內鏡輔助新西蘭兔咽喉反流病動物模型建立方法的改進與比較*

代麗麗，湯維，尤悅，吳宏林，彭光華，陳朝輝，周雪華，耿爽，林笑含

（杭州師范大學附屬醫院 耳鼻咽喉科，浙江 杭州 310015）

咽喉反流病（laryngopharyngeal reflux disease，LPRD）是耳鼻咽喉科的常見病，因咽喉部受胃內容物反流侵襲，臨床常表現為：咽干、咽痛、咽喉部異物感、咽喉部痰多、頻繁清嗓、聲音嘶啞、發聲疲勞、喉痙攣、慢性咳嗽、窒息感及吞咽困難等[1-2]。近10%的耳鼻喉科門診患者存在LPRD[3]。其中，近55%的聲嘶患者存在LPRD[4]。體外實驗是研究LPRD發生機制和探討療效的關鍵。因此，建立LPRD動物模型具有重要意義。目前，關于LPRD的動物模型以新西蘭兔為主，多以食管內支架為基礎建立模型，但各有優缺點。本研究在國內外相關研究的基礎上，經過改進，建立方便易行的LPRD動物模型，旨在為臨床提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和分組

選取2021年1月－2021年5月采用球囊擴張食管下括約肌（lower esophageal sphincter，LES）及食管上括約肌（upper esophageal sphincter，UES）來制造的，生理狀態相似的健康普通級新西蘭兔LPRD模型32 只，以隨機數表法對其進行編號，并將實驗兔分為實驗A 組（n=11）、實驗B 組（n=11）和對照組（n=10）。實驗兔均為雄性，年齡5個月，體重2.5～3.0 kg。實驗A組采用球囊擴張UES和LES；實驗B組以食管內支架為基礎擴張UES，聯合球囊擴張LES[5-6]；對照組在UES及LES處置入食管球囊，但不行食管球囊擴張。所有實驗兔在標準實驗室環境下適應性飼養3 d，再行建模操作。比較3 組實驗兔喉咽部喉鏡下反流體征評分量表（reflux finding score，RFS）的評分，監測3組實驗兔的喉咽部pH，并記錄組織病理學變化[5-6]。本研究經杭州師范大學動物倫理委員會批準，嚴格遵循實驗動物使用指南及福利原則。

1.2 材料

球囊擴張導管（南京微創，型號：BDC-10/55-7/18，直徑10.0 mm，長度55.0 mm），壓力泵（南京微創，長度1 800.0 mm），金屬支架（南京微創，型號：MTNDA-S-8/50-2.7/1800，直徑8.0 mm，長度5.0 cm），推送器[南京微創，內鏡逆行胰膽管造影術（endoscopic retrograde cholangiopancreatography，ERCP）置入器，直徑2.7 mm，長度1 800.0 mm，導絲：直徑0.89 mm（0.035 in）]，咽喉反流監測使用Digitrapper?反流測試系統（Medtronic，美國），內鏡系統及鼻竇內鏡（歐亞，直徑4.0 mm，長度175.0 mm）。實驗兔購于余姚市泗門鎮建飛實驗兔養殖場[動物許可證號：SCXK（浙）2021-0004]。

1.3 建立新西蘭兔模型手術方法及術后處理

術前分別禁飲禁食8 h。實驗兔麻醉給予30 mg/kg 3%濃度的戊巴比妥鈉耳緣靜脈注射，麻醉后實驗兔仰臥于手術臺上，固定頭部及四肢，以直角開口器撐開兔嘴。

1.3.1 食管球囊擴張LES經鼻胃管置入球囊至胃內，鼻胃管及球囊插入食管內的長度（以門齒為基準）約35 cm。其中，新西蘭兔門齒距賁門的距離為22 cm，未擴張的球囊長度約6 cm，球囊前導絲約4 cm，鼻胃管內可見胃液反流。固定球囊，退出胃管約10 cm，然后將一定量的蒸餾水（約6 mL）注入球囊內以擴張球囊，向外拉球囊和鼻胃管，直至球囊的近端卡在胃賁門處無法向外拉。將球囊內蒸餾水抽干，固定鼻胃管，向外拉出球囊使其中點位于胃食管交界處。緩慢注入蒸餾水，使囊內壓力加至10 psi（1 psi=6.895 kPa），維持5 min，充分擴張LES，中間休息3 min再重復擴張球囊一次，共擴張2次。見圖1。

