基于網絡藥理學和分子對接技術探討優化新生脈散方抗慢性心力衰竭心肌纖維化的作用機制*

張澤宇，王賢良，王帥，賈壯壯，閆海峰，毛靜遠

1.天津中醫藥大學第一附屬醫院，天津 300381； 2.國家中醫針灸臨床醫學研究中心，天津 300381

慢性心力衰竭(chronic heart failure，CHF)是由多種有害因素長期刺激引起的心室結構代償性改變，功能上可表現為心肌收縮和/或舒張受限、射血分數降低、心室壓升高等，造成體循環或肺循環瘀血[1]。CHF的根本原因是心室重構，其重要機制之一是心肌纖維化(myocardial fibrosis，MF)[2-3]。根據該病疲乏、呼吸窘迫、水腫、血瘀等臨床表現，中醫將其病機歸納為本虛標實，以心臟氣血陰陽虛衰與瘀血痰濕等病理產物相互作用為主[4]。優化新生脈散方是毛靜遠教授在多年臨床研究基礎上提出的治療CHF的經驗方，由黃芪、黨參、刺五加、丹參、醋鱉甲、茯苓、葶藶子、麥冬、枳殼等藥物組成，君藥黃芪補益元氣以固本，補而不滯，兼有行濕之功；臣藥黨參、刺五加、丹參益氣以通脈；佐藥醋鱉甲、茯苓活血利水，葶藶子辛散苦瀉，性寒下降，開瀉肺氣以利治節；枳殼協助諸藥以行氣，麥冬養血復脈以防傷陰，各藥共用共奏益氣活血利水之功。前期臨床及實驗研究證實，優化新生脈散方具有良好的抗炎、抗氧化、抗凋亡、抗MF等作用，可顯著改善MF患者的生存質量、心肌功能等[5-7]。

網絡藥理學從微觀到宏觀多維度、多方面解析藥物調控疾病的機制，可以更準確地預測和分析中藥復方的作用機理，已成為藥物研究的新模式。分子對接能夠演算得出受體與配體之間的親和力數值以及一些結合形式，并通過這些條件將結果進行評估和篩選。本研究采用網絡藥理學和分子對接方法對優化新生脈散方治療CHF的作用機制及物質基礎進行探索，旨在為后續實驗和臨床研究提供線索與思路。

1 資料與方法

1.1 中藥有效成分的獲取基于中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php)和本草組鑒(HERB，http://herb.ac.cn/)數據庫篩選優化新生脈散方9味中藥的化學成分。以口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥35%、類藥性(druglikeness，DL)≥0.2為條件對其化學成分進行初篩后，再通過SwissADME(http://www.swissadme.ch/)平臺以腸道吸收度(GI absorption)為Yes、DL為2個Yes及以上為條件進行復篩，最終得到優化新生脈散方的有效成分。

1.2 有效成分靶蛋白的獲取基于Pubchem數據庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)獲取有效成分的SMILES結構式，并導入SEA數據庫(https://sea.bkslab.org/)預測有效成分的靶蛋白，最后通過UniProt數據庫(https://www.uniprot.org/)對靶蛋白名稱進行標準化處理。

1.3 “成分-疾病”交集靶點的獲取通過GeneCards數據庫(http://www.genecards.org/)以Relevance score≥5為條件，chronic heart failure和myocardial fibrosis為關鍵詞，獲取CHF和MF的相關蛋白。將CHF靶蛋白、MF靶蛋白和優化新生脈散方有效成分相關靶蛋白取交集，獲得交集蛋白，即為優化新生脈散方治療CHF心肌纖維化的靶點蛋白，保存文件為“Drug-Disease”。

1.4 富集分析將“Drug-Disease”通過Rx64 4.0.2軟件進行基因本體(gene ontology，GO)功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路富集分析，并以P<0.05為條件進行篩選分析。GO功能富集分析可分為生物過程、分子功能和細胞組分，各取排名前10的功能繪制條形圖；將KEGG通路富集分析獲取的前30條通路繪制氣泡圖(縱坐標為通路名稱，橫坐標為基因占比，圓圈大小代表富集基因數目的多少，顏色為富集程度，紅色越深代表富集顯著性越強)。通過查閱文獻篩選疾病相關通路并于KEGG富集結果中獲取富集蛋白，利用STRING數據庫(https://string-db.org/)和Cytoscape-v3.8.2軟件篩選富集核心蛋白并對“通路-靶點”進行拓撲分析。

