梔子活性成分抗痛風的網(wǎng)絡藥理學作用機制探討

劉 佳，李詒光，2，陳 杰*

(1.江西中醫(yī)藥大學，江西 南昌 330004；2.江中藥業(yè)股份有限公司，江西 南昌 330077)

痛風是一種較為常見的由于體內(nèi)的嘌呤代謝紊亂，引起的血清尿酸水平升高的慢性疾病。臨床多表現(xiàn)為急性關(guān)節(jié)炎、高尿酸血癥等[1-2]。越來越多的研究表明痛風患者體內(nèi)代謝異常，會導致肥胖、高脂血癥、高血壓、糖尿病、腦血管等疾病[3]。目前，臨床治療痛風的藥物主要有秋水仙堿、非甾體抗炎藥、促尿酸排泄藥、抑制尿酸生成藥等[4]。但長期服用會產(chǎn)生嚴重的副作用，包括胃腸道反應、肝腎毒性等[5-6]。中草藥因具有成本低、安全性高、副作用小的優(yōu)勢，已成為治療痛風的研究熱點。

梔子為茜草科植物梔子GardeniaFructusEllis的干燥成熟果實，性寒味苦，有瀉火除煩、清熱利濕、涼血解毒的功效[7]。梔子化學成分主要有環(huán)烯醚萜苷類、二萜類、三萜類、黃酮等，具有抗炎[8]、鎮(zhèn)痛[9]、降壓[10]、抗氧化[11]等藥理作用。研究表明，梔子對痛風具有一定的治療作用[12]，但其發(fā)揮藥效的物質(zhì)和作用機制尚不明確。因此，通過網(wǎng)絡藥理學的方法探討梔子抗痛風的作用機制，為進一步深入挖掘梔子治抗痛風機制提供一定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 梔子活性成分收集

在TCMSP(https：//tcmspw.com/tcmsp.php)數(shù)據(jù)庫中檢索梔子中的化學成分，利用口服生物利用度(OB)≥30%[13]、藥物相似性(DL)≥0.18[14]及細胞滲透性(Caco-2)≥-0.4[15]作為篩選條件，篩選出高度活性的有效成分。

1.2 成分作用靶點的獲取

在TCMSP數(shù)據(jù)庫中收集梔子的有效成分對應的靶點，導入Uniport數(shù)據(jù)庫，查找對應的靶基因的名稱。從ChemSpiders(http：//www.chemspider.com/)數(shù)據(jù)庫中查找梔子有效成分的化學結(jié)構(gòu)并以mol形式保存。導入Swiss ADME(http：//www.swissadme.ch/)數(shù)據(jù)庫，得到有效成分的SMILES結(jié)構(gòu)，再將SMILES結(jié)構(gòu)分別導入Swiss Target Prediction[16](http：//www.swisstargetprediction.ch/)和Similarity Ensemble Approach(https：//sea.bkslab.org/)平臺數(shù)據(jù)庫，預測梔子有效成分對應的人潛在靶點。最后，將合并靶點信息并刪除重復項，獲得藥物作用靶點。

1.3 痛風相關(guān)靶基因的收集

將關(guān)鍵詞“GOUT”，輸入OMIM(https：//omim.org/)、DisGENT(https：//www.disgenet.org/)、Genecards(https：//www.genecards.org/)等數(shù)據(jù)庫檢索與痛風相關(guān)的作用靶點，將所得靶點去除重復項后得到痛風相關(guān)靶點。

1.4 構(gòu)建“藥物-活性成分-共同靶點-疾病”網(wǎng)絡

分別將梔子活性成分的相關(guān)靶點與疾病相關(guān)靶點，輸入Venny 2.1.0繪制Venny圖，篩選兩者的共有基因，作為梔子活性化合物治療痛風的潛在作用靶點。利用Cytoscape 3.7.2軟件建立“藥物-活性成分-共同靶點-疾病”網(wǎng)絡。

1.5 構(gòu)建蛋白相互作用網(wǎng)絡(PPI)

將收“藥物-疾病”共有基因?qū)隨TRING平臺(https：//string-db.org/)，在Organism選項中選擇Homo sapiens，其余參數(shù)保持默認，構(gòu)建PPI，結(jié)果保存為TSV格式[17]。將PPI 網(wǎng)絡模型導入Cytoscape 3.7.2軟件，運用“Network Analysis”功能，篩選出關(guān)鍵靶點基因，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡圖。

1.6 GO功能富集分析及KEGG通路富集分析

將關(guān)鍵靶基因?qū)隓AVID數(shù)據(jù)庫(https：//david.ncifcrf.gov/)進行GO(Gene Ontology)和 KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)分析，下載通路數(shù)據(jù)文件。再將分析數(shù)據(jù)導入微生信平臺(http：//www.bioinformatics.com.cn/)，進行可視化分析，分別繪制GO功能富集柱狀圖和KEGG富集分析氣泡圖。

