騰格里沙漠固沙植被區微生境土壤微生物功能群時空格局*

楊貴森，呂星宇，虎 瑞，黃 磊，張志山?

（1. 中國科學院西北生態環境資源研究院沙坡頭沙漠研究試驗站，蘭州 730000；2. 中國科學院大學，北京 100049；3. 北京大學城市與環境學院，北京 100871）

土壤微生物是植物生長過程中養分循環的重要調控者，其種類、數量及空間分布直接或間接反映了生境土壤的特征及轉化規律，是評估土壤發育狀況和植被演替的重要指標。土壤微生物根據功能可劃分為不同的類群。依據在碳、氮、磷循環過程中的作用，土壤微生物可劃分為纖維素分解菌、產甲烷菌、甲烷氧化菌，氨化細菌、硝化細菌、反硝化細菌、固氮菌、溶磷菌等生理類群。植被恢復過程與土壤微生物功能群落密切相關，不同功能群在養分循環中生物學功能各異。纖維素是植物組織的主要成分，是一種非常穩定的化合物。土壤中植物殘體的分解主要由纖維素分解菌完成，如噬纖維素菌屬鐮狀纖維菌屬、包子桿菌、產甲烷纖維芽孢桿菌等，均為分解纖維素能力很強的微生物。它們是碳元素循環中最主要的一類微生物類群，也是自然界生態系統中大氣碳元素循環的重要基礎。氨化細菌能使得動植物殘體中的蛋白質氨化，這類細菌具有蛋白酶和肽酶，能夠水解蛋白質為氨基酸和氨，如枯草芽孢桿菌等。氨化作用產生的銨鹽本身已適用于作為綠色植物的養料，但綠色植物更適合的養料是硝酸鹽，因此，氨化細菌和硝化細菌類群在土壤氮元素循環中發揮重要作用。而芽孢桿菌中的蠟質芽孢桿菌等溶磷菌微生物使土壤中難以被植物吸收利用的磷轉變為可被利用的磷酸鹽。因此，對土壤微生物以功能為單位進行研究，可更好地掌握生物地球化學循環及生態系統的演替規律，特別是對退化生態系統的恢復及提高其生物學功能均有重要的理論和實踐意義。

環境變化直接或間接地影響土壤微生物群落結構和多樣性，進而對整個生態系統產生影響。大量研究表明，土壤類型、土壤理化性質（水分、溫度、pH 和碳氮磷元素含量等）、植被類型及物種多樣性等是影響土壤微生物功能群的重要因素，而在干旱區土壤微生物對上述因素的變化更加敏感。此外，植被恢復年限、植物種、生物土壤結皮（BSC）、季節變化等均被證實能顯著影響干旱沙區土壤微生物數量。已有的研究大多從固沙植被建植后土壤微生物整體的恢復情況及結構和功能等方面進行描述。然而，針對不同年代（老固沙區和新固沙區）、植物種（先鋒種和穩定種）及微生境（灌叢下和灌叢間），以指示碳、氮、磷元素循環中承擔的微生物功能為目標，探索土壤微生物時空變化規律的研究甚少。固沙植被建立后，一方面，物種多樣性增加，植物的凋落物及根系分泌物向土壤中輸入有機質，能夠為微生物的生長和代謝提供基質。另一方面，隨著植被恢復年限增加，BSC的繁衍和拓殖，流動沙丘逐漸被固定，植被的建立減少太陽輻射，有效降低地表溫度并減少土壤水分蒸發，改善土壤水熱狀況。那么，不同的恢復年限、植物種及微生境對土壤微生物數量的空間分布、季節變化以及與土壤理化性質的關系是本研究關心的科學問題。基于此，本研究以騰格里沙漠東南緣沙坡頭地區不同年代建植的固沙植被區土壤微生物為對象，采用傳統培養法研究微生物功能群，是由于該方法在分離具有一定功能的微生物時非常有效，可獲得具有特定功能的微生物種類。雖然可培養的微生物種類有限，但可分離培養的才是人類可利用的微生物，也是該方法在國內外相關研究中被長久應用的原因之一。此外，傳統培養法同目前的微生物研究新技術相比，如功能基因芯片雖然能夠獲得更多的微生物多樣性和功能群的基因數據，但它們不一定在環境中表達，這是上述新技術的不足之處。本文比較了沙區植被恢復過程中不同土壤微生物功能群的時空動態，分析了不同因素（建植年代、微生境、土層和采樣時間）對微生物功能群數量的影響，最后，討論了土壤理化性質與微生物數量的關系。旨在揭示土壤微生物功能群對環境變化的響應機制。研究結果期望為干旱沙區荒漠化防治和沙化土地恢復實踐提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 研究區概況

