石斛合劑對2型糖尿病合并非酒精性脂肪肝小鼠mTOR-TFEB-NF-κB的調控作用

陳佳敏，劉 欣，鄒玉卿，鄭劍萍，莊舒婷，楊曉雯，施 紅，2*

(1.福建中醫藥大學，福建 福州 350122；2.福建中醫藥大學附屬第三人民醫院，福建 福州 350000)

2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)合并非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis，NASH)是臨床常見病，最近的一項Meta分析顯示，在T2DM患者中，NASH的患病率高達37.3%[1]。近年來，中醫藥在T2DM合并NASH的治療中起著越來越重要的作用，經過多批次基礎研究證實，石斛合劑(SHHJ)具有降血糖血脂、促胰島細胞增生、抑制炎癥等功效[2-4]。本研究利用db/db轉基因糖尿病小鼠建立T2DM合并NASH模型，探究石斛合劑對T2DM合并NASH模型小鼠mTOR-TFEB-NF-κB通路的調控作用，以期為臨床防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

8周齡db/db雄性小鼠共40只，8周齡db/m雄性小鼠共10只，SPF級，由南京君科生物工程有限公司提供。動物獨立飼養，室溫維持在20～22 ℃，相對濕度60%～65%，12 h/12 h晝夜交替光照，適應性飼養1周。db/db小鼠予低蛋氨酸低膽堿(methionine and choline deficient diet，MCD)(MCD可促進誘發脂肪肝向NASH和纖維化發展)飼料喂養4周，制備T2DM合并NASH模型。本研究動物實驗得到福建中醫藥大學倫理委員會批準。

1.2 藥物與試劑

石斛合劑方：石斛12 g，黃芪18 g，知母12 g，丹參15 g，葛根15 g，五味子10 g，生地黃15 g，黃連6 g，郁金12 g，大黃6 g，梔子10 g，雞內金15 g，僵蠶6 g，地龍6 g，由福建福州閩侯致誠藥店提供。低蛋氨酸低膽堿飼料(氨基酸預混料，蔗糖，淀粉，玉米油，纖維素，維生素，礦物質，碳酸氫鈉，抗氧化劑TBHQ)購于南通特洛菲飼料科技有限公司。TFEB抗體(Thermo Fisher公司，貨號PA5-96632)；β-Actin抗體(Proteintech公司，貨號BA2350)；HRP-羊抗鼠IgG(Proteintech公司，貨號BA1050)；HRP-羊抗兔IgG(Proteintech公司，貨號BA1055)；NF-κB抗體(Abcam 公司，貨號ab16502)；mTOR抗體(Abcam公司，貨號ab2732)；IL-18抗體(Abcam公司，貨號ab191860)；IL-1β抗體(Abcam公司，貨號ab9722)；TNF-α抗體(Abcam公司，貨號ab205587)；伊紅染色液(北京索萊寶科技有限公司，貨號：G1100-500 mL)；蘇木素染色液(北京索萊寶科技有限公司，貨號：G4530-500 mL)；Masson三色染色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司，貨號1340)。

1.3 儀器

搖床(海門麒麟醫用儀器廠，型號：TS-1)；電子天平(上海精科天平公司，型號：JA3003)；組織研磨儀(凱航儀器公司，型號：jj-2)；高速冷凍離心機(德國Eppendorf公司，型號：5417R)；石蠟包埋機(孝感亞光醫用公司，型號：YB-7LF)；石蠟切片機(德國LEICA公司，型號：RM2235)；電泳儀(美國Bio-Rad公司，型號：1645050)；電泳槽(美國Bio-Rad公司，型號：165-8001)；化學發光成像儀(美國Bio-Rad公司，型號：Universal Hood Ⅱ)；光學顯微鏡(日本尼康公司，型號：ECLIPSE 511)。

1.4 動物分組

選取db/m雄性小鼠10只作為正常組，將低蛋氨酸低膽堿飼料喂養4周后的db/db小鼠隨機分為4組：模型組、石斛合劑低劑量組、石斛合劑中劑量組、石斛合劑高劑量組，每組均為10只小鼠。各給藥組的給藥量按照大鼠與人體表面積系數進行換算，正常組和模型組則給予等體積的蒸餾水灌胃。1次/d，連續灌胃4周，均以普通飼料喂養小鼠。

1.5 檢測方法

1.5.1 HE、Masson法檢測db/db小鼠肝組織 取小鼠肝臟組織制作石蠟切片，小鼠肝臟組織以4%中性多聚甲醛溶液固定、脫水，置于二甲苯中透明，將透明的組織包埋凝固，然后修塊、切片、烤片，然后放入二甲苯中脫蠟，再依次放入100%乙醇I、100%乙醇II、95%乙醇I、95%乙醇II、80%乙醇、75%乙醇、70%乙醇中各5 min后，最后放入蒸餾水5 min進行水合。HE：切片用蘇木素染色6 min后流水返藍10 min，1%鹽酸酒精分色后再流水返藍10 min，而后伊紅染色6 s，脫水封片，在顯微鏡下觀察。Masson：切片用Weigert鐵蘇木素染色液染色8 min，酸性乙醇分化液分化10 s，藍化液返藍4 min，蒸餾水洗1 min，麗春紅品紅染色8 min，弱酸工作液洗1 min，磷鉬酸溶液洗2 min，弱酸工作液洗1 min，苯胺藍染色2 min，弱酸工作液洗1 min后，脫水封片，在顯微鏡下觀察。