1.7 成分-靶標-通路網(wǎng)絡構(gòu)建

將篩選的活性化合物、靶點及重要信號通路導入構(gòu)建Cytoscape軟件對可視化網(wǎng)絡構(gòu)建及分析。

2 結(jié)果

2.1 梔子活性成分及藥物靶點的篩選結(jié)果

利用TCMSP數(shù)據(jù)庫篩選得到14個符合條件的活性化合物(見表1)和219個靶基因，其中異歐前胡素、蘇丹紅、角鯊烯3種化合物無法篩選出靶點信息，則通過Swiss Target prediction和Similarity Ensemble Approach數(shù)據(jù)庫進行收集，其中Swiss Target Prediction中靶點以Probility>1作為篩選條件，Similarity ensemble approach(SEA)以Probility>0.5作為篩選條件。將以上3部分靶基因進行整合，刪除重復值，共計得到341個靶基因。

2.2 痛風相關(guān)靶點的收集

以“Gout”為關(guān)鍵詞分別從 DisGENT(Score≥0.3)、GeneCards(Relevance score>1)和OMIM中檢索9、778和81個與痛風相關(guān)靶點，去除重復值，共805個。

表1 梔子的化學成分信息

2.3 “藥物-活性成分-共同靶點-疾病”網(wǎng)絡圖構(gòu)建

將梔子活性成分相關(guān)的341個靶點與痛風805個靶點進行Venn分析，獲得52個交集靶基因(見圖1)。借助 Cytoscape 3.7.2軟件進行可視化處理，構(gòu)建“藥物-活性成分-共同靶點-疾病”網(wǎng)絡圖，網(wǎng)絡中共有66個節(jié)點，170條邊，見圖2。槲皮素(MOL000098)、β-谷固醇(MOL000358)、山柰酚(MOL000422)等的度值較高，以上化合物可能是梔子治療痛風的關(guān)鍵化合物。

注：List1代表藥物基因；List2代表疾病基因。

注：六邊形代表疾病；菱形代表藥物；矩形代表藥物成分；橢圓形代表作用靶點。

2.4 靶蛋白相互作用(PPI)網(wǎng)絡的構(gòu)建及分析

借助STRING數(shù)據(jù)庫及Cytoscape軟件共篩選出26個關(guān)鍵靶點，并繪制出梔子治療痛風關(guān)鍵靶點網(wǎng)絡，如圖3所示。蛋白互作網(wǎng)絡中有 26個節(jié)點和 293條邊，平均中心自由度為22.5。26個關(guān)鍵基因分別為VEGFA、TNF、CXCL8、EGF、IL-1β、PTGS2、CCL2、IL10、MMP9、JUN、IFNG、ICAM1、FOS、VCAM1、RELA、PPARG、CD40LG、CRP、SPP1、TGFB1、MMP1、STAT1、IL1A、SELE、MMP3、CXCL2。其中VEGFA度值最高，其次為TNF、CXCL8、IL-1β，表明這些蛋白可能是梔子治療通風的關(guān)鍵靶點。

注：圖中節(jié)點大小代表Degre值，連線粗細代表Combine score值。

2.5 GO分析及KEGG信號通路分析

利用DAVID數(shù)據(jù)庫對26個核心潛在靶點進行GO富集分析，設定參考值，PValue<0.01，共收集信號通路255條。按照PValue<0.01，Count>=5，共篩選得出36個條目。繼續(xù)導入微生信平臺進行GO富集分析。詳見圖4。

圖4 梔子抗痛風潛在作用靶點GO分析

其中生物過程(BP)條目23個，包括：炎癥反應(Inflammatory response)、RNA聚合酶II啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控(Positive regulation of transcription from RNA polymerase II promoter)、藥物反應(Response to drug)等。細胞成分(CC)條目6個，主要富集到細胞外空間(Extracellular space)、細胞外區(qū)域(Extracellular region)、細胞表面(Cell surface)、質(zhì)膜的外側(cè)等(External side of plasma membrane)。分子功能(MF)條目7個，涉及蛋白結(jié)合(Protein binding)、細胞因子活性(Cytokine activity)、相同的蛋白結(jié)合(Identical protein binding)、蛋白質(zhì)同二聚活動(Protein homodimerization activity)等。

利用DAVID數(shù)據(jù)庫對26個核心潛在靶點進行KEGG富集分析，共收集到信號通路58條，按照PValue<0.01，且Count≥8篩選信號通路有18條，如圖5。表明梔子治療痛風的作用機制主要涉及類風濕性關(guān)節(jié)炎、腫瘤壞死因子信號通路、癌癥通路、NF-kappa B信號通路、Toll-like受體信號通路、MAPK信號通路等，其中作用靶點富集最多通路有類風濕性關(guān)節(jié)炎、腫瘤壞死因子信號通路，均含有13個基因。與通路相關(guān)的基因見表2。