研究區位于騰格里沙漠東南緣寧夏回族自治區中衛市境內的中國科學院沙坡頭沙漠研究試驗站（37°32′N，105°02′E）。沙坡頭站自1956 年至2010年于不同年代建立的人工固沙植被演替序列為開展沙區恢復生態學的研究提供了理想的試驗平臺。該區處于草原化荒漠與荒漠化草原過渡帶，氣候干旱多風，平均海拔1 300 m，年均氣溫9.6℃，年均降水量180 mm 左右，2017 年降水總量為186.4 mm，主要集中在5—9 月（圖1），年蒸發量3 000 mm，土壤基質為稀疏貧瘠的風沙土。以油蒿（）和檸條（）為主的固沙植被建立后，有利于大量物種的繁殖和定居，使原有的流沙演變成一個復雜的人工-天然復合的荒漠生態系統。

圖1 2017 年1—12 月空氣溫度和降雨量的日變化Fig. 1 Daily air temperatures and precipitations from January to December 2017

1.2 土壤樣品采集

為探究不同恢復年限、不同微生境下的微生物動態特征，分別在沙坡頭站2010 年和1990 年建植的固沙植被區設置樣地，在每個樣地內選擇長勢較好、植株大小均勻的檸條和油蒿各3 株作為重復，植株間隔5 m。然后分別在檸條和油蒿灌叢下、灌叢間設置1 m×1 m 的樣方各3 個，對每個樣方進行編號標記，共24 個樣方（2 個年代×2 種植物×2種微生境×3 次重復）。樣方中的草本植物主要有霧冰藜（）、小畫眉草（）、蟲實（）、刺沙蓬（）、虎尾草（）、沙米（）。沙面形成了BSC，指示土壤碳、氮、磷元素循環為主的微生物得到了較好的發育。

土壤樣品于2017 年1 月15 日、4 月15 日、7月15 日、10 月15 日分四次進行取樣。采樣時，在樣方中按3 個方向120°夾角分3 層（0～5、5～10和10～20 cm）用土鉆采集土樣，然后將3 個點各土層樣品進行混合形成一個復合樣品。新鮮土樣除去草屑、石頭和植物凋落物，過2 mm 網篩。所有的土樣被分成兩部分，一部分分析土壤微生物群落，另一部分分析土壤有機碳（SOC）、全碳（TC）、全氮（TN）、全磷（TP）、堿解氮（AN、NH-N 與NO-N之和）、有效磷（AP）、pH 和電導率（EC）。