圖1 球囊擴張LESFig.1 Balloon dilation of LES

1.3.2 食管球囊擴張UES經鼻胃管將球囊置入食管內，鼻胃管及球囊插入食管內的長度（以門齒為基準）約20 cm（門齒到環咽肌的長度約10 cm），固定球囊，向外拉鼻胃管約10 cm，在內鏡直視下確定球囊位于環狀軟骨以下位置，向球囊內緩慢注入蒸餾水，使球囊內壓力增加至10 psi，維持5 min，使UES 充分擴張，中間間隔3 min，共重復2 次。見圖2。

圖2 球囊擴張UESFig.2 Balloon dilation of UES

1.3.3 食管上段置入金屬支架經鼻胃管將置入系統的導絲置入距離門齒約20 cm處的食管內。在內鏡直視下，通過置入系統，將金屬支架釋放在食管內，彈開后，呈空心圓柱狀的支架可提供支撐力支撐UES。在兩側臼齒中間的軟腭處，固定支架頂端的絲線，防止支架位置變動以及絲線被實驗兔咬斷。24 h后剪斷絲線并撤除。見圖3。

圖3 支架擴張UESFig.3 Stent dilation of UES

1.4 術后處理

手術中密切監測實驗兔呼吸及心跳狀況，如遇呼吸困難等情況，立即中止實驗。為預防術后感染，術后30 min內，對實驗兔肌肉注射40萬u青霉素鈉注射液。術后實驗兔給予含5%糖鹽水飼養，禁食24 h后，給予標準飼料飼養。

1.5 觀察指標

1.5.1 一般狀態術后定期觀察3組實驗兔的一般狀態，包括：體重、食欲和死亡情況等，比較3組實驗兔之間的差異。

1.5.2 新西蘭兔上消化道2 h pH 監測采用pH監測系統監測所有實驗兔術后第2 和4 周的24 h 上消化道pH值。①電極放置：采用鹽酸羥甲唑啉（5 mL∶1.25 mg）收縮實驗兔鼻黏膜血管，并用2%利多卡因膠漿行鼻黏膜表面麻醉，在pH 為4.0 和7.0 的緩沖液中校準電極，將電極從鼻腔經鼻咽部插入口咽部；在內鏡直視下，將電極插入至食道入口下方，此時，探頭與前鼻孔距離為11.0～12.0 cm；為防止電極移動，使用絲線縫合，電極固定于前鼻孔和鼻背部，在實驗兔背部安裝無線數據發射器，將電極線越過實驗兔頭頂與發射器連接，給實驗兔穿上特制的衣服，防止實驗設備脫落；記錄2 h 內的實驗兔喉咽部pH 值（圖4）；②pH監測結果的獲取[7]：實驗結束后，使用儀器配套的分析軟件（AccuView pH-Z）對所得數據進行分析，當pH值達到直立位＜5.5和臥位＜5.0時，視為1次反流事件[5]；記錄2 h內咽喉反流的次數、反流時間占比和最長反流時間。建模成功的標準為：直立位2 h內，反流事件＞1次[8]（圖5）。

圖4 pH監測示意圖Fig.4 Schematic diagram of pH monitoring

圖5 pH監測系統Fig.5 pH monitoring system

1.5.3 喉鏡檢查和RFS分別于建模前3天和建模后4周，對實驗兔采用喉鏡檢查并拍照，參照RFS對圖像進行評分。評分系統包括：聲門下、聲帶及喉彌漫性水腫、紅斑或充血、肉芽腫、后聯合增生、喉內黏稠黏液附著和喉室消失等[9]。

1.5.4 病理檢查手術4 周后采用戊巴比妥鈉（100 mg/kg）過量麻醉并處死所有實驗兔，取UES 和聲帶等組織，采用10%甲醛溶液固定，石蠟切片后行HE染色，在光鏡下觀察組織病理學改變。

1.6 統計學方法

選用SPSS 22.0 軟件分析數據，符合正態分布的計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用方差分析，組內前后比較采用t檢驗；不符合正態分布的計量資料以中位數（四分位數）[M（P25，P75）]表示，組間比較及組內前后比較均采用Kruskal-WallisH秩和檢驗；計數資料以率表示，采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 LPRD建模結果

實驗A 組11 只實驗兔建模成功9 只，建模失敗1只，建模死亡1只，死于喉梗阻。實驗B組11只實驗兔建模成功8 只，建模失敗2 只，建模死亡1 只，死于肺部感染。對照組10只實驗兔建模成功0只，建模失敗10只，建模無死亡。實驗A組和實驗B組的建模成功率及死亡率比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。

