7個指標的微波酒制白屈菜炮制工藝研究

黃 爽，李瑞海，賈天柱

(遼寧中醫藥大學 藥學院，遼寧 大連 116600)

白屈菜ChelidoniummajusL.是一種屬全草類的罌粟科植物[1]，俗稱山黃連、斷腸草等。白屈菜藥性涼、苦，有小毒，歸肺經、胃經[2]，常用于解痙止痛、鎮咳平喘[3]。白屈菜中富含的原阿片堿、別隱品堿等生物堿類活性成分是其發揮治療作用的主要因素[4]。目前，對白屈菜飲片炮制方法的研究報道較少，除凈制外，還有研究者對其進行了醋制以達到減毒增效的效果[5]。本研究對白屈菜進行酒制炮制，結果發現，經酒制，白屈菜生品中難容于水、難煎出的游離型生物堿煎出量均有提升。傳統中藥材酒制法對操作者在炮制過程中的火力及時間掌控能力要求較高，在炮制過程中易出現火力過猛，時間過長，造成藥材煎糊，或火力過小，炮制時間不足導致含水量過高等問題[6]。因此，本研究將工藝可控的微波技術引入白屈菜酒制炮制中，以彌補傳統酒制不足。本研究采用正交設計法，以白屈菜中別隱品堿等7種生物堿總量為評價指標，優選白屈菜微波酒制炮制最佳工藝，為白屈菜飲片的進一步炮制奠定基礎。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

P230Ⅱ依利特高效液相色譜儀(大連依利特分析儀器有限公司)；P70F23P-G5(SO)微波爐(廣東格蘭仕微波生活電器制造有限公司)；SHB-Ⅲ 循環水式多用真空泵(鄭州長城科工貿有限公司)；FDV 超細粉碎機(北京興時利和科技發展有限公司)；FA1004 精密電子天平(天津天馬衡基儀器有限公司)；KQ5200DB型數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)與購自金壇市白塔新寶儀器廠的HH-W600 數顯三用恒溫水箱。

1.2 試藥

遼寧中醫藥大學藥學院王榮祥教授鑒定本研究所用白屈菜為產自廣西的罌粟科全草類植物白屈菜；古越龍山15%vol黃酒(中國紹興黃酒集團有限公司)；白屈菜堿 Alk3 (Chelidonine，YZ180424，>99.9%，南京源植物生物科技有限公司)；大連美侖生物技術有限公司供應以下標準品：原阿片堿 Alk1 (Protoopine，20170612，99.5%)、別隱品堿 Alk2 (Allocryptopine，20160918，99.1%)、鹽酸黃連堿Alk4 (Coptisine hydrochloride，20170719，98.2%)、血根堿Alk5 (Sanguinarine，20140717，99.6%)、小檗堿 Alk6 (Berberine，20160907，99.5%)和白屈菜紅堿Alk7 (Chelerythrine，20170103，98.1%)；乙腈(國藥集團)；超純水及鹽酸等試劑。7個生物堿堿極性大小：原阿片堿>別隱品堿>白屈菜堿>鹽酸黃連堿>血根堿>小檗堿>白屈菜紅堿。

2 方法與結果

2.1 溶液配制

2.1.1 配制對照品溶液 取Alk1、Alk2、Alk3、Alk4、Alk5、Alk6和Alk7對照品，以甲醇為溶劑制成0.037 1、0.053 6、0.025 9、0.061 8、0.027 4、0.044 6、0.026 0 mg/mL的混合對照品溶液備用。

2.1.2 配制供試品溶液[7-9]精密稱取白屈菜粉末2 g(粉碎并過60目篩)，置150 mL錐形瓶中，55 ℃下乙醇超聲提取 60 min (50 mL，200 W，40 kHz)。濾過得提取液，蒸干，加 100 mL 0.4%鹽酸浸泡，靜置過夜。隔夜后將浸泡液及殘渣移至125 mL量瓶中，50 ℃下超聲30 min。抽濾并取續濾液50 mL，用2.71 mol/L 的NaOH溶液調pH值至11，靜置30 min(室溫)，加40 mL氯仿萃取3次，合并氯仿層，合并蒸干氯仿層，以甲醇為溶劑，定容至10 mL 容量瓶中，過濾備用(0.45 μm微孔濾膜)。

2.2 色譜條件[8-10]

選用規格為(4.6 mm×250 mm，5 μm)的Kromasil ODS-C18中匯達分析柱；選擇的流動相為(A)0.1%三乙胺溶液(pH=3)-(B)乙腈；選用0～18 min，24%B；18～32 min：24%B→35%B條件進行梯度洗脫；設置檢測波長為274 nm；流速調節為2 mL/min；柱溫調至30 ℃；每次進樣20 μL。

2.3 專屬性試驗

精密吸取對照品溶液及供試品溶液各20 μL，并在上述色譜條件下進行檢測，如圖1所示，對照品分離度良好，無干擾峰。

2.4 線性關系考察

精密吸取含0.218 mg/mL Alk1、0.0536mg/mL Alk2、0.063 mg/mL Alk3、0.187 mg/mL Alk4、0.017 mg/mL Alk5、0.019 mg/mL Alk6和0.020 4 mg/mL Alk7的混合對照品溶液1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、20.0 mL，以甲醇為溶劑，分別將各對照品溶液定容至25 mL容量瓶中，測定各個混合對照品的色譜峰面積(同“2.2”項條件)，繪制標準曲線[X(進樣量/μg)，Y(峰面積)]，回歸方程及線性范圍見表1。結果表明，7種對照品溶液線性關系良好。