1.3 土壤微生物功能群的測定方法

本研究區固沙植被檸條和油蒿樣地中的 BSC發育較好且具有生物固氮作用，沙區土壤偏堿性，低含水量有利于氨化和硝化作用而不利于反硝化作用。鑒于以上特點，在傳統培養法研究土壤微生物中，本研究選擇纖維素分解菌、氨化細菌和硝化細菌、溶磷菌分別作為指示碳、氮和磷元素循環的微生物功能群。采用稀釋培養計數法測定不同微生物功能群數量，通過各種微生物的生理生化特征及外觀形態等進行鑒定。其中，纖維素分解菌使用羧甲基纖維素鈉培養基，氨化細菌使用蛋白胨培養基，硝化細菌使用改良的斯蒂芬遜培養基，溶磷菌使用溶磷菌活化培養基。以纖維素分解菌為例，具體實驗步驟如下：接種 0.05 mL 稀釋度為10g·mL、10g·mL、10g·mL的土壤懸濁液至冷凝的培養基上，用玻璃涂布棒均勻涂抹于培養基表面。30 ℃倒置恒溫培養14 d。分別計算黏液菌、弧菌、真菌和放線菌的數目。最后換算成每克干土中微生物數量。

1.4 土壤理化性質測定

TC 采用總有機碳分析儀（Multi N/C 2100，德國）測定，SOC 采用總有機碳分析儀（vario TOC，Elementar，德國）測定，TN 采用濃 HSO消煮—半自動凱氏定氮儀法測定，NH-N 采用KCl 浸提—蒸餾法測定，NO-N 采用飽和CaSO浸提—酚二磺酸比色法測定，TP 采用 NaOH 熔融—鉬銻抗比色法測定，AP 采用NaHCO浸提—鉬銻抗比色法測定，土壤pH 采用水溶液浸提法（水∶土=5∶1）測定，EC 用電導法測定。

1.5 數據分析

土壤微生物功能群分析：采用重復性再裂區三因素方差分析比較土壤微生物功能群時空變化差異的影響因素，采樣時間為重復因子，樣地、微生境、土層為固定因子。

環境因子分析：將SOC、TN、TC、TP、AN、AP、pH、EC 與纖維素分解菌、氨化細菌、硝化細菌和溶磷菌進行冗余分析（RDA），確定土壤微生物功能群和土壤理化性質間的關系，選擇影響極顯著因子采用擬合函數進行最優擬合，進一步探究理化性質和微生物功能群的關系。

數據預處理方法：利用Excel 2016 軟件對數據進行預處理；采用SPSS22.0 進行統計分析，通過變量的正態性檢驗（Kolmogorov-Smirnov）和方差的同質性檢驗（Levenes）滿足重復性方差分析；樣地、微生境、土層及季節變化的顯著差異采用最小顯著差異法（LSD）比較；采用多因素方差分析檢驗不同因素或處理交互作用的差異顯著性；采用Origin9.1 作圖；利用Canoco5.0 軟件進行RDA 分析。本文中所有數據均為樣方中三次重復的平均值和標準誤差。

2 結 果

2.1 土壤微生物功能群數量時空格局

取樣時間、樣地、微生境和土層均顯著影響土壤微生物功能群纖維素分解菌、氨化細菌、硝化細菌、溶磷菌的數量。其中，取樣時間、樣地和土層對其影響極顯著，微生境對其影響顯著，并且各因素存在明顯的交互作用；取樣時間和樣地、取樣時間和土層、樣地和土層兩兩交互作用及取樣時間、樣地和土層三者交互作用均對微生物功能群數量影響顯著，其他交互作用不顯著（表1）。

表1 土壤微生物功能群數量三因素方差分析Table 1 Variance analysis of three factors affecting the number of soil microbial functional groups

2.1.1 土壤微生物功能群數量空間分布特征 1990年和2010 年建植樣地0～20 cm 土層中纖維素分解菌、氨化細菌、硝化細菌和溶磷菌數量均差異顯著（＜0.05）。1990 年油蒿樣地中四種菌數量分別為2010 年樣地中的4.40 倍、1.50 倍、1.70 倍、1.60倍；1990 年檸條樣地中四種菌數量分別為2010 年的4.40 倍、1.70 倍、1.90 倍、1.80 倍。此外，油蒿生境中微生物纖維素分解菌和溶磷菌數量顯著高于氨化和硝化作用的微生物數量（＜ 0.05）；而在檸條樣地中四種菌數量差異不顯著（＞ 0.05）（圖2）。不同微生境0～20 cm 土層微生物功能群數量不同，油蒿和檸條樣地土壤微生物功能群均表現為灌叢下含量高于灌叢間，1990 年油蒿和檸條地均表現為：從纖維素分解菌、溶磷菌、硝化細菌到氨化細菌依次遞減；但2010 年油蒿地微生物功能群數量表現為：從溶磷菌、硝化細菌、氨化細菌到纖維素分解菌依次遞減（圖2）。