2.2 喉鏡RFS評分結果

實驗A 組建模前3 天RFS 為（2.90±1.37）分，建模后4周為（8.60±2.32）分；實驗B組建模前3天RFS為（3.10±1.20）分，建模后4周為（8.40±1.84）分；對照組建模前3天RFS評分為（2.40±1.35）分，建模后4周為（2.60±1.17）分。實驗A組與實驗B組組內建模前后RFS 比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。對照組建模前后無明顯差異。見圖6。

圖6 3組新西蘭兔術前及術后喉鏡圖像Fig.6 Preoperative and postoperative laryngoscopy images of three groups of New Zealand rabbits

2.3 咽喉部pH值監測結果

2.3.1 實驗A 組和實驗B 組建模前后建模成功的實驗A 組，建模前3 天、建模后2 和4 周的酸反流事件數（次）分別為0.00（0.00，0.00）、4.00（4.00，6.00）和4.00（2.75，5.00）次；建模成功的實驗A組，建模前3 天、建模后2 和4 周的酸反流時間百分率（%）分別為0.00（0.00，0.00）%、17.50（15.40，19.00）%和16.45（13.30，19.90）%；建模成功的實驗A 組，建模前3 天、建模后2 和4 周的最長反流時間（s） 分別為0.00 （0.00，0.00）、27.00 （18.00，33.00）和20.00（17.75，24.75）s。建模成功的實驗B 組，建模前3 天、建模后2 和4 周的酸反流事件數（次）分別為0.00（0.00，0.00）、4.00（2.75，5.00）和4.00（2.00，5.00）次；建模成功的實驗B 組，建模前3天、建模后2和4周的酸反流時間百分率（%）分別為 0.00 （0.00， 0.00）% 、 17.50 （12.93，19.15）%和26.50（20.40，28.25）%；建模成功的實驗B 組，建模前3 天、建模后2 和4 周的最長反流時間（s） 分別為0.00 （0.00，0.00）、25.50 （20.75，32.75）和23.00（15.50，27.00）s。實驗A 組和實驗B 組酸反流事件數（次）、酸反流時間百分率（%）及最長反流時間在建模前3 天、建模后2 和4 周組內比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）。

2.3.2 對照組建模前后對照組建模前3天、建模后2和4周的酸反流事件數（次）分別為0.00（0.00，0.00）、1.00（1.00，1.75）和1.00（0.25，1.75）次；建模前3 天、建模后2 和4 周的酸反流時間百分率（%） 分別為0.00 （0.00，0.00）%、0.20 （0.10，2.75）%和0.80（0.28，1.50）%；建模前3 天、建模后2 和4 周的最長反流時間（s）分別為0.00（0.00，0.00）、2.50 （2.00，4.75） 和4.50 （3.00，7.00） s。對照組酸反流事件數（次）、酸反流時間百分率（%）及最長反流時間在建模前3 天、建模后2 和4 周組內比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。

2.3.3 3 組實驗兔比較建模后2 和4 周，實驗A組和實驗B組酸反流事件數、最長反流時間和酸反流時間百分率較對照組均有提高，差異有統計學意義（P＜0.05）。實驗A 組和實驗B 組比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。見附表。

附表 3組實驗兔建模后2和4周觀察指標比較 M（P25，P75）Attached table Comparison of observation indexes 2 and 4 weeks after the establishment of the model among the three groups of experimental rabbits M（P25，P75）

2.4 病理檢查結果

對照組喉咽部及食管上端黏膜未見明顯炎癥。實驗組食管及喉咽部黏膜均可見慢性炎癥，喉咽部黏膜可見大量淋巴細胞和漿細胞浸潤，伴腺體增生和間質水腫；食管黏膜表現為淋巴細胞浸潤，局部鱗狀上皮可見角化不全。見圖7。

