生物質炭載體聯合有益菌防控番茄土傳青枯病的效果研究*

王孝芳，梅新蘭，黃大鵬，徐大兵，楊天杰，韋 中?，徐陽春，沈其榮

（1. 南京農業大學資源與環境科學學院/作物免疫重點實驗室/江蘇省固體有機廢棄物資源化高新技術研究重點實驗室/江蘇省有機固體廢棄物資源化協同創新中心/資源節約型肥料教育部工程研究中心/國家有機類肥料工程技術研究中心，南京 210095；2. 湖北省農業科學院植保土肥研究所，武漢 430064）

在經濟作物種植區，由于化肥農藥的長期過量投入和經濟作物單一連作，導致土傳病害頻發，造成重大的經濟損失。土傳病害是高強度利用下土壤生物功能退化的重要表現之一。以土傳青枯病為例，全國大部分地區均能檢測到該病害的致病菌（，簡稱青枯菌），且能夠侵害200 多種重要的作物，被視為最嚴重的細菌性土傳病害。根際是土傳病原菌入侵植物的關鍵位點，病原菌通常利用寄主植物根際豐富的資源大量增殖，進而入侵作物根系。大量研究表明，土壤中豐富的微生物，如細菌、真菌、病毒以及一些小型的原生生物等能夠有效抑制病害的發生，它們通過競爭、寄生、捕食等多種方式構筑了抵御病原菌入侵植物根系的防線。有益菌芽孢桿菌因其較強的拮抗能力被廣泛應用于土傳青枯病的防治。但土壤環境復雜多變，溫度、濕度、養分等均能夠影響有益菌的生防效果，生產上施用單一有益菌的防控效果通常不穩定。有益菌在植物根際穩定定殖是其發揮生防作用的關鍵，為提高有益菌的生防效率，本研究提出為有益菌提供載體，提高其在根際的定殖能力。

生物質炭作為一種具有吸附性能的多孔性材料，在改善土壤結構、肥力的同時，可為微生物的生長提供營養，是有益菌載體的良好選擇。富含碳的生物質在無氧或缺氧條件下經過高溫裂解生產出一種高度芳香化、富含碳素的多孔固體顆粒物質，其具有巨大的表面積和多孔結構，能夠吸附根系分泌物。研究表明，生物質炭能夠吸附或轉移植物根系分泌物中低分子量物質，限制病原菌入侵。另一方面，生物質炭多孔結構能夠為細菌的生長和增殖提供合適的棲息地和資源，有利于微生物在生物質炭孔徑表面形成生物膜，生物質炭還能夠顯著改變土壤微生物群落的結構和功能。有研究表明，生物質炭能夠一定程度上去除連作土壤中的化感物質殘留，降低蘆葦根腐病的發生；桉樹樹木和溫室有機廢料制成的生物質炭能夠有效降低黃瓜猝倒病的發生。但以生物質炭作為有益菌載體的研究相對較少，其中的機制也有待進一步研究。本試驗以番茄土傳青枯病為病理模型，研究玉米秸稈、木塊和稻殼3 種不同原料制備的生物質炭為載體，對有益菌——解淀粉芽孢桿菌T-5防控土傳青枯病效果的影響，并從“空間”和“資源”轉移的角度，探究生物質炭與有益菌聯合抑菌的潛在機制。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試菌株：青枯菌，分離自南京市麒麟鎮發病番茄根際強致病力的青枯菌QL-Rs1115（簡稱RS），以及QL-Rs1115 的紅色熒光蛋白（RFP）標記菌株QL-RFP（簡稱RS-RFP）。有益菌，分離自發病區的健康番茄根際，具有較強抑菌能力的解淀粉芽孢桿菌T-5。

供試生物質炭：裂解溫度為400℃，分別為南京勤豐秸稈科技有限公司的玉米秸稈生物質炭（maize straw）、南京林業大學生物與環境學院環境工程系的木塊（松木）生物質炭（wood）和稻殼生物質炭（rice husk）。

1.2 生物質炭基礎特性檢測

利用pH 計（Sartorius PB-10，Goettingen，德國）對炭水比為1∶20（w∶v）的生物質炭懸液測定pH。利用比表面積及孔徑分析儀（V-Sorb 2008P，金埃譜，北京）測定生物質炭的比表面積。利用亞甲基藍吸附試驗測定生物質炭物理吸附能力。

