心肌缺血預適應大鼠循環血微囊泡中miRNAs表達譜分析

趙俊玉，祝倩，尚曼，李燁儀，劉淼，王藝璐，吳艷娜，劉艷霞，宋君秋

（天津醫科大學基礎醫學院藥理學系，天津 300070）

心肌缺血/再灌注（ischemia/reperfusion,I/R）損傷是導致缺血性心臟病（ischemic heart disease，IHD）患者心肌組織損傷加重的主要原因，缺血預適應（ischemic preconditioning，IPC）被認為是減輕心肌I/R損傷的一種有效治療策略[1]。研究發現，IPC 能夠誘導損傷的心臟細胞釋放細胞微囊泡（microvesicles，MVs）和外泌體等細胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs），介導IPC 抗心肌I/R 損傷的心臟保護作用[2]。MVs 是細胞受到組織缺氧、氧化損傷等外來刺激后，以出芽的方式從質膜脫落后形成的具有脂質雙分子層結構的囊泡，直徑100～1 000 nm，主要通過攜帶 蛋 白 質、 細 胞 因 子、RNAs 和 microRNAs（miRNAs）等物質到靶細胞，發揮細胞間通訊的作用[3]。研究表明，循環血中的miRNAs 主要富集在MVs 等EVs 中，而MVs 作為載體運輸miRNAs 時，不僅可以促進miRNAs 在細胞間的信息傳遞，而且可以保護miRNAs 免受細胞外RNA 酶的降解，提高miRNAs 的穩定性[4]。前期研究已經證明缺血預適應循環血中MVs（IPC-MVs）可能通過抑制心肌細胞內質網應激（endoplasmic reticulum stress，ERS）信號通路，發揮抗心肌I/R 損傷的保護作用[5]。但在基因水平上，IPC-MVs 抗心肌I/R 損傷的作用機制還未完全闡明。本研究利用Microarray 分析IPC-MVs 中含有的miRNAs，并利用生物信息學分析并篩選核心靶基因，擬從miRNAs 水平初步探討IPC 抗心肌I/R損傷的作用機制。

1 材料和方法

1.1 材料 實驗動物：健康雄性Wistar 大鼠，8～10周，體重（230±12）g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供[批號：11400700316046，生產許可證號：SCXK（京）2016-0006]。實驗試劑：枸櫞酸鈉（天津市光復科技發展有限公司），Gene Expression Wash Pack（Agilent），miRNA complete Labeling and Hyb Kit（24×）（Agilent）。儀器：BL-420E 生物功能實驗系統及HX-100E 型小動物呼吸機（成都泰盟科技有限公司），Optima L-100XP 制備型超速離心機（Beckman Coulter），HT 7700 透 射 電 子 顯 微 鏡（transmission electron microscope，TEM，HITACHI 公司），雜交爐（Agilent G2545A），PCR 儀（ABI 9700）。

1.2 方法

1.2.1 大鼠心肌IPC 模型的建立 采用簡單隨機抽樣方法將大鼠隨機分為兩組：Sham-MVs 組和IPC-MVs 組，每組4 只，麻醉后取仰臥位固定，連接心電圖儀，頸動脈插管監測平均動脈壓（MAP），而后行開胸處理。（1）Sham-MVs 組：于冠狀動脈左前降支（LAD）下穿線后曠置45 min，立即自腹主動脈取血。（2）IPC-MVs 組：LAD 下穿線后穩定15 min，再行缺血5 min/再灌注5 min 的處理，循環3 次后立即自腹主動脈取血。

1.2.2 循環血中MVs 的提取及形態鑒定 上述兩組血液樣本經枸櫞酸鈉抗凝，室溫條件下，采用兩步離心法收集無血小板血漿（platelet-free plasma，PFP）：2 600×g 離心15 min；取上清，10 000×g離心5 min。將PFP 置于超速離心管中，4℃，100 000×g離心148 min，棄去上清，獲得沉淀即為MVs。用無菌生理鹽水重懸沉淀，BCA 法測定蛋白質濃度；分裝，-80℃冷凍保存。采用TEM 對MVs 進行形態學鑒定。