圖2 不同樣地和微生境0～20 cm 土層微生物功能群數量Fig. 2 Numbers of microbial functional groups of 0-20 cm soil layer in different plots and microhabitats

隨著土壤深度的增加各微生物功能群數量呈減少趨勢。除1990 年油蒿樣地 5～10 和10～20 cm土層氨化細菌數量及2010 年檸條樣地0～5 和5～10 cm 土層硝化細菌數量外，其他微生境中各土層微生物功能群數量均差異顯著（＜ 0.05）；尤其固沙植被建立后，0～5 cm 土層不同微生境各土層微生物功能群數量變化最顯著（圖3）。

圖3 不同土層微生物功能群數量Fig. 3 Numbers of microbial functional groups of different soil layers

2.1.2 土壤微生物功能群數量季節變化 不同樣地（1990 油蒿、1990 檸條、2010 油蒿、2010 檸條）土壤微生物功能群季節變化規律表現一致，本研究僅以1990 年油蒿樣地為例對微生物功能群季節變化展示，發現土壤微生物功能群數量具有明顯的季節變化規律。不同土層（0～5、5～10 和10～20 cm）土壤纖維素分解菌季節變化均表現為春低、夏高、秋冬持平，呈現出“V”字型變化特征（圖4a）；氨化細菌和硝化細菌微生物量從冬、春到秋季逐漸上升（圖4b）和圖4c）；溶磷菌含量則表現為從冬季、秋季到春夏季依次遞減（圖4d）。

圖4 土壤微生物功能群數量季節變化（以1990 年建植油蒿樣地為例）Fig. 4 Seasonal variation of the numbers of soil microbial functional groups（taking the planting A. ordosica plot in 1990 as an example）

2.2 影響土壤微生物功能群的土壤理化性質因素

對土壤理化性質和微生物功能群數量的冗余分析（RDA）表明，土壤理化性質對微生物功能群數量總變異解釋率為75.7%，其中TN解釋率最高，高達66.1%（＜0.01），AP 解釋率為3.6%（＜ 0.01）。軸Ⅰ和軸Ⅱ的解釋率為73.4%和1.84%，分別占擬合變異累積解釋率的97.0%和99.5%。前兩個軸解釋了土壤微生物功能群的主要變異來源，能較好地反映土壤微生物與理化性質間的關系。此外，纖維素分解菌、氨化細菌、硝化細菌、溶磷菌與土壤SOC、TN、TC、TP、AN、AP、EC 均呈正相關，而與pH 顯著負相關（圖5）。將TN 和AP 兩個極顯著因素與微生物功能群數量函數擬合發現，TN 與纖維素分解菌和溶磷菌呈線性變化，與氨化細菌和硝化細菌變化對數函數擬合最優；AP 與四種菌均呈對數函數變化（圖6）。

圖5 土壤微生功能群數量和土壤理化性質的冗余分析排序圖（RDA 排序圖確定了土壤微生物功能群（虛線）和土壤理化性質（實線）之間的關系）Fig. 5 Redundancy analysis ordination diagram of soil microbial functional groups and physicochemical properties（Ordination plots of the results from the RDA identify the relationships among the soil microbial functional groups（dashed lines）and soil physicochemical characters（solid lines）

圖6 土壤微生物功能群數量與全氮（TN）和有效磷（AP）的關系Fig. 6 The relationships between the number of soil microbial functional groups with TN and AP