1.3 盆栽試驗方法

Micro-Tom 番茄種子經表面消毒后，30 ℃催芽兩天后播種至育苗盤中。三至四葉期番茄苗移栽至6 孔大育苗盤中，每孔大約600 g 土，試驗設置8 個處理：（1）僅接種青枯菌RS；（2）接種青枯菌和有益菌T-5；（3）～（5）接種青枯菌和三種生物質炭；（6）～（8）接種青枯菌和有益菌及三種生物質炭。青枯菌和有益菌接種懸液的制備方法：利用牛肉膏蛋白胨（NA）培養基活化青枯菌RS 和有益菌T-5，獲得單菌落轉接至 NA 液體培養基，30 ℃，170 r·min培養24 h。將新鮮菌液6 000 r·min常溫離心5 min，收集菌體，利用生理鹽水（9.5 g·kgNaCl）重懸并調節OD=1.0。有益菌與生物質炭混合懸液的制備方法：生物質炭與有益菌菌液混合，30 ℃、170 r·min震蕩2 h，使二者充分混勻吸附。移栽一周后，按照不同處理以灌根方式接種有益菌、生物質炭及其混合懸液，其中有益菌的接種量為10CFU·g土，生物質炭的接種量為10 g·kg（w∶w，生物質炭：土壤）。接種有益菌和生物質炭一周后接種青枯菌RS 菌液（10CFU·g土）。每個處理3 個6 孔育苗盤（3 個重復），共18 株番茄。所有的盆缽定期隨機移動位置，減少誤差。溫室的溫度白天22～32 ℃，夜間20～25 ℃。5 周后番茄發病率趨于穩定，統計植株的發病情況。從各處理的每個重復中隨機取一株健康植株，保存根際土壤樣品，一部分用來提取土壤DNA，定量青枯菌的數量；一部分土壤樣品通過稀釋涂布檢測有益菌定殖的數量。

根際病原菌和拮抗菌數量的測定：利用 MO BIO 的強力土壤DNA 提取試劑盒（PowerSoilDNA Isolation Kit）提取根際土壤的DNA，檢測DNA 濃度和純度。病原菌數量的測定采用熒光定量PCR 的方法，使用SYBRPremix Ex Taq（Takara，寶生物工程有限公司）試劑盒。擴增引物為青枯菌的特異性引物，F：5′-GAACGCCAACGGTGCGAA CT-3′，R：5′-GAACGCCAA CGGTGCGAACT-3′，濃度為10 pmol·μL；定量PCR 反應體系為20 μL：SYBRPremix Ex Taq（2×）10 μL，ROX reference Dye II（50×）0.4 μL，前端引物 0.8 μL，末端引物 0.8 μL，DNA 模板 2.0 μL，ddHO 6 μL；反應步驟為：95℃ 30 s，95℃ 5 s，60℃ 34 s，返回第二步，40 個循環；95℃ 30 s。擴增產物特異性表現為單一的熔融峰，且2%凝膠電泳檢測僅為一條條帶。有益菌數量的測定采用選擇性平板稀釋涂布法：稱取根際土3 g，加27 mL 無菌ddHO，37 ℃、170 r·min搖床中震蕩2 h，梯度稀釋涂布于通用的芽孢桿菌選擇性培養基（V8 培養基：V8 果蔬汁326 mL·L，氯化鈉 33.0 g·L，葡萄糖0.8 g·L，調節pH 至6.0。倒平板前加入放線菌酮 45 mg·L，多黏菌素22.5 mg·L）。37 ℃培養48 h 后，統計平板上的菌落數。以不接種有益菌T-5 的處理為對照，接種有益菌后根際增加的芽孢桿菌來表征有益菌的定殖數量。

1.4 室內試驗方法

生物質炭對青枯菌的吸附試驗： 采用Rivera-Utrilla 等報道的方法檢測生物質炭對細菌吸附能力。將活化的RS 菌液用生理鹽水洗滌重懸，調節OD為0.5（～10CFU·mL）。將0.1 g 生物質炭和 10 mL RS 菌液混合，放置于 30 ℃、170 r·min搖床中震蕩2 h，取出靜置15 min，吸取上清液進行稀釋，涂布于SMSA 培養基（semiselective medium for South Africa，半選擇性培養基），以未經生物質炭處理的菌液為對照，30 ℃培養48 h后計數。與對照相比，生物質炭處理后青枯菌的相對減少量用來表征生物質炭吸附青枯菌的能力。