表1 回歸方程及線性范圍

注：1：Alk1；2：Alk2；3：Alk3；4：Alk4；5：Alk5；6：Alk6；7：Alk7。對照品(A)；白屈菜藥材(B)。

2.5 精密度試驗

精密吸取7種對照品溶液，分別測其峰面積RSD(n=6)為2.09%、2.39%、0.58%、1.46%、1.56%、1.97%、1.11%，說明方法精密度良好。

2.6 重復性試驗

取白屈菜1號(20201222)樣品，分別精密稱取2 g，按“2.1.2”項方法配制供試品溶液，按“2.2”項條件進樣測定，結果原阿片堿、別隱品堿、白屈菜堿、鹽酸黃連堿、血根堿、小檗堿、白屈菜紅堿的含量分別為0.394 4、0.062 0、0.723 1、0.859 4、0.082 5、0.044 1、0.037 6 mg/g，RSD(n=6)分別為1.17%、1.93%、0.58%、0.17%、2.06%、1.28%、0.81%，說明方法重現性良好。

2.7 穩定性試驗

取1號(20201222)供試品，分別于0、2、4、8、12、24 h進樣測定(“2.2”項條件)，原阿片堿、別隱品堿、白屈菜堿、鹽酸黃連堿、血根堿、小檗堿、白屈菜紅堿的峰面積RSD(n=6)分別為1.20%、2.12%、0.70%、1.86%、2.35%、1.43%、0.86%，表明樣品在24 h內穩定。

2.8 加樣回收試驗

精密稱定白屈菜粉末2 g，共6份，置于量瓶中，分別加入10 mL混合對照品溶液(含1.225 mg/mL Alk1、2.265 mg/mL Alk2、1.875 mg/mL Alk3、3.03 mg/mL Alk4、0.105 mg/mL Alk5、0.16 mg/mL Alk6和0.05 mg/mL Alk7)，配制成供試品溶液(“2.1.2”項方法)，進行HPLC測定(“2.2”項條件)，計算得各樣品平均回收率分別為99.71%、99.76%、101.43%、100.29%、100.66%、98.39%和100.05%，RSD分別為0.37%、1.98%、1.87%、0.60%、1.12%、2.53%和1.89%，符合相關規定。

2.9 正交設計及含量測定結果[5-7]

本研究參考文獻[5]采用燜法進行正交試驗，以酒用量、燜潤時間、火力大小和炮制時間為因素，各取3個水平(見表2、圖2)，按照表3進行正交試驗。

表2 因素水平

以總堿量進行方差分析，黃酒用量和炮制時間因素具有顯著性差異(見表4)。以Alk1、Alk2、Alk3和Alk4的總量進行方差分析時，其結果與總堿為指標時結果相似。據白屈菜總堿直觀分析，各因素影響順序為A>D>C>B，最佳組合為酒用量40%，燜潤1 h，60%火力下炮制3 min。據方差分析，黃酒用量和炮制時間因素差異有顯著性，燜潤時間和火力大小因素差異無統計學意義，酒量3水平最佳，燜潤時間1水平最佳，即酒用量40%，燜潤1 h，選擇火力大小60%，炮制時間3 min。結合直觀分析與方差分析結果，確定工藝為加酒用量40%，燜潤1 h，60%微波火力下炮制3 min。

表3 L9(34)正交設計

注：總堿(A)；Alk1、Alk2、Alk3、Alk4的和值(B)。

表4 方差分析

2.10驗證試驗

稱取白屈菜粉末3份，每份約100 g，分別加40 g黃酒拌勻，燜潤1 h，60%微波火力下炮制3 min。分別按“2.1.2”項和“2.2”項進行供試品溶液配制和HPLC檢測。結果表明，3份樣品中7種生物堿總堿的平均含量為2.15 mg/g(n=3)，RSD為0.26%，表明優選出的微波酒制白屈菜炮制工藝可靠。

3 討論

本研究采用多指標分組考察，以7個對照品及其總生物堿含量為指標進行數據處理，試驗結果更客觀，更接近實際結果，具有顯著的特點。在對7個對照品分別做正交數據處理過程中發現，極性相對大的前4個生物堿，即原阿片堿、別隱品堿、白屈菜堿和鹽酸黃連堿的數據變化趨勢趨于一致，即燜潤時間與火力大小均對其影響小，而黃酒用量和炮制時間均對其影響大，說明黃酒用量和炮制時間因素對水溶性生物堿具有顯著性差異，有統計學意義。別隱品堿等4個生物堿成分水溶性相對強，由于酒的加入使更多生物堿溶出，因而可更好地發揮白屈菜的止痛功效。本研究建立的白屈菜7個成分多指標評價的HPLC含量測定方法，分離度較高，符合相關要求，較前期研究增加了別隱品堿，具有一定新意。