增液通腑逐瘀方對膿毒癥大鼠腸道菌群紊亂和免疫失衡的調節作用*

高薇薇，高萬朋，關鵬，王梟

天津中醫藥大學第二附屬醫院，天津 300000

膿毒癥(sepsis)是機體對感染的反應失調而導致危及生命的器官功能障礙，是感染、燒傷、創傷、休克等急危重患者的嚴重并發癥[1-2]，其本質是促炎和抗炎反應嚴重失衡導致的組織器官的損傷[3]。膿毒癥可以導致腸道免疫屏障紊亂，主要表現為過度的炎癥反應導致腸屏障完整性受損以及腸道免疫抑制引起的腸道菌群紊亂和移位[4]，并可形成惡性循環，促進或加重膿毒癥多器官功能障礙。增液通腑逐瘀方在增液承氣湯基礎上加味而成，可明顯改善膿毒癥患者胃腸功能及預后[5-6]，但其分子生物學機制尚不完全明確。膿毒癥腸道免疫失衡和腸道菌群紊亂是膿毒癥腸屏障損傷的重要環節，本文通過觀察增液通腑逐瘀方對膿毒癥大鼠腸道免疫細胞Th17/Treg平衡和腸道菌群比例的影響，探討其對膿毒癥腸道免疫和腸道菌群平衡的調理作用，以及膿毒癥腸屏障損傷可能的發病機制，為增液通腑逐瘀方調理腸道免疫和腸道菌群以防治膿毒癥及其并發癥提供新的思路和研究方向。

1 材料

1.1 動物SPF級雄性SD大鼠40只，體質量(200±10) g，動物合格證號：SCXK(京)2020-2004，購自北京華阜康生物技術有限公司。大鼠喂養于天津中醫藥大學實驗動物中心，保持環境恒溫恒濕，自由飲水，飼料固定，適應性喂養1周。本次動物實驗均經天津中醫藥大學第二附屬醫院倫理委員批準，倫理編號：ZYEFS-QMJH202014。

1.2 藥物與試劑玄參、麥冬、生地黃、生大黃、芒硝、紅藤、敗醬草(天津中醫藥大學第二附屬醫院飲片藥房)。Anti-Rat CD4 FITC、Anti-Rat CD25 APC、Anti-Mouse/Rat Foxp3 PE、Anti-Mouse/Rat IL-17A PE(美國eBioscience公司，批號：553654、558642、553102、506906)；BBL培養基、LBC培養基、EC培養基、EMB培養基 (青島高科園海博生物技術有限公司，貨號：HB0396、HB0385、HB0133、HB0107)。

1.3 儀器SORVALL LEGEND MACH 1.6/R型冷凍離心機(美國Thermo Fisher Scientific公司，離心半徑：8 cm)；IX2-SLP型倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；BD FACS Calibur型流式細胞儀(美國BD Biosciences公司)；WMZK-02型厭氧箱(浙江義烏冷凍機總廠)；ASV-3023型全自動高壓滅菌鍋(日本Sakura公司)。

2 方法

2.1 藥物制備增液通腑逐瘀方由玄參20 g，麥冬20 g，生地黃20 g，生大黃(后下)15 g，芒硝(沖)10 g，紅藤30 g，敗醬草30 g組成。將除大黃、芒硝外的藥物用水浸泡0.5 h，武火煎至水開后改文火煎 45 min，加入大黃，再煎15 min，加入芒硝攪勻后冷卻至室溫，將湯液濾出，分別制成濃度為 0.5 g·mL-1及 1 g·mL-1的藥液。