生物質炭對青枯菌的固持作用試驗：利用青枯菌對根系分泌物的趨化試驗來檢驗青枯菌逃離生物質炭的能力，從而評估生物質炭固持青枯菌的能力。采用Rudrappa 等毛細管實驗方法測定青枯菌的趨化能力：將生物質炭和青枯菌菌液按照1∶100（w∶v，g∶mL）比例混合，30 ℃、170 r·min震蕩2 h。1 mL 注射器吸取100 μL 模擬根系分泌物培養基（RE 培養基），排凈氣泡；用無菌槍頭吸取生物質炭與青枯菌混合懸濁液100 μL，將裝有RE培養基的注射器針頭從槍頭尖端插入，使兩者中的液體形成連通，以未經生物質炭處理的青枯菌菌液處理為對照，30 ℃恒溫靜置2 h 后，對注射器內的液體進行稀釋涂布，30 ℃培養48 h 后統計菌落數量。

生物質炭對根系分泌物的吸附試驗：將生物質炭和根系分泌物（RE 培養基）按照1∶100（w∶v）混合，30 ℃、170 r·min搖床中震蕩2 h，懸液經無菌的0.22 μm 水系濾膜過濾獲得無菌懸液，作為培養基接種至96 孔細胞培養板中（200 μL 體系）用于培養青枯菌RS（～10CFU·mL），以未經生物質炭處理的RE 培養基為對照，測定36 h 群落的OD值，以各處理中青枯菌的生長間接表征生物質炭對根系分泌物的吸附能力。

有益菌利用根系分泌物對青枯菌的抑制作用試驗：含196 μL 根系分泌物（RE 培養基）的96 孔細胞培養板中接種2 μL RS-RFP（～10CFU·mL），2 μL 有益菌T-5（～10CFU·mL），30 ℃，170 r·min震蕩培養，每隔6 h 用酶標儀（SpectraMax M5，Molecular Devices，美國）測定群落的熒光值，表征青枯菌的生長情況。30 μL 有益菌T-5 懸液（～10CFU·mL）接種至含3 mL RE 培養基中，30 ℃，170 r·min震蕩培養，分別在12、24、36 和48 h 取培養物，12 000 r·min常溫離心5 min，離心過濾得到無菌發酵液。利用平板對峙法檢測該發酵液的抑菌能力。具體做法如下：10 mL RS 懸液（～10CFU·mL）與100 mL 冷卻至50 ℃的NA 半固體培養基混合均勻，制備平板，待平板冷卻凝固后在中央打孔，添加50 μL 有益菌發酵物至孔中，30 ℃培養基培養24 h，測定抑菌圈的大小。

1.5 數據處理

試驗數據處理使用IBM SPSS Statistics 22 統計分析，采用 SigmaPlot 12.5 作圖，并使用鄧肯（Duncan’s）新復極差法檢驗差異顯著性（＜0.05）。

2 結 果

2.1 生物質炭的基礎特性

3 種不同來源的生物質炭的pH 均大于8，且差異顯著（＜0.001，表1），其中木塊生物質炭（wood）的pH 最低，為8.69。比表面積是影響生物質炭吸附能力的重要物理指標之一。3 種生物質炭的比表面積存在較大的差異（＜0.001，表1），其中木塊生物質炭的比表面積顯著高于其他2 種生物質炭，達到395.9 m·g，玉米秸稈生物質炭的比表面積最低。不同生物質炭對亞甲基藍溶液的吸附能力存在較大的差異，木塊生物質炭在24 h 的吸附總量達到116.4 mg·g，顯著高于其他兩種原料的生物質炭（＜0.001，表1）。

表1 不同生物質炭的理化特性Table 1 Physiochemical properties of biochar relative to sources

2.2 生物質炭載體與有益菌聯合防控青枯病的效果

與對照相比，有益菌或生物質炭單獨處理均能夠降低青枯病的病情指數（有益菌單獨：0.004；生物質炭單獨：＜0.001，圖1a）。有益菌與生物質炭配合能夠進一步提高有益菌防控青枯病效果，與有益菌單獨處理相比平均提高了89.34%。不同生物質炭單獨施用時對青枯病病情指數的影響差異顯著（= 0.047），但與有益菌聯合后處理間差異不顯著。木塊生物質炭與有益菌組合表現出協同效應，顯著提高了青枯病的防控效率，與木塊生物質炭單獨處理相比提升了18.61%。

進一步檢測番茄根際青枯菌的數量，結果表明，與僅接種青枯菌的對照處理相比，添加有益菌或3種不同來源生物質炭均能降低根際病原菌數量（有益菌單獨：0.001；生物質炭單獨：＜0.001，圖1b）。不同生物質炭與有益菌聯合時對根際病原菌數量的影響差異顯著（＜0.001，圖1b）。其中木塊生物質炭與有益菌聯合效果最佳，降低了97.42%的病原菌入侵根際。