1.2.3 MVs 中總RNA 的提取與純化 采用miRNeasy kit（Qiagen，German），參照說明書標準操作流程提取MVs 中總RNA，利用NanoDrop ND-2000（Thermo Scientific）定量，通過Agilent Bioanalyzer 2100（Agilent Technologies）檢測RNA 完整性。

1.2.4 miRNAs 芯片分析 采用Agilent Rat miRNAs，Release 21.0（8*15K，Design ID:070154）芯片進行實驗。具體操作如下：分別取兩組總RNA 100 ng，定容至2 μL，去磷酸化后，加入DMSO 使其變性，隨后用Cyanine-3-CTP（Cy3）進行熒光標記，RNA 純化后和芯片雜交，55℃，20 r/min，滾動雜交20 h。雜交完成后在洗缸中洗脫。利用Agilent Scanner G2505C（Agilent Technologies）進行圖像掃描，獲得芯片結果。

芯片結果分析：采用Feature Extraction 軟件（version10.7.1.1，Agilent Technologies）處理原始圖像提取原始數據。Genespring 軟件（version14.8，Agilent Technologies）進行quantile 標準化和差異miRNAs 篩選，上調或者下調倍數變化值（FC）絕對值≥2.0 且P≤0.05 納入標準。

1.2.5 熒光定量PCR（qRT-PCR）驗證差異表達的miRNAs 采用qRT-PCR 技術驗證芯片檢測結果的可靠性。使用miScript 逆轉錄酶試劑盒（Qiagen，Germany）進行逆轉錄，使用QuantiFast? SYBR?Green PCR Kit（Qiagen）對miRNAs 進行定量。PCR擴增條件：95℃變性10 min，95℃變性10 s，60℃退火20 s，72℃延伸15 s，30～45 個循環。每個樣品重復3 次。以U6 作為內參，采用ΔΔCt 法進行相對分析。

ΔΔCt=（CtTargetmiRNAs-CtU6）IPC-MVs -（CtTargetmiRNAs-CtU6）Sham-MVs。

1.2.6 差異表達miRNAs 的生物信息學分析 通過TargetScan、miRWalk 和microRNA.org 數據庫預測差異表達miRNAs 的潛在靶基因，利用Cytoscape 軟件（version3.1.1）建立miRNA-mRNA 調控網絡圖，分析差異表達miRNAs 與潛在靶mRNA之間的關系。通過DAVID 網站對差異表達miRNAs 的潛在靶基因進行基因本體研究會數據庫（GO）、生物學過程（BP）、細胞組分（CC）、分子功能（MF）分析和KEGG富集分析，預測差異表達miRNAs 主要影響的生物學功能或通路。

1.3 統計學處理 采用SPSS17.00 進行統計學分析，符合正態分布的計量數據采用±s 表示，兩組間比較采用配對t 檢驗，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 IPC-MVs 的形態學鑒定及RNA 含量分析 通過低溫超速離心法可在大鼠循環血中成功提取得到IPC-MVs。負染法處理IPC-MVs 后，于TEM 下觀察，IPC-MVs 呈圓形或橢圓形的膜性結構，平均直徑100～1 000 nm，其內容物中未見明顯的細胞器結構（圖1A）。

RNA 定量結果顯示，IPC-MVs 組中含有的總RNA 濃度為（1.13±0.06）g/ L，其中miRNAs 的含量占其總RNA 的（57.00±4.24）%，Sham-MVs 組中含有的總RNA 濃度為（1.88±1.00）g/L，miRNAs 的含量占總RNA 的（53.00±2.05）%（圖1B）。

圖1 IPC-MVs 的形態學鑒定及RNA 含量分析Fig 1 Identification of morphology and RNA content analysis of IPC-MVs