3 討 論

3.1 土壤微生物功能群空間格局

土壤微生物動態變化近年來倍受學者關注，人工植被恢復過程中土壤微生物動態變化的研究主要集中在熱帶、亞熱帶和溫帶地區的闊葉林以及部分地區的針葉林，而干旱沙區開展的研究相對較少。本研究通過對干旱沙區人工固沙植被演替過程中與碳、氮、磷元素循環密切相關的功能群微生物時空變化規律及土壤恢復特征的研究，發現隨固沙年限增加，各微生物功能群數量顯著增加，這與其他學者研究結果一致。原因是流動沙丘土壤貧瘠、生產力低，限制了微生物的發育，而在固沙植被建立后，隨著植被恢復年限增長，歸還土壤的凋落物增加、植物根系的分泌物增多、土壤細粒物質含量增多、土壤養分增加，共同促使微生物量逐漸增加。此外，本研究還表明表層土壤（0～5 cm）較亞表層（5～10 和10～20 cm）具有較高的微生物數量（圖3）。這可能由多種原因引起的，與土壤質地及土地利用方式有關。本研究中，土層間氧氣濃度的差異是非常重要的原因，表層氧氣充足，有利于微生物活動。其次，由于本研究區處于干旱沙區，土壤以流沙為主，且0～30 cm 深度土壤含水率極低，植被分布稀疏，地下生物量極其匱乏，土壤中腐殖質含量遠遠不夠，人工植被建立后，小畫眉草等草本及隱花植物的定居，改變了表層地下生物量和凋落物質量的輸入。此外，深層土壤較低的含水量和孔隙率，不利于土壤中的離子交換，阻礙了養分的擴散，進而影響土壤微生物的生長和分布。因此，養分資源匱乏及腐殖質的分解受限是造成不同土層微生物數量差異的主要原因。這一結果與其他研究者在干旱沙區的研究結果一致。

植被作為土壤微生物營養物質與能量的重要來源，對微生物群落有重要影響。本研究發現，檸條和油蒿灌叢下微生物功能群落含量均高于灌叢間（圖2c 和圖2d）。一方面，灌叢下凋落物的輸入量高于灌叢間；另一方面，植被灌叢下較灌叢間根系發達。此外，本研究還發現固沙植物種影響微生物功能群數量，即以油蒿和檸條為優勢種的群落微生物功能群數量存在差異。相同恢復年限，多年生灌木檸條和壽命較短的半灌木油蒿微生物功能群變化規律不同。本研究表明：在植被恢復前期（7年左右）油蒿更利于氮元素循環的微生物（氨化細菌和硝化細菌數量）的恢復，而植被恢復后期（27年左右）檸條更有利于對碳元素循環的微生物纖維素分解菌的改善（圖2a 和圖2b）。這可能是由于多年生檸條的形態結構、根系質量和地上生物量特征（如木質素與纖維素的比例更高）相對于壽命較短的半灌木油蒿不同，即植被的形態及更新周期對土壤恢復狀況影響不同。綜上，植被類型、生理特性及人為管理均對土壤微生物群落和土壤恢復有重要影響。因此，在干旱沙區土壤恢復過程中必須考慮物種選擇和配置方式，做到灌木和半灌木搭配，利于土壤生境的恢復。

