,間歇5 s,超聲功率200 W,超聲時間5 min;⑥超聲結束后,迅速將其置于冰水浴中,充分冷卻,得到外觀呈淡藍色透明狀的OA-NLCs溶液。

TPGS-OA-NLCs與OA-NLCs的處方組成、輔料用量以及制備工藝參數完全相同,只是在步驟②中將TPGS 0.1 g溶解于冰水中,最終制備得外觀呈淡藍色透明狀的TPGS-OA-NLCs溶液。將制備得到的OA-NLCs與TPGS-OA-NLCs置于4 ℃保存,備用。

2.2 OA-NLCs與TPGS-OA-NLCs性質的研究

2.2.1粒徑、Zeta電位的測定 用馬爾文動態激光粒度儀檢測OA-NLCs和TPGS-OA-NLCs的粒徑分布、多聚分散系數(polydispersity index,PDI)和Zeta電位。在分析之前,將樣品放置在25 ℃下平衡2 min。每個樣品平行測量3次,結果見表1。

表1 OA-NLCs與TPGS-OA-NLCs制劑性質的測定結果

經測定,與OA-NLCs的粒徑相比,TPGS-OA-NLCs的粒徑減小,這可能是由于TPGS是表面活性劑,在處方中可進一步降低體系的界面張力,容易形成更小粒徑的納米粒,但是處方中加入TPGS也使其包封率出現降低的趨勢。Zeta電位的絕對值越大,體系的穩定性越好,研究表明,只有當Zeta電位的絕對值超過30 mV時,通過靜電斥力才能有效避免納米粒聚集[13],經測定OA-NLCs和TPGS-OA-NLCs的Zeta電位絕對值均大于30 mV,有利于提高納米粒的物理穩定性。

2.2.2微觀結構觀察 用透射電子顯微鏡觀察OA-NLCs和TPGS-OA-NLCs的微觀形態。分別取OA-NLCs和TPGS-OA-NLCs,經蒸餾水稀釋后,各取1滴置于碳涂層的銅網格表面,水分自然揮干,滴加磷鎢酸溶液(質量濃度為10 mg·mL-1)染色10 min,水分自然揮干,將2個樣品放置在透射電鏡下觀察,并拍攝電鏡照片,見圖1。

注:A.OA-NLCs;B.TPGS-OA-NLCs。

由圖1可見,OA-NLCs和TPGS-OA-NLCs均呈球狀,視野中未觀察到藥物結晶顆粒,通過電鏡照片比較可知,TPGS-OA-NLCs的大部分納米粒粒徑比OA-NLCs小,這也驗證了Zetasizer Nano-ZS的測定結果。

2.2.3體外藥物釋放研究 用透析袋擴散法評價OA-NLCs和TPGS-OA-NLCs在體外的藥物釋放情況。取OA-NLCs、TPGS-OA-NLCs以及OA乙醇溶液(質量濃度為5 mg·mL-1)各2 mL分別放入透析袋中,釋放介質為pH 6.8磷酸鹽緩沖溶液200 mL,并加入質量濃度為5 mg·mL-1的Tween-80作為增溶劑,在37 ℃下以50 r·min-1的攪拌速度將透析袋完全浸入到釋放介質中,并在固定的時間間隔(0.5、1、2、4、6、8、10、12、24 h)內取出釋放介質3 mL(補加同溫同體積空白介質),用0.45 μm微孔濾膜過濾,濾液經適當稀釋后用HPLC法檢測藥物含量,計算藥物質量濃度,繪制藥物累積釋放量-時間曲線,見圖2。

圖2 OA乙醇溶液、OA-NLCs和TPGS-OA-NLCs的體外藥物釋放曲線

由圖2可見,齊墩果酸乙醇溶液中的藥物在2 h內釋放完全,而OA-NLCs和TPGS-OA-NLCs均表現為持續、緩慢地藥物釋放過程,且藥物釋放量基本同步,在前2 h藥物釋放量基本一致,大約有25%的藥物從載體中釋放出來,在隨后的24 h內累計約有85%的藥物釋放。

2.3 細胞轉運研究

將Caco-2單層細胞用于研究OA-NLCs和TPGS-OA-NLCs從細胞頂端(apical,AP)到基底外側(basolateral,BL)(AP→BL,表示吸收過程)和BL到AP(BL→AP,表示分泌過程)的細胞轉運特征。將Caco-2細胞置于含有質量濃度為100 g·L-1的胎牛血清(100 u·mL-1青霉素和100 u·mL-1鏈霉素)的培養基中孵育21 d(孵化條件:37 ℃,二氧化碳體積分數為5%,測定跨上皮電阻(trans-epithelium electrical resistant,TEER)值為(456.5±27.6) Ω·cm-2,表明緊密的Caco-2單層細胞模型已成功構建[14],在轉運實驗開始前,用預熱的(37 ℃)空白漢克平衡鹽溶液(Hank’s balanced salt solution,HBSS)淋洗Caco-2單層細胞3次,備用。配制含有不同質量濃度OA原料藥、OA-NLCs和TPGS-OA-NLCs的HBSS作為供試液,分別取各組溶液1.0 mL加入Caco-2單層細胞的頂端(AP),并向基底外側(BL)加入空白HBSS 2.5 mL作為接收液,在固定的時間點從BL側取接收液0.3 mL(同時補加同體積空白HBSS),離心后取上清液經HPLC法測定藥物含量;按上述操作,測定各組溶液從BL側向AP側轉運的藥物含量,按照公式(1)和(2)計算表觀滲透系數(apparent permeability coefficient,Papp)和外排比(efflux ratio,ER)。結果見表2。