圖7 3組病理特點Fig.7 Pathological features in three groups

3 討論

對于LPRD發生機制的研究及治療方法療效的探討，體外實驗必不可少。因此，建立LPRD 動物模型，尤其是如何簡便、安全地建立動物模型，是體外實驗的基礎，具有重要意義[10]。在實驗動物的選擇上，豬[11]和狗[12]因其咽喉黏膜上皮組織與人類最為相似，被認為是最佳的建模動物[13]。但存在建模周期長、購買價格貴、養育成本高和基因庫相對不完善等問題。這使得新西蘭兔[14-15]及大鼠[16-17]成為了應用最為廣泛的實驗動物。但是，鼠的咽喉黏膜與人非角化復層鱗狀上皮不同，其角化上皮能抵抗一定的反流物，而兔的咽喉黏膜與人體組織相近，且對反流抗性弱，更易建模，具有良好的經濟性。因此，兔成為建立LPRD動物模型的首選。目前，常見的建模方法基本都參照胃食管反流病動物模型的建模方式[18-19]，包括：外源性和內源性。外源性方法是指：在實驗動物咽喉部涂抹一種或多種外源性物質，包括：胃酸、胃蛋白酶和膽鹽等，模仿人咽喉反流物，刺激咽喉部上皮組織，使其產生炎癥及潰瘍，最終引起LPRD[20]。這種方法操作簡單易行，對于實驗動物的刺激性小，成活率高，劣勢在于人咽喉反流物較為復雜，單一或者多種（胃酸、胃蛋白酶和膽鹽等）外源物質不能完全模擬人咽喉反流物及LPRD的發生過程。而內源性方法則是通過咽喉手術，人為改變實驗兔的胃腸道解剖結構，使反流屏障被破壞，從而達到加強動物自身胃腸內容物的反流效果，包括：賁門肌松弛術、賁門置管術、幽門縮窄術[21]、鼻飼管置管術[15]、LES 球囊擴張和UES 支架植入[5]等。內源性方法的優點在于：更加擬合LPRD的病理生理過程，可從發生機制上說明問題；缺點在于：手術及麻醉風險較大，對于術者要求高，動物成活率較外源性方法低。有研究[22-24]通過大鼠模型發現，減少大鼠睡眠時間和給予高脂飲食可誘發LPRD，該研究從病因學的角度對LPRD 動物模型進行探索，研究意義大，但建模時間過長，實驗中混雜因素過多。

LPRD 相關機制的研究極少。胡穎[25]在新西蘭兔模型的研究中發現，LPRD 的食道和喉上皮細胞間隙擴大，且在大鼠模型上發現claudin-3 表達水平明顯降低。FENG 等[11]用巴馬小型豬建立LPRD 模型，也證實了喉上皮細胞間隙擴大，并認為橋粒明顯減少。這兩項研究均可證明喉咽黏膜屏障被破壞。針對產生損傷的機制，有研究[26]基于新西蘭兔模型發現：白細胞介素-8 和血管內皮生長因子可能與咽喉反流和喉癌的發病機制有關，但LPRD的相關機制仍需進一步開展。

本實驗借鑒了LES 球囊擴張和UES 支架置入法，并予以改進。但原方法中UES金屬支架固定困難，易脫落到胃中，難以保證UES擴張效果，且支架難以取出，金屬支架多次使用后還會出現金屬絲變形，可能損傷血管導致大出血，也可能破壞食管組織導致穿孔。因此，本研究通過球囊擴張UES，對UES解剖結構造成破壞。但在實驗過程中發現：利用球囊對UES進行擴張易導致實驗兔窒息，需在喉鏡直視下操作，避免球囊導管擴張后堵塞聲門。另外，本研究還發現，在進行LES球囊擴張后，直接上拉球囊進行UES球囊擴張，易引起喉痙攣及誤吸，導致實驗兔在手術過程中死亡；而在LES 球囊擴張后先從食管退出球囊，再重新插入食管，進行UES球囊擴張，可有效避免誤吸及喉痙攣，降低死亡發生率。

本研究顯示，有效擴張新西蘭兔LES及UES可使實驗兔形成LPRD；建模后pH值監測結果顯示：實驗兔各項反流指標均明顯提高；組織病理學檢查顯示：實驗組新西蘭兔喉咽部及食道黏膜淋巴細胞廣泛浸潤，提示黏膜發生不同程度慢性炎癥。這表明：通過有效擴張實驗兔LES 及UES，可以建立LPRD 實驗兔模型。本研究有效地擴張了新西蘭兔LES及UES，且建模成功率高，符合LPRD病理生理過程，適用于體外研究，相較于LES球囊擴張聯合UES支架固定，操作相對簡便，術后死亡率更低。

綜上所述，本研究通過擴張LES和UES，成功建立了LPRD 兔模型，經pH 監測、RFS 評分及病理檢查，驗證了模型的有效性，與LES球囊擴張和UES支架固定法相比較，成功率和死亡率差異無統計學意義。但本研究的建模方法具有一定的局限性：實驗過程中，實驗動物并發了較嚴重的胃食管反流。而臨床中的LPRD患者常不伴有胃食管反流，本模型也無法對此做出解釋[27]。目前，本研究團隊致力于一種新型LPRD 檢測試劑的開發，已在本模型上應用，并取得了較好的檢測效果，為進一步開展臨床試驗及深入的分子機制研究奠定了基礎，具有實用性。