基于“精華與糟粕分解”理論的幽門結扎性肝損傷病因及連翹-4保肝作用物質基礎研究

苓 苓，昂格力瑪，宮菊花，吳圓圓，杜 蘭，王 歡

(內蒙古民族大學 蒙醫藥學院，內蒙古 通遼 028000)

幽門結扎性肝損傷模型為本課題組創新研究的新型肝損傷病癥模型。其理論基礎是基于蒙醫“三根七素”理論的“精華與糟粕分解”理論，即人體新陳代謝過程，此過程中胃和肝臟起著關鍵作用，且相互密切相關，按精華與糟粕分解順序，如前者無病變，則后者提供營養。幽門結扎性肝損傷模型與臨床上幽門狹窄導致的相關疾病相似[1]。據前期蛋白質組學研究結果表明，幽門結扎后導致146個蛋白出現顯著差異，其中上調1.5倍以上者有78個，下調1.5倍以上者有68個，其蛋白功能大部分與新陳代謝有關，部分與炎癥介質有關，還有部分與免疫系統有關。通過基因芯片技術分析，有562個差異基因。其中大部分差異基因與新陳代謝有關，即藥物代謝及谷胱甘肽、過氧化物酶、膽汁酸、脂肪酸代謝等[2]。目前，尚鮮有該病癥模型病因機制研究的報道。

蒙藥連翹-4別名音達日西湯、蘇龍嘎-4湯，由連翹、麥冬、拳參、川木通等4種藥物組成。其中連翹為主藥，麥冬、拳參、川木通為輔助藥，該藥為涼性方劑，可祛熱、止瀉，主治大小腸之熱痢疾、腹痛、腹瀉等疾病[3]。目前，主要從抗炎、鎮痛、抗腹瀉、抑菌殺菌等方面對連翹-4進行了藥效學研究[4-7]，研究發現，連翹-4對諸多因素導致的肝損傷有很好的保護作用，如連翹-4對“幽門結扎”性肝損傷和CCl4引起的急性肝損傷均起到明顯的保護作用[1，8-9]，但也未發現有相關物質基礎研究的報道。

因此，本研究采用體外細胞實驗探討幽門結扎性肝損傷病因機制及連翹-4保肝作用物質基礎，為進一步研究提供參考。

1 實驗材料

1.1 儀器

ICUBIO生化分析儀(深圳生物科技有限公司)；TB110顯微鏡(日本Nikon)；BCD 216ZDJ冰箱(青島海爾有限公司)；3110 CO2恒溫培養箱(美國，Thermo Scientific)；SW-CJ-2F雙人超凈工作臺(蘇州智凈有限公司)；HH S26S恒溫水浴鍋(江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司)；TDL-5-A離心機(上海安亭科學儀器廠)。

1.2 試藥

連翹-4組方藥(購自內蒙古民族大學附屬醫院，批號：20181164)；胎牛血清(浙江天杭生物科技股份有限公司，批號：18090505)；RPMI-1640培養基(Solarbio公司，批號：20181130)；胰蛋白酶(Solarbio公司，批號：20190926)；雙抗(Solarbio公司，批號：20181225)；二甲基亞砜(DMSO，Solarbio公司，批號：710N035)；1XPBS緩沖液(Solarbio公司，批號：20201117)；硫酸銅(天津市德恩化學試劑有限公司，批號：20191120)；75%乙醇或95%乙醇(天津市光復科技發展有限公司，批號：20180428)；谷氨酸氨基轉移酶(ALT)(庫貝爾公司，批號：201003)；天門冬氨酸基轉移酶(AST)(庫貝爾公司，批號：201001)。

1.3 細胞及動物

LO2細胞(人正常肝細胞)，由內蒙古民族大學蒙醫藥學院實驗室提供，經本實驗室傳代后-80 ℃保存。

SD大鼠，體質量180～220 g，購自遼寧長盛生物有限公司，動物許可證號：SCXK(遼寧)2018-0001。飼養于內蒙古民族大學蒙醫藥學院凈化動物室。

2 實驗方法

2.1 試藥準備

2.1.1 培養液制備 RPMI-1640培養基+10%胎牛血清。

2.1.2 凍存液制備 胎牛血清∶DMOS=9∶1的比例進行配制，現配現用。

2.1.3 含藥血清制備 SD大鼠隨機分成正常組、模型組(幽門結扎)、給藥組(連翹-4，3.9 g/kg)各組20只，灌胃給藥，空白組與模型組灌服0.5%CMC-Na溶液，給藥標準均為2 mL/100 g，每日1次，連續15 d，末次給藥后全部大鼠禁食不禁水24 h，模型組及給藥組大鼠進行麻醉，在無菌情況下開腹幽門結扎，術后單籠飼養，禁食禁水18 h，麻醉，采腹主動脈血，3 000 r/min的轉速下離心10 min，取清液層，56 ℃滅活30 min，微孔濾膜(0.22 μm)過濾除菌(超凈工作臺中進行)，室溫冷卻，于-80 ℃的低溫冰箱中保存。