2.2 循環血MVs 中差異表達miRNAs 的篩選及qRT-PCR 驗證 采用Microarray 篩選循環血IPCMVs 組和Sham-MVs 組中差異表達的miRNAs。選取P＜0.05，差異倍數（Fold change）絕對值≥2 且具有統計學意義的miRNAs 定義為顯著性差異表達的miRNAs。聚類分析結果顯示，與Sham-MVs 組相比，IPC-MVs 中有5 個表達差異顯著的miRNAs（P＜0.01，FER＜0.05）（圖2A），其中miR-1-3p、miR-378b、miR-133a-3p 和miR-133b-3p 表達顯著上調，miR-702-3p 表達顯著下調（圖2B）。

qRT-PCR 結 果 顯 示，miR-1-3p、miR-378b、miR-133a-3p、miR-133b-3p 和miR-702-3p 在IPC-MVs 組和Sham-MVs 組中均有表達。與Sham-MVs 組相比，miR-1-3p（t=3.194）、miR-133a-3p（t=3.002）、miR-133b-3p（t=3.389）顯著上調，表達趨勢與芯片結果一致。但miR-378b、miR-702-3p表達與芯片結果趨勢相反，表現為miR-378b（t=4.455）下調，miR-702-3p（t=6.443）上調（圖2C）。芯片檢測與qRT-PCR 共同驗證的結果表明，循環血MVs 中差異表達顯著的miRNAs 共3 個：miR-1-3p、miR-133a-3p 和miR-133b-3p，且其在IPC-MVs 中的表達量均顯著高于Sham-MVs。

圖2 循環血中MVs 差異表達miRNAs 的篩選及qRT-PCR 驗證Fig 2 Screening and qRT-PCR validation of miRNAs differentially expressed in MVs of circulating blood

2.3 差異表達miRNAs 的靶基因預測 通過TargetScan、miRWalk 和microRNA.org 網站對差異表達顯著上調的3 個miRNAs 進行靶基因預測，共得到86 個潛在靶基因（圖3A）。為進一步探究這些潛在靶基因與疾病的關系，利用Cytoscape 軟件建立miRNA-mRNA 網絡調控圖（圖3B），通過度值（Degree）大小篩選核心靶基因，并利用STRING 數據庫構建靶基因之間的PPI 網絡，Cytoscape 可視化分析結果顯示度值排名前10 的核心靶基因為：Ntrk2、Rasd2、Igf1、Vamp2、Eif4a1、Gnai3、Sumo1、Cacna1b、Camk4、Bcl2l1（圖3C）。其中Ntrk2、Igf1、Gnai3、Bcl2l1 均與心肌I/R 損傷密切相關，而且與miR-1-3p、miR-133a-3p、miR-133b-3p 均有潛在的靶向關系。

圖3 差異表達的miRNAs 靶基因預測Fig 3 Target genes prediction of differentially expressed miRNAs

2.4 GO 和KEGG 通路富集分析 進一步對篩選出的86 個潛在靶基因進行生物學功能分析。GO 分析結果顯示，這些靶基因主要參與33 個生物學過程（圖4A）、25 個細胞成分的組成（圖4B）和11 個分子功能（圖4C）。其中前10 個核心靶基因的生物學過程主要富集在細胞增殖的正向調節、小GTP 酶介導的信號轉導、蛋白質運輸、應對缺氧反應和細胞對胰島素刺激的反應等；細胞成分主要富集在細胞質、膜、細胞外泌體、胞質和細胞連接等。分子功能主要富集在蛋白結合、肌凝蛋白結合、鈣調蛋白結合和蛋白激酶結合中。KEGG 信號通路富集結果顯示，這些差異表達的miRNAs 靶基因顯著富集在絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路和Ras 信號通路（圖4D）。其中MAPK 信號通路涉及核心靶基因Ntrk2、Cacna1b，Ras 信號通路涉及核心靶基因Igf1、Bcl2l1。