1.5.2 Western blot法檢測小鼠肝臟mTOR、TFEB、NF-κB、IL-18、IL-1β、TNF-α蛋白的表達 肝組織研磨后加入裂解液，4 ℃，12 000 r/min離心15 min后，取部分樣品進行蛋白濃度測定，剩下樣品加入5×SDS-PAGE loading buffer，用移液槍吹打充分混勻后，在沸水中煮10 min變性。配膠，上樣至10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，電壓20 V/10 min、80 V/30 min、120 V/60 min，使蛋白跑到膠底部，按照蛋白分子量大小切下所需膠塊，轉膜到PVDF膜上后，室溫封閉2 h，與特異性抗體在4 ℃孵育過夜，用TBST洗膜后再將條帶放于二抗中，搖床上孵育1 h，再次洗膜后用ECL發光液進行顯影，用Image Lab軟件分析蛋白條帶的灰度值。

1.6 統計學方法

2 結果

2.1 石斛合劑對各組小鼠肝組織形態的影響

經肉眼觀察，正常組小鼠解剖后的肝臟包膜光滑、色澤紅潤、邊緣銳利、表面光滑(圖1A)。模型組小鼠解剖后的肝臟欠光澤，肝表面呈現明顯的彌散性粗顆粒狀，邊緣鈍化。石斛合劑各組肝臟表面有細小顆粒表現，較模型組有不同程度的改善。

經HE、Masson染色后(圖1B、圖1C)，正常組小鼠肝細胞形態完整、排列有序，以中央靜脈為中心向周圍放射狀分布，未見明顯脂肪空泡。模型組小鼠肝小葉結構嚴重破壞，可見大量脂肪空泡聚集，肝細胞排列錯亂，肝細胞明顯變性，出現碎屑樣壞死，炎細胞浸潤，肝組織匯管區及中央靜脈周圍有較多纖維組織增生和橋接式肝纖維化，部分出現中央靜脈萎縮或消失。石斛合劑各組小鼠肝細胞排列不整齊，可見脂肪空泡聚集，有不同程度的炎性細胞浸潤及肝細胞壞死，匯管區和中央靜脈周圍纖維組織增生，但較模型組均有減輕。

2.2 石斛合劑對各組小鼠肝臟相關蛋白表達的影響

與正常組比較，模型組小鼠肝臟mTOR、NF-κB、IL-18、IL-1β、TNF-α水平明顯提高(P<0.05)，TFEB明顯降低(P<0.05)；與模型組比較，石斛合劑治療組小鼠肝臟mTOR、NF-κB、IL-18、IL-1β、TNF-α水平明顯降低(P<0.05)，TFEB明顯升高(P<0.05)；其中石斛合劑中劑量組提高最為明顯，其次為高劑量組。見圖2、圖3。

注：(A)各組代表性肝組織外觀；(B)肝組織HE染色(×200)；(C)肝組織Masson染色(×200)。

注：低、中、高劑量組分別為石斛合劑低、中、高劑量組。

注：a：與模型對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；b：與正常對照組比較，#P<0.05，##P<0.01。

3 討論

糖尿病屬于中醫“消渴”范疇，病機以陰虛或氣虛為本、痰濁血瘀為標，多虛實夾雜。虛火熏灼成瘀，而成內熱瘀毒，毒聚五臟，五臟之毒以肝腎最為嚴重，因而T2DM合并NASH的重要病因是“熱、瘀、濁毒”，可以通過清熱、活血、祛濁毒等法進行防治。中藥復方可在多系統、多層次、多靶點發揮整體作用，更加契合T2DM合并NASH的病因病機。石斛合劑(SHHJ)可以滋陰益氣清熱、活血化瘀、祛濁解毒，本研究前期經過多批次基礎研究證實，SHHJ具有降血糖血脂、促胰島細胞增生、抑制炎癥等功效，可以改善大鼠的肝功能，重塑肝臟正常形態結構[5]，減少SD大鼠炎癥因子表達，增加TFEB表達[4]。

mTOR是雷帕霉素的靶分子，可在細胞和整體水平上調節生理穩態，其介導的磷酸化可負調節TFEB核易位和活性[6]。另外，研究顯示TFEB作為自噬和溶酶體功能的主要調節劑，可能是T2DM引起糖毒性反應的關鍵因素[7]。TFEB可通過有效調節脂質穩態、組織代謝以及炎癥反應，而成為治療T2DM合并NASH的靶標[8]。NF-κB介導的炎癥途徑是經典的信號傳導級聯，可調控多種細胞促炎基因，同時在胰島素抵抗的肝臟和脂肪組織中大量表達[9]。有研究表明，在感染致病菌或脂多糖刺激的小鼠巨噬細胞中，TFEB可直接調節TNF-α、IL-1β、IL-18等的表達[10]，同時TFEB在糖尿病小鼠中可通過抑制IKK活性并增加IκB水平，從而抑制NF-κB的活性。NF-κB通路部分被阻斷時，mTOR的活性降低[11]，而TFEB的過表達則可下調NF-κB 的表達，即mTOR-TFEB途徑可抑制NF-κB介導的炎癥反應[12]。

本研究結果顯示，經石斛合劑治療后，小鼠肝臟組織結構均較模型組有所改善，同時可以降低小鼠肝臟中mTOR、NF-κB、IL-18、IL-6、TNF-α的水平，增加TFEB表達，表明石斛合劑可能通過調節mTOR-TFEB-NF-κB通路來抑制T2DM合并NASH的炎癥。不過本研究尚未對其通路所有蛋白進行檢測，缺少小鼠血液肝臟纖維化指標的檢測，有待進一步研究。