1.5 構建“成分-靶點”拓撲分析網絡將優化新生脈散方活性成分和通路富集蛋白導入Cytoscape-v3.8.2軟件進行可視化處理，構建“成分-靶點”網絡。其中，節點表示化合物和靶點，邊代表節點之間相互作用關系。

1.6 分子對接驗證及篩選以富集核心蛋白為受體、對應中藥成分為配體，進行分子對接。將成分2D結構通過Chem3D.exe軟件進行3D轉化和結構優化，保存為lig.mol2；通過PDB數據庫(http://www.rcsb.org/)獲取靶蛋白的晶體結構并通過PyMOLWin.exe軟件對其進行去除H2O和小分子配體處理，保存為rep.pdb；將rep.pdb和lig.mol2導入AutoDockTools 1.5.6轉化為PDBQT格式，并確定活性位點；利用AutoDock Vina進行分子對接，選取與靶蛋白對接結合能最低的成分，利用PyMOLWin.exe將對接結果進行可視化。

2 結果

2.1 優化新生脈散方的有效成分及其相關靶蛋白通過TCMSP和本草組鑒數據庫共獲得優化新生脈散方有效成分83種，其中黃芪11種、黨參4種、刺五加11種、丹參29種、鱉甲5種、茯苓1種、葶藶子5種、麥冬18種、枳殼4種，蛋白預測并標化處理后得到有效成分靶蛋白769種。根據OB值列出排名前20的化合物。見表1。

表1 優化新生脈散方OB值排名前20位的化合物

2.2 “成分-疾病”交集靶點通過GeneCards數據庫以Relevance score≥5為條件，獲得CHF相關蛋白5 913種，MF相關蛋白725種，將CHF靶蛋白、MF靶蛋白及優化新生脈散方有效成分的相關蛋白取交集后得到119個交集靶點。見圖1。

圖1 成分-疾病靶蛋白Venn圖

2.3 GO和KEGG富集分析GO功能富集分析共獲得2 388個功能條目，其中生物過程有2 178條，主要包括藥物反應、缺氧反應、鈣離子穩態等；細胞組分有52條，主要與膜區、質膜外側、細胞外基質、膠原含量等有關；分子功能有158條，主要涉及生長因子(growth factor，GF)結合、G蛋白偶聯受體(G protein-coupled receptors，GPCRs)結合、GPCRs活性、受體酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase，RTK)活性、絲氨酸/蘇氨酸激酶活性等。KEGG通路富集分析共獲得154條信號通路，其中磷酸肌醇3激酶(phosphoinositide 3-kinase，PI3K)-蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)通路[8]、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)通路[9]、Ras相關蛋白1b(Ras-related protein 1b，Rap1)通路[10]、環磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)通路[11]、表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)通路[12]等與CHF過程中MF的發生關系最為密切。“通路-靶點”拓撲分析網絡中紅色八邊形為上述通路，紫色圓形為一般富集蛋白，黃色圓形為核心富集蛋白，由此可知，組蛋白乙酰轉移酶p300(histone acetyltransferase p300，EP300)、MAPK1、EGFR、RAF原癌基因絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(RAF proto-oncogene serine/threonine-protein kinase，RAF1)、轉錄因子AP-1(transcription factor AP-1，JUN)等蛋白可能對上述通路起到關鍵調節作用。見圖2-圖4，表2。