2.2 動物模型建立、分組與藥物干預采用隨機數字表法將40只SPF級雄性SD大鼠分為假手術組、模型組及增液通腑逐瘀方低劑量組、增液通腑逐瘀方高劑量組，每組10只。除假手術組外，其余組大鼠采用盲腸結扎穿孔術(cecal ligation and puncture surgery，CLP)建立膿毒癥模型[7]，具體如下：大鼠經體積分數2%戊巴比妥鈉麻醉后，采取前腹正中切口，取出盲腸，使用4號絲線在距離盲腸末端 1.5 cm處進行結扎，用18號針頭在盲腸結扎處遠端穿透3次，擠出腸管內排泄物少許，并留置橡皮引流條以防針孔閉合，然后回納腹腔，逐層關腹。假手術組僅開腹取出盲腸翻動后再次還納腹腔，不進行結扎和穿刺。增液通腑逐瘀方低劑量組(0.5 g·mL-1)、高劑量組(1 g·mL-1)大鼠術前及術后24 h分別以 5 mL·kg-1的劑量灌胃給予增液通腑逐瘀方溶液，模型組及假手術組灌胃給予同體積生理鹽水，每天1次，連續3 d。觀察各組大鼠72 h內的生存情況。

2.3 HE染色評估腸黏膜損傷程度在距回盲部15 cm處取2 cm回腸，制作組織切片并進行HE染色，光學顯微鏡下觀察。通過Digimizer彩色網像分析系統確定腸黏膜絨毛高度、腸腺隱窩深度、黏膜厚度以及絨毛表面積。每只動物取5張不連續的病理切片，每張切片順次取光學顯微鏡下奇數視野觀測10個小腸絨毛，取平均值。腸絨毛表面積=πdh(d為絨毛中段直徑，h為腸絨毛高度)。根據Chiu′s腸黏膜損傷評分法[8]，對小腸黏膜損傷程度進行分級。評分標準如下：0分：腸黏膜絨毛正常；1分：絨毛頂端上皮下出現囊狀間隙，并伴有毛細血管充血；2分：上皮下間隙擴大，中度固有層水腫，中央乳糜管擴張；3分：固有層明顯水腫，腸黏膜上皮層細胞變性、壞死，少數絨毛頂端脫落；4分：上皮細胞層變性、壞死、脫落、部分絨毛脫落，固有層裸露，毛細血管擴張、充血；5分：絨毛脫落、固有層崩解，出血或潰瘍形成。

2.4 輔助性T細胞17(T helper cell 17，Th17，CD4+IL-17+)及調節性T細胞(regulatory T cell，Treg，CD4+CD25+Foxp3+)的檢測取出結腸，去除腸道上粘連的脂肪，并用彎剪剪除Peyer′s Patch(PP結)，縱向剪開腸道，用PBS清洗預消化的腸段2～3次，用剪刀將腸段剪至1～2 mm，置預冷的含體積分數10%胎牛血清的RPMI 1640培養液中，100目不銹鋼細胞篩輕輕研磨，400目尼龍網過濾并于800 r·min-1離心10 min。細胞重懸在適量培養液中，即獲得腸道固有層淋巴懸液。加細胞懸液于大鼠淋巴細胞分離液進行分層，2 000 r·min-1離心20 min，輕取界面細胞，培養液洗1次，細胞重懸在適量的培養液中。在混勻的細胞懸液中加入10 μL FITC-抗CD4單抗，孵育30 min。PBS清洗后加入300 μL固定液，避光孵育15 min。PBS清洗后，加入破膜液并于 3 000 r·min-1離心5 min，棄上清。加入20 μL PE-抗IL-17單抗，室溫避光孵育30 min，隨后PBS清洗，1 000 r·min-1離心5 min，棄上清。用0.3 mL PBS重懸細胞上流式細胞儀檢測Th17細胞比例。在混勻的細胞懸液中加入10 μL FITC-抗CD4單抗、10 μL APC-抗CD25單抗，孵育30 min后利用PBS清洗。每管加入0.5 mL的Foxp3固定液混勻，靜置20 min。PBS清洗后1 000 r·min-1離心 5 min，棄上清，每管加入0.5 mL Foxp3穿孔液重懸細胞，靜置15 min后1 000 r·min-1離心5 min。棄上清，隨后加入10 μL PE-抗Foxp3抗體室溫避光孵育30 min。孵育結束后PBS清洗，1 000 r·min-1離心5 min，棄上清。用0.3 mL PBS重懸細胞上流式細胞儀檢測Treg細胞的比例。