圖4 差異表達的miRNAs 靶基因GO 和KEGG 分析Fig 4 GO and KEGG analysis of differentially expressed miRNAs target genes

3 討論

近年來研究發現，MVs 參與調控IPC 的心臟保護作用。MVs 從細胞質膜脫落過程中會攜帶許多母體細胞的活性物質，而不同的細胞類型、不同的刺激因素，MVs 釋放時所攜帶的活性物質組成有所不同。在心肌缺血或缺氧期間，心肌組織中某些特定miRNAs（如miR-1、miR-133、miR-139、miR-208 等）的表達迅速受到干擾，干預心肌缺血性損傷的診斷和治療[6]。作為有效載體，在缺血性心臟病患者循環血中的MVs 可以將具有生物學功能的miRNAs 轉運至內皮細胞、心肌細胞、平滑肌細胞或成纖維細胞內，通過與靶細胞受體結合而發揮生物學效應[7]。本實驗采用梯度差速離心法，成功地從循環血樣本中提取到IPC-MVs 和Sham-MVs，TEM 觀察到MVs呈現圓形或橢圓形的雙層膜囊泡樣結構。提取兩組MVs 中總RNA，結果顯示IPC-MVs 和Sham-MVs 中均含有一定濃度的RNA，其中miRNAs 的含量平均占總RNA 的50%以上，表明IPC-MVs 可以是miRNAs的運輸載體，為IHD 提供了一種新的治療策略。

為進一步探究IPC 處理對循環血MVs 中miRNAs 表達的影響，采用Microarray 對IPC-MVs 及Sham-MVs 中所含miRNAs 進行初步差異篩選。結果顯示，兩組MVs 中5 種miRNAs 表達有顯著差異。與Sham-MVs 相比，IPC-MVs 中miRNAs 顯著上調4 個：miR-1-3p、miR-133a-3p、miR-133b-3p、miR-378b，下調1 個：miR-702-3p。為進一步分析Microarray 結果的可靠性，本研究采用qRT-PCR 進行驗證，結果顯示，IPC-MVs 中miR-1-3p、miR-133a-3p、miR-133b-3p 相對表達量顯著升高，與Microarray 結果一致。由于miR-378b 和miR-702-3p 芯片檢測與qRT-PCR 驗證結果不一致，可能因為這兩個miRNAs 在循環血MVs 中含量較低，導致檢測結果的不穩定性，暫不納入本實驗的后續研究。研究顯示，這些差異表達顯著上調的miRNAs 均與心血管疾病的發生、發展有一定的關聯。MiR-133a-3p 和miR-133b-3p 是心肌組織中特異性表達的miRNAs，具有調節心肌細胞分化、增殖和成熟的作用。當發生缺血性損傷時，心肌內miR-133a-3p和miR-133b-3p 顯著降低。心臟祖細胞中過表達的miR-133a-3p 可以促進新生血管的形成和心肌細胞的增殖，顯著改善心肌梗死大鼠的心臟功能[8]；通過抑制巨噬細胞遷移因子來上調急性心肌梗死大鼠模型中miR-133a-3p，間充質干細胞來源的外泌體可有效促進血管生成、抑制細胞凋亡、減少心肌纖維化面積和改善心臟功能[9]。彭興等[10]體外和體內研究表明，增加I/R 損傷大鼠或H/R 心肌細胞中miR-133b-3p 的表達，可以顯著抑制心肌細胞凋亡和活性氧簇積累。表明miR-133a-3p 和miR-133b-3p 的過表達在心肌I/R 損傷中具有較高的治療價值。心肌特異性miR-1-3p 在心肌細胞生長中發揮關鍵的調節作用。促進miR-1-3p 的釋放可以有效增強間充質干細胞（MSC）的心臟分化能力，恢復梗死心肌功能[11]。但也有研究顯示，miR-1-3p 具有促心肌細胞凋亡的作用，顯著降低I/R 處理大鼠心臟中抗凋亡蛋白Bcl-2，增加心肌損傷[12]。因此，miR-1-3p 的過表達是否可以作為IPC-MVs 心肌I/R 損傷的治療靶標有待進一步研究。本實驗發現，與Sham-MVs 組相比，IPC-MVs 組中miR-133a-3p、miR-133b-3p 及miR-1-3p 表達顯著升高，顯示了IPC 處理產生的IPC-MVs 通過攜帶這些特異性的miRNAs 作用于靶細胞，升高損傷心肌組織中的miRNAs 水平，從而減輕心肌I/R 損傷的可能性。