生物質炭作為有益菌載體同時添加時，能夠顯著提高有益菌在根際的定殖（＜0.001，圖1c）。與直接接種有益菌的處理相比，玉米秸稈和木塊生物質炭處理下有益菌定殖量分別提高了 5.73 倍和5.71 倍。

圖1 不同生物質炭聯合有益菌處理對青枯病病情指數（a）、根際青枯菌（b）和有益菌（c）定殖的影響Fig. 1 Effect of combined application of biochar and probiotics on disease index (a) and population of pathogens (b) and probiotic colonization(c) in rhizosphere soil relative to kind of the biochar

2.3 生物質炭載體與有益菌聯合抑制青枯菌的機制

利用室內模擬試驗探究生物質炭聯合有益菌防控青枯病的潛在機制。首先檢測不同生物質炭對青枯菌的直接吸附作用，涂布計數結果表明，不同生物質炭對青枯菌的吸附效率平均達到80.42%，處理之間差異顯著（0.001，圖2a）。其中，木塊生物質炭的效果顯著優于玉米秸稈和稻殼生物質炭，對青枯菌的吸附效果最佳，能夠吸附88.45 %的青枯菌（圖2a）。

利用趨化試驗檢測不同生物質炭對青枯菌的固持作用。不同生物質炭的固持效果差異明顯，由高到低依次為：木塊生物質炭、玉米秸稈生物質炭、稻殼生物質炭（0.001，圖2b）。木塊生物質炭的固持效果顯著高于其他兩種生物質炭，阻止94.66%的青枯菌逃離生物質炭。

圖2 不同生物質炭對青枯菌的吸附（a）和固持（b）能力Fig. 2 Biochar’s R. solanacearum adsorption (a) and the retention (b) capacities relative to kind of the biochar

利用不同生物質炭吸附根系分泌物，然后檢測青枯菌利用這些根系分泌物的能力，以青枯菌的生長情況間接表征生物質炭對根系分泌物的吸附能力。青枯菌在經生物質炭吸附后的根系分泌物中的生長明顯受到抑制，說明根系分泌物中部分有效營養物質被生物質炭吸附，營養供應不足導致青枯菌生長受阻。3 種生物質炭中，木塊生物質炭和玉米秸稈生物質炭對根系分泌物的吸附顯著高于稻殼生物質炭（0.001，圖3a）。

以上研究說明生物質炭能夠有效吸附根系分泌物，進一步分別利用共培養體系和平板對峙的方法，評估有益菌利用根系分泌物對青枯菌的營養和拮抗競爭作用。青枯菌單獨培養時生長隨時間呈現“S”形，當與有益菌T-5 共培養時，青枯菌的生長受到明顯抑制（圖3b）且抑菌效果穩定。拮抗競爭的結果表明有益菌以根系分泌物為營養時，能夠顯著抑制青枯菌的生長，且抑菌效果隨著時間逐漸增強，在36 h 有益菌產生的抑菌物質活性最高，抑菌圈最大（圖3c）。

圖3 不同生物質炭對根系分泌物的吸附能力（a）及有益菌利用根系分泌物對青枯菌的抑制作用（b，c）Fig. 3 Biochar’s root exudate adsorption rate (a) and effect of probiotics utilizing root exudates and inhibiting R. solanacearum (b，c)

3 討 論

3.1 生物質炭載體與有益菌聯合能夠有效抑制病原青枯菌入侵

生物質炭是集肥料、改良劑和吸附劑于一體的多孔性材料，在土傳病害的防控中表現出巨大的潛力。本研究提出以生物質炭作為有益菌的載體，充分發揮生物質炭的物理吸附作用和有益菌高效抑菌的優勢，減少根際病原菌可利用的資源，增強有益菌根際定殖能力，最終提高有益菌的防控效果。以3 種不同原料制備的生物質炭為載體，利用盆栽試驗探究生物質炭對有益菌防控番茄土傳青枯病效果的影響。結果發現，生物質炭載體與有益菌聯合能有效降低青枯病的發病指數和根際病原菌數量（圖1a 和圖1b）。不同生物質炭作為載體對有益菌生防效果的增強作用存在差異，其中木塊生物質炭的效果最好。這可能與木塊生物質炭具有較大的比表面積和物理吸附能力有關。三種生物質炭中，木塊生物質炭的比表面積達到396.9 mm，吸附能力達到了116.4 mg·g，顯著優于其他兩種生物質炭（表1）。研究表明，生物質炭的物理性質（表面面積和孔結構）和化學性質（表面化學性質）共同決定生物質炭的吸附能力，而生物質炭的吸附能力是其發揮作用的關鍵。所以，木塊生物質炭的大比表面積和強吸附性能一定程度解釋木塊生物質炭載體聯合有益菌對土傳青枯病的防控效果最佳。與單獨接種有益菌相比，本研究發現，以不同生物質炭為有益菌的接種載體，能夠顯著提高有益菌在根際的定殖能力（圖1c）。生物質炭的施用可增加土壤的碳儲量、土壤的肥力和質量。大量研究表明，生物質炭能夠通過改變土壤微生物的生境或直接影響微生物的代謝調控根際微生物群落的結構和功能。生物質炭豐富的孔隙結構和巨大的表面積能夠為土壤微生物提供庇護所；生物質炭顆粒上附著的營養物質可為微生物的生長提供養分；生物質炭通過改善微生物生長的土壤特性（包括通氣條件、水含量和pH）來改變微生物棲息地等。