2.5 腸道菌群檢測無菌狀態下取盲腸內容物后加滅菌生理鹽水稀釋10倍，振蕩使之均質化，再進行10倍稀釋，取25 μL稀釋液分別接種在各類選擇性培養基上，將EMB培養基及EC培養基放入需氧環境中，35 ℃培養24 h后計數；BBL培養基、LBC培養基放入厭氧環境中，35 ℃培養48 h之后計數。根據菌落形態、涂片分析及耐氧實驗結果計算各菌群每克糞便中菌落形成單位(Logl0nCFU·g-1)。

3 結果

3.1 增液通腑逐瘀方對膿毒癥大鼠72 h生存數量的影響假手術組和增液通腑逐瘀方高劑量組72 h內有10只大鼠存活，增液通腑逐瘀方低劑量組有9只大鼠存活，模型組有6只大鼠存活。經χ2檢驗發現，四組大鼠72 h生存數量差異具有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠72 h內生存數量

3.2 增液通腑逐瘀方對膿毒癥大鼠小腸病理損傷的影響假手術組可見致密緊湊的小腸黏膜絨毛，無絨毛脫落和倒伏；模型組可見部分絨毛脫落以及倒伏，固有層部分脫落，可及裸露的毛細血管擴張，甚至固有層蛻變或被消化、出血及潰瘍形成；增液通腑逐瘀方低、高劑量組對于固有層脫落及絨毛倒伏較模型組均有改善作用，其中增液通腑逐瘀方高劑量組改善更明顯。與假手術組比較，模型組大鼠腸隱窩深度、絨毛高度、絨毛表面積及黏膜厚度顯著降低(P<0.05)，Chiu′s評分顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，增液通腑逐瘀方低、高劑量組大鼠腸隱窩數量、絨毛高度、絨毛表面積及黏膜厚度明顯升高(P<0.05)，Chiu′s評分顯著降低(P<0.01)。說明增液通腑逐瘀方對于膿毒癥大鼠腸黏膜損傷具有修復作用。見圖1，表2。

注：A：假手術組；B：模型組；C：增液通腑逐瘀方低劑量組；D：增液通腑逐瘀方高劑量組圖1 增液通腑逐瘀方對膿毒癥大鼠小腸病理損傷的影響(HE染色，×100)

表2 增液通腑逐瘀方對膿毒癥大鼠小腸病理損傷的影響

3.3 增液通腑逐瘀方對膿毒癥大鼠結腸 Th17/Treg水平的影響與假手術組比較，模型組大鼠結腸Th17細胞、Th17/Treg比值明顯升高(P<0.05)，Treg細胞比例明顯降低(P<0.05)；與模型組比較，增液通腑逐瘀方低、高劑量組大鼠結腸Th17細胞、Th17/Treg比值明顯降低(P<0.05)，Treg細胞比例明顯升高(P<0.05)。表明增液通腑逐瘀方對膿毒癥大鼠腸道過度的炎癥反應具有抑制作用，見表3。

表3 增液通腑逐瘀方對膿毒癥大鼠結腸Th17/Treg的影響

3.4 增液通腑逐瘀方對膿毒癥大鼠腸道菌群的影響與假手術組比較，模型組大鼠腸道雙歧桿菌、乳酸菌的含量以及厭氧菌/需氧菌比例明顯降低(P<0.05)，大腸桿菌及腸球菌含量明顯增高(P<0.05)；與模型組比較，增液通腑逐瘀方低劑量組、高劑量組大鼠雙歧桿菌、乳酸菌的含量以及厭氧菌/需氧菌比例明顯增高(P<0.05)，大腸桿菌及腸球菌含量明顯降低(P<0.05)。表明增液通腑逐瘀方具有維持腸道菌群平衡的作用，見表4。