3.2 土壤微生物功能群季節變化規律

土壤微生物對土壤溫度、濕度、理化性質等環境因素波動較敏感。因此，土壤微生物功能群數量季節變化與植被類型、氣候、土壤理化性質等因子密切相關。本研究表明，碳循環微生物功能群落纖維素分解菌春季含量顯著低于其他季節（圖4），這與王貴的研究結果一致。季節性溫度及土壤含水量的差異能夠使土壤中微生物代謝活動受限。參與氮素循環的氨化和硝化作用的微生物數量的季節變化較碳素循環中纖維素分解菌的數量季節變化更強。氨化和硝化作用從冬、春、夏到秋季表現為逐漸增強的趨勢，這與人工卷柏林參與土壤氮循環微生物的季節變化規律一致。冬季較低溫度限制了氨化和硝化作用的發生，隨著溫度升高，氮循環過程活躍。而溶磷菌季節變化規律與草地和森林土壤中磷酸酯酶和磷酸二酯酶活性的較為一致，均表現為冬季最高，秋季到春夏季呈上升趨勢。這可能由于溶磷菌和磷酸酯酶具有相似的生物過程或影響因素，生長季植物需要土壤中的有機磷元素，故溶磷菌和磷酸酶作用均是促進土壤中無機磷的礦化。但也有研究表明，在森林土壤中全磷的含量多年來保持相對穩定，根系凋落物的輸入對磷元素含量的影響是有限的。因此，對于土壤中指示磷循環微生物功能群的動態變化暫無確定性結論。

3.3 環境因素對土壤微生物功能群的影響

土壤微生物群落對環境變化敏感，土壤TN、pH等理化性質是影響土壤微生物多樣性及分布的主要因素。本研究表明，TN 是引起土壤微生物功能群數量變化的關鍵因子，即隨TN 含量增大，纖維素分解菌和溶磷菌數量逐漸增加，但氨化細菌和硝化細菌數量前期快速繁殖，后期繁殖速度逐漸趨于平穩（圖5），說明植被恢復后期，土壤微生物數量可能受氮素含量的限制。這一發現支持了土壤養分（如TN 和SOC 含量）是影響土壤細菌等微生物群落的最重要土壤變量的假設。本研究結果也進一步說明，在干旱沙區，隨著人工固沙植被的恢復演替，氮元素相對碳元素依舊比較匱乏，而植物的生長和土壤微生物對氮元素的需求更大，說明固沙植被演替后期植物生長和土壤微生物繁衍有可能主要受氮素的限制。但本研究結果與干旱地區森林土壤細菌群落相對豐度的研究結果不同，Zeng 等的研究表明，隨TN 和銨態氮含量的增加細菌相對豐度顯著降低，即氮素含量對微生物群落表現出抑制作用，這可能是由于研究區土壤類型及地理跨度的差異造成的。此外，Liu 等研究發現年齡較老的森林土壤中，AP 含量是影響土壤微生物種群的一個重要環境因子；Cleveland 等在熱帶雨林里也發現AP 含量是影響土壤微生物群落結構的主要因子。這與本研究結果一致，土壤AP 是微生物功能群數量的極顯著因子，且隨其呈對數函數變化（圖6a 和圖6b）。綜上，由于荒漠沙區氮和磷元素的匱乏，微生物功能群對其變化更加敏感，微生物功能群數量表現為先快速繁殖，后期受氮和磷含量的限制逐漸趨于平穩。

4 結 論

本研究表明，從長時間尺度上分析指示土壤碳、氮、磷元素循環的微生物功能群數量分布主要受固沙植被建植年代、微生境、土層影響，而短期波動則受季節控制。在恢復初期半灌木油蒿的氮元素循環微生物恢復較快，而后期灌木檸條則對碳元素循環微生物的改善較好。由于沙區土壤中養分匱乏，固沙植被的建植要注重物種合理搭配。因此，固沙植物的物種選取和配置方式對沙區土壤恢復極其重要。此外，土壤理化性質與土壤微生物功能群變化密切相關，其中，TN 和AP 含量是決定土壤微生物功能群數量的關鍵因素。由此可以看出，在該生態系統中，氮和磷較碳對土壤微生物功能群數量限制更大，即在干旱沙區植物生長季，固沙植被演替后期植物生長和土壤微生物繁衍有可能主要受氮素的限制。本研究結果為更好地理解干旱沙區植被恢復中微生物與土壤特性的相互作用奠定了基礎，并加強了對沙漠化地區土壤碳、氮、磷元素循環的理解。