3.2 生物質炭載體與有益菌聯合抑制病原青枯菌可能的機制

本研究發現，生物質炭能夠直接吸附青枯菌，吸附效率達到88.45%（圖2a）。但青枯菌處于動態過程，一旦生物質炭內部的營養物質消耗殆盡或外界出現信號物質的誘導，青枯菌隨時會逃逸出生物質炭。所以生物質炭不僅需要有效吸附青枯菌，還需有較強的固持能力。前人研究很少同時評估生物質炭的吸附和固持能力，本試驗利用離體的趨化性試驗，模擬了生物質炭對青枯菌的固持作用，結果發現生物質炭能夠有效阻止青枯菌的逃逸，其中生物質炭的固持效果達到94.66%（圖2b）。生物質炭對病原青枯菌的吸附作用除了與其強吸附能力有關，還可能與生物質炭吸附根系分泌物資源、誘導青枯菌進入生物質炭有關。有研究表明，生物質炭能夠通過吸附根系分泌物而驅動病原菌的趨化作用。植物根系分泌的糖、氨基酸和有機酸等物質是有益菌和病原青枯菌根際營養競爭的核心。除了直接吸附、固持病原菌，本研究還發現3 種生物質炭對根系分泌物也有一定的吸附作用（圖3a）。通常，青枯菌和有益菌之間爭奪資源的“戰場”在根際，但隨著生物質炭對根系分泌物、青枯菌和有益菌的吸附作用，“主戰場”隨之轉移至生物質炭內部。前期研究也發現多種不同資源存在時，能夠同時促進有益菌T-5 的生長和產拮抗物質的能力。共培養和對峙試驗均發現，在模擬根系分泌物中，有益菌能夠有效利用根系分泌物，抑制青枯菌的生長（圖3b，圖3c）。說明有益菌以生物質炭為載體，能夠高效利用根系分泌物資源，產生拮抗物質抑制病原青枯菌的生長。

基于現有的結果，本研究提出生物質炭作為有益菌載體，增強有益菌抵御病原青枯菌入侵番茄根際的潛在機制，如圖4 所示：首先，生物質炭吸附根系分泌物和青枯菌，誘導青枯菌離開根表，進入生物質炭孔隙中（過程1）；然后，生物質炭內部青枯菌因生物質炭的強吸附能力，固持了青枯菌，降低其逃逸（過程2）；最后，生物質炭吸附的有益菌通過競爭根系分泌物資源，減少病原菌資源的可利用性，同時產生大量的抑菌物質，抑制病原菌的生長（過程3）。因為青枯菌與有益菌的互作“戰場”轉移至生物質炭內部，極大減少直接侵害植物的病原菌數量。本研究中生物質炭雖然不能去除根際土壤中的病原青枯菌，但結合有益菌的抑菌作用，能夠有效降低青枯病的發生。下階段將會進一步從植物根際原位探究生物質炭載體與有益菌聯合抑制青枯菌的機制。

圖4 有益菌-生物質炭復合抑制青枯菌入侵番茄根系的作用機制Fig. 4 Mechanism of probiotics- biochar on inhibiting R. solanacearum from invading tomato roots

4 結 論

不同原料制備的生物質炭作為有益菌的載體，能夠有效提高有益菌對番茄土傳青枯病的防控效果，青枯病的發病率和根際病原菌數量均有不同程度的下降，其中比表面積大、吸附能力強的木塊生物質炭的增效作用最強。進一步研究其中的機制，發現生物質炭作為有益菌的載體能夠有效提高有益菌在根際的定殖，同時能夠有效吸附和固持病原菌，對根系分泌物也有一定的吸附作用。說明生物質炭可能通過“營養”和“空間”轉移作用提高有益菌的生防效率。