靶基因預測結果顯示，miR-1-3p、miR-133a-3p、miR-133b-3p 的潛在靶基因共86 個，利用Cytoscape 軟件篩選出4 個與心肌I/R 損傷相關的共同核心靶基因：Ntrk2、Igf1、Gnai3 和Bcl2l1。生物學功能分析顯示，這些潛在靶基因的表達產物主要富集在細胞質中，參與細胞增殖的正向調節、小GTP酶介導的信號轉導、蛋白質運輸、應對缺氧反應和細胞對胰島素刺激的反應等生物學過程，主要參與MAPK 信號通路和Ras 信號通路，與心血管疾病的發生和發展密切相關。Ntrk2 又稱為原肌球蛋白相關激酶B（tropomyosin-related kinase B，TrkB），是神經營養酪氨酸受體激酶家族的成員之一，通過調節MAPK、Ras、磷脂酰肌醇3 激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）和鈣信號通路，在IHD 中發揮重要的作用。Gong 等[13]研究顯示，過表達心肌保護蛋白Caveolin-3，可以激活下游TrkB 信號通路，減輕糖尿病引起的心肌I/R 損傷。激活TrkB 信號通路，可以有效抑制H2O2誘導的H9c2 細胞線粒體過度分裂，從而增加細胞活力，減少細胞凋亡[14]。Igf1 是一種多功能生長因子，可以激活PI3K/Akt 信號通路促進細胞增殖和存活[15]。通過抑制Igf1 降解，骨髓間充質干細胞以缺氧誘導因子-1α 依賴機制，顯著增加梗死心肌血管的生成，改善心臟功能，提高急性心肌梗死后干細胞治療的有效性[16]。Gnai3 是多種跨膜信號通路的調制者和轉導者，參與調節細胞內Ca2+信號級聯反應，改善心力衰竭大鼠的心臟重塑[17]。Bcl2l1 是位于線粒體外膜的抗凋亡蛋白Bcl-2 家族成員之一，具有控制線粒體活性氧的產生和細胞色素C 釋放的生物學功能，在I/R 誘導的心肌損傷中發揮抗凋亡作用[18]。本實驗前期研究表明，IPC-MVs 主要通過上調心肌組織中Bcl-2 的表達，下調Bax 和降低caspase-3 的活力，減輕I/R 大鼠心肌損傷[19]。表明IPC-MVs 通過抑制心肌細胞內I/R 誘導的細胞凋亡通路，發揮心臟保護作用。因此，在IPC-MVs 中表達顯著升高的miRNAs（miR-1-3p、miR-133a-3p、miR-133b-3p）可能通過調控Ntrk2、Igf1、Gnai3、Bcl2l1 的表達，影響心肌細胞的增殖、存活和血管生成等生物學進程，進而發揮抗心肌I/R 損傷的保護作用。本研究發現，循環血IPC-MVs 與Sham-MVs 攜帶的miRNAs 確實存在明顯的差異表達，差異表達的miRNAs 與I/R損傷時心肌保護作用相關，這為IPC-MVs 通過轉運miRNAs 治療心肌I/R 損傷提供了理論依據，深入的機制還需進一步研究。