宏基因組二代測序對重癥監護病房內膿毒癥患者治療及預后的影響研究

張 綿，曾 東，鄭 華

鄭州市第七人民醫院，河南 鄭州 450000

膿毒癥是由于感染導致的全身炎癥反應綜合征，是宿主對感染的免疫失調反應，膿毒癥能夠導致患者多器官功能障礙，膿毒癥和膿毒癥休克是重大的醫療問題，對患者生命安全造成嚴重威脅，死亡率極高［1］。臨床研究發現，在患者確認膿毒癥之后越早應用抗菌藥物患者獲益越大，目前規定在留取微生物標本后，最好1 h 內根據經驗性的感染部位啟動靜脈抗菌藥物治療，并在微生物學確認之后，基于患者的感染細菌、藥敏結果、臨床癥狀體征來調整抗菌藥物。利用宏基因二代測序技術更優于微生物培養，它能更快速的檢測出微生物，包括細菌、病毒、真菌，且陽性率相對較高，因此對于常規培養難以查出病原體的患者進行檢測，及早發現目標致病菌，更利于對患者后續調整治療產生影響［2-3］。隨著下一代測序技術的發展，其中的宏基因組具有病原菌檢出陽性率高、范圍廣、檢出速度快、甚至耐藥基因檢查等特點，并且無需培養，鑒別致病菌（尤其是病毒和真菌），在對于重癥監護病房中膿毒癥患者進行感染源篩查檢查、抗感染治療等方面的指導具有顯著優勢，但是在當前關于該方面的研究相對較少［4］。本研究對于2019 年10 月—2020 年4 月鄭州市第七人民醫院重癥醫學科收治的20例膿毒癥患者送檢的宏基因組二代測序的資料進行回顧性分析，探討基于宏基因組二代測序技術在膿毒癥患者中的治療優勢和對預后影響的應用。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019 年10 月—2020 年4 月鄭州市第七人民醫院重癥醫學科收治的20例膿毒癥患者作為研究對象，其中男13 例，女7 例，所有患者的診斷與治療原則符合國際膿毒癥診療指南的要求和標準。

1.2 方法

收集所有符合入組標準患者的資料，入重癥監護病房時的急性生理與慢性健康評分、感染部位、實驗室檢查如C-反應蛋白、中性粒細胞比例以及血白細胞計數、血總膽紅素、降鈣素原以及凝血酶原時間，序貫器官衰竭評分、送檢前臨床生命體征參數，如心率、體溫、平均動脈壓、機械通氣、血管活性藥物使用、腎臟替代治療等，而預后評估指標中包含如重癥病房病死率、住院7 d 及28 d 病死率等。在病原學治療方面，獲取患者宏基因組二代測序報告，將宏基因組二代測序前后的微生物學報告送檢，如病毒定量聚合酶鏈式反應、微生物培養等，評估宏基因組二代測序報告和送檢前后任意一份微生物學報告的臨床一致性，宏基因組二代測序結果往往會是多種病原體，根據檢測結果及感染部位等分析判斷可能的致病菌。宏基因組二代測序報告和送檢前后任一微生物學報告存在重疊致病菌的話，那么則意味著病原體一致。宏基因組二代測序回報之后調整抗感染藥物治療方案，如果臨床癥狀改善則為有效。

1.3 宏基因組二代測序標本和送檢流程

送檢標本必須要符合華大基因的相關要求，如腦脊液、痰液、血液、腹水以及支氣管肺泡灌洗液等。分析樣本中的微生物，并與數據庫中原來的微生物核酸序列之間進行比較，鑒定微生物。檢測過程為：提取核酸、RNA逆轉錄、構建文庫、測序、信息分析與報告解讀等。

1.4 統計學方法

數據采用SPSS 12.0 軟件進行統計分析。計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用t 檢驗。計數資料以例數和百分比（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 臨床特征與預后

送檢宏基因組二代測序選取的20例重癥監護病房的膿毒癥患者，入重癥病房前的急性生理與慢性健康評分為（23.00±9.54）分。其中，11例患者可疑多部位感染，其中血流感染是最為常見的感染部位，其次為肺部感染。送檢之前，化驗感染指標發現，血白細胞計數偏高，降鈣素原低水平升高。在20 例患者中，預后方面共有9 例出現死亡，住院28 d死亡10例患者，見表1。

表1 膿毒癥患者的臨床特征和預后情況

2.2 測序結果及治療調整

送檢22 例基于二代測序的宏基因組樣本，其中，血液標本12 例、痰液標本3 例、共有4 例支氣管肺泡灌洗液標本、腹水標本1 例、腦脊液標本2 例。22 例標本中，檢出陽性為21 例，陽性率95.45%。其中，共有11 例檢出病毒，3 例檢出革蘭氏陽性菌，1 例結核分枝桿菌，6例檢出巨細胞病毒，9 例檢出革蘭氏陰性菌，6 例檢出真菌。共有8 例傳統微生物學培養報告呈現為陽性，陽性率為36.4%，明顯低于二代測序結果。二代測序結果與臨床診斷比較，2 例不符，但是比較臨床與傳統微生物學報告的話，共有7 例符合，要比宏基因組二代測序低。基于二代測序技術的宏基因組結果，來對于14 例患者調整抗菌藥物治療，其中患者臨床癥狀得到改善的共有8例。見表2。