2.2 LO2細胞

2.2.1 細胞復蘇 首先將細胞實驗所需用品消毒表面后放于超凈工作臺內，紫外線照射30 min殺菌，再將低溫保存的LO2細胞取出，在37 ℃水浴中融化(最好不超過1 min)，加入10 mL培養基混勻，將離心機調至1 000 r/min，離心5 min，吸掉上清，加1～2 mL完全培養基，吹勻，再移入含培養基的培養瓶，培養于CO2培養箱(5%CO2、37 ℃)。每日觀察細胞狀態，以培養基顏色和細胞狀態決定是否要換液。

2.2.2 細胞傳代 待細胞生長融合達80%時，吸掉舊培養液，滅菌PBS洗1～2次，加1 mL胰酶消化，37 ℃靜置1～2 min，鏡下觀察LO2肝細胞的消化情況，當細胞變圓收縮且大量脫落時，終止消化，1 000 r/min的轉速下離心5 min，吸掉上清液，加完全培養基吹勻，再分2瓶，放入5%的CO2培養箱，37 ℃培養。

2.2.3 細胞凍存 棄舊完全培養基，洗滌和消化LO2肝細胞，再終止其消化，離心去清液層，加入凍存液重懸，計數(最終密度調整至 5×106/mL～1×107/mL)，分裝。分裝后在凍存管上標明日期、細胞名稱及保種人等，再置4 ℃→30 min；再置-20 ℃→2 h；最后放置于-80 ℃冰箱。

細胞計數：消化細胞制成細胞懸液。蓋片覆蓋至計數板，細胞懸液吸取10 μL，打入蓋片下，鋪滿計數板與蓋片間，靜置1 min，計算4大格細胞計數總數(數上不數下，數左不數右)，計算公式：細胞數(mL)=4大格細胞總數/4×104[10]。

2.3 各組血清對LO2肝細胞的影響

取處于指數生長期的LO2肝細胞，進行洗滌和消化，加入適量完全培養基(調整最終濃度為5×104/mL)，再將細胞懸液接種于96孔板，200 μL/孔，預培養24 h，吸掉舊液。分為空白組(A組)，模型組(門靜脈血清B組)，正常大鼠門靜脈血清組(C組)，含藥血清組(連翹-4腹主動脈含藥血清D組)血清濃度均為20%，每孔200 μL，培養12 h(條件為5%CO2，37 ℃)，觀察細胞生長狀態。

2.4 細胞形態觀察

用倒置相差顯微鏡觀察LO2肝細胞的形態和生長狀況。

2.5 統計學處理

3 實驗結果

各組血清對LO2細胞的影響：與空白組比較，正常大鼠門靜脈血清組對LO2細胞上清液AST、ALT的水平具有明顯提高，差異有統計學意義(P<0.05)；與正常大鼠門靜脈血清組比較，模型對照門靜脈血清組對LO2細胞上清液AST、ALT的水平具有極顯著提高，差異有統計學意義(P<0.01)。在顯微鏡下觀察LO2肝細胞發現，正常組細胞狀態良好，大小均勻，邊界清晰；模型對照門靜脈血清組細胞數量明顯減少，細胞明顯融合。模型對照門靜脈血清組與連翹-4腹主動脈含藥血清組比較，細胞上清液AST、ALT和鏡下觀察均未發現明顯變化。見表1和圖1。

表1 各組血清對LO2細胞肝功能指標的影響

注：A空白組；B模型組(門靜脈血清)；C正常大鼠門靜脈血清組；D連翹-4腹主動脈含藥血清組。

4 討論

與空白組比較，模型組門靜脈血清對LO2細胞上清液AST、ALT的水平提高顯著，具有統計學意義(P<0.01)。在倒置相差顯微鏡下觀察發現，正常組細胞生長狀態良好，大小均勻，邊界清楚；模型組細胞數量明顯減少，細胞明顯融合。與模型組門靜脈血清比較，連翹-4含藥血清組細胞上清液AST、ALT的差異無統計學意義。在倒置相差顯微鏡下觀察發現無明顯變化。此結果吻合與蒙醫基礎理論——“精華與糟粕分解”。本研究中大鼠胃幽門結扎后胃內引起胃酸過多而導致“胃潰瘍”，進一步誘發“肝功能異?！?，甚至引起十二指腸潰瘍。在此過程中，幽門結扎時胃內“消化三能”平衡被破壞(胃酸過多，即消化希拉過多)，導致“精華與糟粕分解”紊亂，進入肝臟的食物精華之精華質量受到影響而導致肝損傷。

綜上，通過本次研究，初步判斷幽門結扎致肝損傷的病理過程有可能來源于肝臟門靜脈。但由于實驗方法與測量誤差等原因，從連翹-4腹主動脈血清內未發現保肝作用的有效物質基礎，因此對該方藥保護幽門結扎性肝損傷的有效物質基礎方面還需進一步探索。