表2 OA原料藥、OA-NLCs和TPGS-OA-NLCs在Caco-2細胞單層中的滲透性

(1)

(2)

其中dQ/dt是接收液中齊墩果酸的穩態透過率,C0是供試液中齊墩果酸的初始質量濃度,A是Caco-2單層細胞的面積,Papp(AP→BL)是齊墩果酸從頂端轉運到基底外側的Papp值,Papp(BL→AP)是齊墩果酸從基底外側轉運到頂端的Papp值。

研究結果顯示,OA原料藥從BL側到AP側的Papp(BL→AP)值為(0.81±0.26)×10-6cm·s-1,而從AP側到BL側的Papp(AP→BL)值為(2.42±0.38)×10-6cm·s-1,ER值為2.99,該結果與文獻報道的一致[15],表明齊墩果酸很可能是P-gp的底物[16];OA-NLCs的Papp(BL→AP)和Papp(AP→BL)值分別為(1.59±0.24)×10-6和(1.47±0.33)×10-6cm·s-1,ER值為1.08,與OA原料藥相比降低了2.77倍,這是由于較小粒徑的納米顆粒容易被細胞內吞,促進藥物吸收[17];TPGS-OA-NLCs的Papp(BL→AP)和Papp(AP→BL)值分別為(0.84±0.19)×10-6和(2.46±0.39)×10-6cm·s-1,其ER值為0.34,分別比OA原料藥和OA-NLCs降低了8.79和3.18倍,一方面是由于TPGS-OA-NLCs通過細胞內吞作用進入細胞內,促進藥物吸收,另一方面處方中加入TPGS,能夠顯著抑制P-gp的活性,降低了P-gp對齊墩果酸的外排作用[18]。

2.4 藥效學評價

取SD大鼠,體質量為(220±20) g,雌雄各半,通過大鼠腹腔注射四氧嘧啶溶液誘發糖尿病,建立大鼠糖尿病模型(空腹血糖大于300 mg·dL-1)。將糖尿病大鼠隨機分成4組,每組3只,第1組大鼠作為空白對照,灌胃給予飲用水,第2組大鼠灌胃給予OA混懸液(藥物分散在質量濃度為5 mg·mL-1的羧甲基纖維素鈉中),第3組大鼠灌胃給予OA-NLCs,第4組大鼠灌胃給予TPGS-OA-NLCs,給藥劑量均為100 mg·kg-1,并在0、1、2、4、6、8、10、12、24 h經眼眶后神經叢采血0.1 mL,用葡萄糖檢測試劑盒測定血糖水平,比較OA混懸液、OA-NLCs和TPGS-OA-NLCs降血糖的效果。結果見圖3。

圖3 口服OA混懸液、OA-NLCs和TPGS-OA-NLCs后大鼠體內的血糖水平比較

由圖3可見,糖尿病大鼠在分別口服OA混懸液、OA-NLCs和TPGS-OA-NLCs后,血糖水平均出現降低趨勢,口服TPGS-OA-NLCs大鼠在各時間點的血糖水平明顯低于口服OA-NLCs和OA混懸液的大鼠,進一步說明TPGS-OA-NLCs促進了藥物吸收,降血糖效果顯著。

3 討論

齊墩果酸自身的溶解度及其透過胃腸道黏膜的能力(滲透性)是影響藥物口服生物利用度的2個最重要的因素。改善齊墩果酸的溶解度可以通過制劑技術,但是如何提高齊墩果酸的滲透性仍是一個難點。Caco-2細胞是來自于人類腸道的腫瘤細胞,通過體外培養即可得到在形態和功能上與人類小腸上皮層相似的單層結構,更重要的是,Caco-2細胞之間存在緊密連接,形成腸道吸收的限速屏障,這是小腸上皮層的特征,Caco-2單層細胞模型已廣泛用于預測藥物及制劑經口服給藥的腸道滲透性。因此,本研究采用Caco-2單層細胞模型評價OA原料藥、OA-NLCs和TPGS-OA-NLCs的細胞轉運特征。

P-gp是一種存在于細胞膜上的轉運蛋白,其功能是保護細胞免受外來有害分子的侵害[19]。由于齊墩果酸是P-gp的底物,存在外排現象,故嚴重影響了藥物的腸道吸收。TPGS是一種安全的藥用輔料,已被美國藥典收錄,且TPGS能夠逆轉P-gp的外排泵作用,促進藥物吸收,因此,本研究將齊墩果酸制備成納米結構脂質載體,在該處方的基礎上加入TPGS,不僅可增加藥物的溶解性,而且可提高藥物的滲透性,最終通過大鼠藥效學實驗證實TPGS-OA-NLCs能有效提高藥物的降血糖效果。本研究可為提高齊墩果酸的治療效果奠定基礎。