表2 傳統微生物學報告和二代測序情況 （例）

3 討論

膿毒癥是臨床上急危重癥患者出現死亡后果的一項關鍵因素。患者在患病之后，將會引發全身性炎癥反應以及廣泛性的組織損傷，機體對感染的免疫反應失調，從而導致患者出現肝腎功能衰竭、呼吸功能衰竭及凝血系統問題等嚴重的多器官功能障礙，甚至導致患者出現死亡。所以，盡早明確患者的感染部位、感染病原體及疾病的嚴重程度，并基于此實施針對性的治療措施，是治療膿毒癥成敗的關鍵所在。當前，對于膿毒癥患者的嚴重程度進行判斷和預后預測時，其主要方式還是采取急性生理與慢性健康評分為主［5-6］。

傳統的微生物檢測主要是通過免疫、生化以及培養等實驗方式檢測樣本中的微生物種類與定量信息，臨床上常用的檢測方法有PCR擴增法、微生物培養法以及涂片鏡檢法，而微生物檢出率常常會被抗生素治療所影響，并且所需要的時間較長。提高檢測精準度和效率才是病原微生物檢測的目標［7］。基于宏基因組二代測序技術中的微生物檢測方式，對于宏基因組樣本進行完全測序，從而得到宏基因組的核酸序列，并通過生物信息學工具核酸序列數據，并獲取微生物基因信息，該方式具有無需培養樣本，可以檢測未知微生物甚至包括病毒、真菌等，靈敏度非常高等眾多優勢，完善了傳統微生物檢測上的不足，為臨床診斷及治療提供了更可靠的決策依據［8］。

臨床常用的一種檢測方式中，基于已知病原體的特點非常常見。但以二代測序進行宏基因組檢測，可以更快得到未知病原體，從而對標本進行測序、分析，能夠使臨床醫師及早根據患者的實際癥狀、臨床表現，快速確定病原體，從而更及時做出治療的預判。截止目前，臨床上已有超過38 000 個細菌基因組和超過5 000 個病原基因組的序列已經被測定，基于二代測序技術的宏基因組技術能夠規避細菌培養結果相似而發生的區分困難。所以，在臨床醫療中二代測序具有著非常重要的作用。因此，宏基因組二代測序技術由于其自身的眾多特點已經成為了診斷疑難危重癥感染疾病的關鍵核心所在。在重癥監護病房的膿毒癥患者中應用二代測序，協助醫生盡快診斷病原學甚至微生物的耐藥基因，醫師可以更及時、準確的基于此實施針對性的治療，更利于患者盡早康復［9］。

提高傳統病原微生物培養方式，診斷病原學發現，臨床最為常見的致病菌為革蘭氏陰性菌，其次為革蘭氏陽性菌、真菌、厭氧菌以及寄生蟲等。但隨著二代測序、PCR等不依賴培養的技術和方法的出現，膿毒癥病原學構成也發生了一定變化，本研究結果顯示，二代測序技術的診斷具有較高的陽性率，在送檢前后，病原學培養、病毒定量PCR中，陰性患者12例，僅一次未檢出病原體。而本次研究的病毒檢出率為55%。其實重癥監護病房中，病毒感染十分常見，除了最開始是病毒導致的膿毒癥以外，還包括潛伏病毒再激活，并且潛伏病毒再激活的比例和免疫抑制患者之間存在高度相仿。經過專家學者調查研究發現，重癥監護病房內，正常免疫功能的患者感染CMV 率達到了27%，再激活率為3l%，如果患者一旦出現CMV 感染、CMV再激活等情況，卻并沒有對患者實施相應的治療，將會直接導致患者死亡［10］。

經過調查研究發現，膿毒癥指數是由測序序列數計算得出，在膿毒癥患者中，其致病菌的膿毒癥指數豐度、絕對值均出現顯著性增高并且變化情況和臨床表現之間存在直接關系，對患者實施治療，患者的膿毒癥指數將會迅速下降。本研究中，膿毒癥患者基于宏基因組二代測序技術的結果來調整治療，其中，首先需要明確致病菌，并基于此目標加強治療。其次，排除可疑致病菌，同時停用相應的抗感染藥物，減少多種抗菌藥物的毒副作用及減少重癥患者二重感染的風險，減少營養不良的發生［11］。本次研究中，膿毒癥患者在經過治療調整之后，其臨床癥狀得以改善，并且調整有效率相對較高。但是，本次研究僅是通過臨床癥狀改善結果對調整效果進行判斷。如果可以對宏基因組二代測序結果進行動態檢測的話，可以有更高的依據。本次研究中，所送檢的標本中具有非常多的類型，如痰液、血液、腹水、肺泡灌洗液、腦脊液標本等，其中痰液標本、腹水標本中的檢出菌種相對較多，在區分致病菌和定植菌方面存在一定難度。所以，血液標本、腦脊液標本以及肺泡灌洗液標本可能是重癥病房中膿毒癥患者檢測的最好選擇。但研究發現，血液標本中也會存在非致病微生物序列，尤其是當前根據二代測序結果來判斷致病菌和污染菌等，還尚未有清晰明確的研究。所以，在測序結果為依據方面，還需要結合臨床實際情況甚至反復多次檢測來核實［12］。

在重癥監護病房的膿毒癥患者中采用宏基因的二代測序技術，依舊還存在一定不足，例如宏基因組二代測序目前的費用相對較高，并且不在醫保報銷范圍，增加了患者的經濟負擔。而相關研究中，真菌、細菌測序的覆蓋率相對較低，藥敏處于未知狀態，僅能滿足種屬鑒定需求，但是能夠利用耐藥基因型的檢測適當的彌補，關于藥敏方面還要根據主管醫師的臨床經驗來定。

綜上所述，在重癥監護病房的膿毒癥患者中，應用宏基因組二代測序技術能夠顯著提升病原體檢出陽性率，檢出時間方面較常規培養方法也更提前，可以更加詳細、及時的指導臨床醫師治療方案，從而改善重癥膿毒癥患者的預后，建議在臨床推廣應用。