表4 增液通腑逐瘀方對膿毒癥大鼠腸道菌群的影響

3.5 Th17/Treg與厭氧菌/需氧菌相關性分析采用Spearman相關性分析考察Th17/Treg與厭氧菌/需氧菌的關系發現，Th17/Treg與厭氧菌/需氧菌存在負相關關系(rs<0，P<0.05)。

4 討論

增液通腑逐瘀方在增液承氣湯基礎上加味而成，該方由玄參、麥冬、生地黃，大黃(生)、芒硝、紅藤、敗醬草組成，具有益氣養陰、通腑瀉熱、活血化瘀的功效。方中大黃推陳致新、解毒化瘀、通經活絡，實驗研究證實，大黃對維持腸道免疫及腸道微生態平衡具有積極的作用；大黃素可抑制炎癥信號通路的激活進而保持腸道機械屏障的完整，還可以減少細菌移位，保持腸道菌群平衡[9]。

腸道菌群平衡在腸道免疫中發揮重要作用[10]，與腸道免疫系統維持著一種平衡而又微妙的共生關系，以保持腸道內環境的穩定[11-12]。乳酸桿菌、雙歧桿菌、腸球菌、大腸桿菌是腸道常駐菌群，能阻止細菌、毒素和其他有害物質入侵，抵抗潛在致病性的需氧菌或外襲菌在黏膜上定植形成感染，降低病原體毒素，殺死并抑制外襲菌[13]。膿毒癥發生時，機體腸道菌群失調、紊亂，表現為厭氧菌數量減少，而需氧菌數量增多，厭氧菌、需氧菌比值明顯下降[14]，腸道定植抵抗力降低，潛在性病原體(包括條件致病菌)定植和入侵，引起腸道黏膜的免疫應答，一旦這種免疫反應超過了機體的接受能力，便可能引發腸道免疫功能失調，從而引發局部或全身性炎癥性疾病[15-16]。本次研究發現，增液通腑逐瘀方具有維持腸道菌群平衡的作用，可以抑制膿毒癥腸道菌群紊亂和菌群移位的發生，對于維持腸道穩態具有積極的作用。

Th17細胞和Treg細胞之間的平衡對維持腸道免疫平衡具有重要意義。Th17主要分泌白細胞介素-17(interleukin-17,IL-17)、IL-22及少量的腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、IL-6和IL-23等促炎介質[13]，可抑制腸道致病菌在腸道內的繁殖，防止腸道菌群移位[17-18]。Treg細胞被稱為抑制性T淋巴細胞，主要分泌IL-10和轉化生長因子-β(transforming grawth factor-β，TGF-β)[19]，抑制炎癥因子及免疫應答過度激活對腸道屏障的損傷，進而維持腸道屏障的完整性[20]。研究表明，Th17/Treg 失衡與膿毒癥和各種炎癥性疾病有關[21]。Th17/Treg比值的改變可提示腸道免疫功能紊亂，若這種免疫功能紊亂不能被糾正，則可能進一步加重膿毒癥多臟器功能障礙，延長疾病病程，增加死亡風險[22-26]。因此，調節 Th17/Treg平衡可能是治療膿毒癥的有效措施[27]。本次研究發現，Th17/Treg與厭氧菌/需氧菌存在負相關關系。腸道免疫平衡與腸道菌群的穩態密切相關，為中藥整體調節觀的微生態學提供了實驗證據[28]。因此，腸道免疫及腸道微生態平衡對于保持腸道屏障完整性以及改善膿毒癥及多臟器功能障礙的預后具有重要意義[29]。

綜上，增液通腑逐瘀方可以修復膿毒癥導致的腸黏膜損傷，調節腸道菌群紊亂，促進免疫平衡。其既可以抑制致病菌在腸道內的過度繁殖，又可以抑制過度的炎癥反應對腸屏障的損傷，進而維持腸道生態平衡，防止腸道菌群移位對腸屏障和全身的二次傷害，促進腸道功能恢復，體現了中藥治療的多途徑多靶點和整體觀的特點，為探索中藥調節腸道菌群途徑及免疫功能提供新的證據。