圖2 交集靶點的GO富集分析

圖3 交集靶點的KEGG富集分析

表2 核心富集蛋白

圖4 通路-靶點拓撲分析網絡圖

2.4 “成分-靶點”網絡的構建“成分-靶點”拓撲分析網絡共含75個節點和123條邊。圖5中左側環形代表藥物有效成分，咖啡色為黃芪成分、橙色為黨參成分、紫色為刺五加成分、綠色為丹參成分、紅色為鱉甲成分、灰色為茯苓成分、淡黃色為葶藶子成分、粉色為麥冬成分、青色為枳殼成分，多種顏色的節點代表藥物共有成分；右側環形代表通路富集蛋白，藍色為一般富集蛋白，黃色為核心富集蛋白。結果顯示，該方主要成分為異鼠李素、山奈酚、槲皮素、丹參酮IIA等，核心蛋白可受到多種藥物有效成分的調控作用。見圖5。

圖5 成分-靶點拓撲分析網絡圖

2.5 核心靶點與藥物有效成分的分子對接受體與配體的結合能低于-7 kJ·mol-1表示受體與配體之間具有強烈的結合能力[13]。將核心靶蛋白與相應主要成分進行分子對接發現，靶蛋白與對應化合物的結合能基本<-7 kJ·mol-1，將靶蛋白與其親和力最強的化合物構建分子對接模式圖，由此說明藥物成分與作用靶點之間具有強烈的結合能力。見圖6，表3。

注：A：RAF1與異鼠李素；B：EP300與槲皮素；C：EP300與丹參酮IIA；D：STAT3與丹參酮IIA；E：HSP90AA1與丹參酮IIA；F：JUN與異鼠李素；G：MAPK1與丹參酮IIA；H：PRKCA與丹參酮IIA；I：IL6與丹參酮IIA；J：VEGFA與異鼠李素；K：EGFR與丹參酮IIA圖6 分子對接模式圖

表3 成分-靶點的分子對接數據

3 討論

中醫認為CHF的病機為心氣虛損，血瘀痰阻，優化新生脈散方諸藥合用，共奏益氣活血利水之功，通過辨證對藥物進行加減，治療CHF實具良效。網絡藥理學體現了中醫整體觀的特點，有助于多層次闡明藥物的作用機制。本研究借助網絡藥理學與分子對接方法對優化新生脈散方、CHF以及MF的關系進行探討，考察優化新生脈散方在治療CHF過程中抑制MF的具體調控機制及物質基礎。

GO功能富集分析結果表明，優化新生脈散方對CHF過程中MF的治療作用涉及GF結合、GPCRs結合、GPCRs活性、RTK活性、絲氨酸/蘇氨酸激酶活性等。在缺血、缺氧、炎癥等多種致病因素的作用下，心肌組織發生慢性代償反應，促進心肌細胞、內皮細胞、炎癥細胞及心肌成纖維細胞(Cardiac fibroblasts，CFs)等的病理反應，增加促纖維化因子的分泌，GF、炎癥因子、胰島素與CFs表面的RTK結合，血管緊張素與CFs表面的GPCRs結合，促進MF的發生[14-17]。KEGG富集分析結果表明，優化新生脈散方可能主要作用于PI3K-Akt通路、MAPK通路、Rap1通路、cAMP通路、EGFR通路等信號通路，抑制CHF過程中MF的發展。PI3K具有絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性，其中，Ⅰ型PI3K研究最為廣泛，包括ⅠA亞類和ⅠB亞類，ⅠA亞類主要由RTK激活，可在多種組織中表達；ⅠB亞類由GPCRs激活，主要表達于白細胞[18-19]。病理條件下，RTK被激活后可與PI3K p85亞基的SH2結構域結合，解除對P110的抑制，P110被RTK招募后激活PI3K，催化磷脂酰肌醇4，5-二磷酸生成磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸(phosphatidylinositol-3,4,5-triphosphate，PIP3)，PIP3再作為第二信使將Akt募集到質膜上與3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1/2結合，活化的Akt通過磷酸化多種下游底物增強CFs轉錄因子的活性[20]。MAPK通路主要包括胞外信號調節激酶1/2(extracellular regulated protein kinases 1/2，ERK1/2)、p38MAPK和c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)，p38MAPK與JNK通路主要調節心肌細胞的凋亡和分化，ERK通路與CFs的增殖相關[9]。ERK通路胞膜受體包括RTK和血管緊張素Ⅱ1型受體(angiotensin ii type 1 receptor，AT1)，活化受體首先將信號傳遞至Src酪氨酸激酶(Src tyrosine kinase，Src)以磷酸化接頭蛋白Shc，p-Shc與Grb2、SOS構成Shc/Grb2/SOS復合物激活Ras蛋白，誘導Raf-1的磷酸化[21-22]。p-Raf-1以三級激酶級聯激活ERK1/2，進而激活Elk-1調控c-fos基因，啟動CFs增殖[23]。心肌缺血/再灌注損傷小鼠模型中，抑制Rap1通路可減少心肌梗死面積、減輕心肌細胞肥大、炎癥和MF程度[10,24]。cAMP信號通路的激活可抑制CFs的DNA合成，進而阻止CFs的增殖、分化、遷移和侵襲，使膠原生成減少[11,25]。EGFR通路的激活可上調促纖維化基因，增強Ⅰ、Ⅲ型膠原合成，引起MF和瘢痕，維持病理條件下心肌結構的完整性，如雙調蛋白通過激活EGFR依賴性通路加重心肌梗死小鼠MF及心功能不全，分泌型磷脂酶A2-IIA可通過調節EGFR 轉錄激活以促進肌成纖維細胞分化，Ang II/醛固酮可激活TRIF/EGFR通路誘導小鼠心臟炎癥、MF、肥大和功能障礙等[12,26-27]。

通過富集篩選核心蛋白、“通路-靶點”拓撲分析、“成分-靶點”拓撲分析及分子對接得出，優化新生脈散方主要成分為異鼠李素、槲皮素、山奈酚、丹參酮IIA等，通過干預EP300、MAPK1、RAF1、JUN等核心蛋白調控PI3K-Akt通路、MAPK通路、EGFR通路等信號通路。現代藥理學表明，異鼠李素可通過阻斷PI3K-Akt通路、TGFβ通路等信號通路，抑制I型膠原蛋白α1 mRNA的表達，減輕甚至逆轉血管緊張素II所誘導的心肌細胞肥大和MF[28-29]；槲皮素可結合SIRT5，促進IDH2去糖基化，維持線粒體內環境穩態，在炎癥條件下保護小鼠心肌細胞，改善MF，降低CHF患者的住院率和病死率，同時，還可預防心臟脂肪堆積，減少高脂飲食誘導的MF、心肌細胞肥大、氧化應激和血管稀疏，通過調節miR-223-3p/FOXO3增加自噬，預防異丙腎上腺素誘導的MF。此外，槲皮素二水合物能夠抑制Ang II誘導的CFs增殖和分化[30-33]；山奈酚可抑制AngII誘導的CFs增殖和活化及Ⅰ/Ⅲ型膠原蛋白的合成，促進基質金屬蛋白酶-1的表達，減輕MF程度[34-35]；丹參酮IIA可減少ROS生成、抑制NADPH氧化酶和TGFβ1/SMAD-2/3通路及調控microRNA，以抑制CFs增殖、細胞外基質(如膠原和纖維連接蛋白)沉積，調節基質金屬蛋白酶和金屬蛋白酶組織抑制劑之間的平衡，發揮抗MF作用[36]。

綜上所述，優化新生脈散方可能是通過異鼠李素、槲皮素、山奈酚、丹參酮IIA等多種有效成分作用于EP300、MAPK1、RAF1、JUN等核心蛋白，進而調控PI3K-Akt通路、MAPK通路、Rap1通路、cAMP通路、EGFR通路等信號通路，發揮抑制CFs過度增殖，恢復Ⅰ、Ⅲ型膠原的合成與分解動態平衡，減少ECM的病理性積聚，降低心肌中間質成分比重，最終改善MF的作用。本研究僅通過網絡藥理學和分子對接技術分析藥物活性成分的吸收情況和結合能力，并未衡量其在復方中的含量及相互反應等問題，尚存在一定的局限性，但可為臨床和實驗研究提供大致的參考方向。