圖5 梔子抗痛風潛在作用靶點KEGG通路富集分析

表2 KEGG 通路富集分析相關(guān)基因

2.6 “藥物-活性成分-靶點-通路”網(wǎng)絡的構(gòu)建與分析

將梔子的活性化合物與篩選的顯著性PValue<0.01，且Count≥8的18條信號通路及其作用核心靶點基因結(jié)合，應用Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建網(wǎng)絡。如圖6所示，由圖可知，共9種活性化合物作用于上述18種信號通路，其中槲皮素(MOL000098)、β-谷固醇(MOL000358)、山柰酚(MOL000422)發(fā)揮重要作用；TNF、IL1β、RELA、JUN、FOS可能是梔子抗痛風的關(guān)鍵靶點。

注：長方形表示通路；六邊形表示潛在靶點基因；橢圓形表示化合物；三角形表示藥物。

3 討論

本文采用網(wǎng)絡藥理學分析方法，共篩選出梔子有效活性化合物11個，獲得“藥物-疾病”共同基因靶點52個，分析“藥物-活性成分-共同靶點-疾病”網(wǎng)絡圖，發(fā)現(xiàn)梔子抗痛風關(guān)鍵化合物有槲皮素、β-谷固醇、山柰酚等，其中槲皮素治療痛風發(fā)揮主導作用。槲皮素和山柰酚都是黃酮類化合物，兩者均能通過抑制黃嘌呤氧化酶活性，降低血清中尿酸含量[18-20]。β-谷固醇是一種天然植物甾醇和抗氧化劑，用于治療動脈粥樣硬化、糖尿病、癌癥和炎癥[21]。研究表明，β-谷甾醇可減少NO合成，抑制巨噬細胞IL-6活性，減少IL-1β、TNF-α等炎性因子的分泌[22]。

根據(jù)PPI分析可知，梔子抗痛風核心靶點共26個，其中VEGFA、TNF、CXCL8、IL1β可能是梔子抗痛風的主要作用靶點。VEGFA對血管中內(nèi)皮細胞的增殖、遷移及分化具有重要作用，同時有抑制免疫的功能[23-24]。TNF-α是一種炎性因子，可參與T-cell、B-cell的活化。黃瀟等[25]發(fā)現(xiàn)梔子提取物能通過抑制炎癥因子TNF-α的合成與釋放而發(fā)揮抗炎作用。王苗慧等[26]發(fā)現(xiàn)痛風性關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)腫脹明顯，踝關(guān)節(jié)浸出液中IL-1β、IL-8和TNF-α含量明顯高于正常組。Wan等[1]研究發(fā)現(xiàn)，痛風會導致患者體內(nèi)TNF-α和IL-1β水平升高。

GO功能富集分析顯示梔子抗痛風主要集中于炎癥反應、RNA聚合酶II啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、藥物反應、細胞外空間、細胞外區(qū)域、細胞表面、質(zhì)膜外側(cè)、蛋白結(jié)合、細胞因子活性、相同的蛋白結(jié)合、蛋白質(zhì)同二聚活動等。

KEGG通路富集分析顯示，梔子治療痛風有多條通路，其中包括癌癥通路以及TNF信號通路、NF-kappa B信號通路、Toll-like受體信號通路、MAPK信號通路等。TNF信號通路與癌癥密切相關(guān)，而炎癥是腫瘤的一種特征反應，TNF-α可激活MAPK信號通路，促進HIF-1α合成[27]。缺氧條件下，HIF-1α大量表達，可促進COX-2的表達[28-29]。Toll-like受體(TLRs)，具有識別入侵病原體和內(nèi)源性有害刺激的功能，從而參與免疫反應。在TLRs中，TLR4是主要的脂多糖(LPS)受體[30-31]。當脂多糖受體被激活時，經(jīng)過復雜的級聯(lián)反應，使NF-kappa B信號通路被激活[32]。NF-kappa B是一類重要的核轉(zhuǎn)錄因子，參與免疫反應、炎癥反應和細胞分化等，研究證明干擾NF-kappa B的活化，能阻斷多種細胞因子(IL-1β、TNF-α、IL-6)的合成和釋放[33]。

綜上所述，本文通過網(wǎng)絡藥理學方法預測梔子主要活性成分抗痛風的藥效基礎以及潛在的作用機制，表明梔子可通過多靶點、多通路治療痛風。但網(wǎng)絡藥理學分析仍然存在一定局限性，后續(xù)還應通過實驗進一步進行研究和完善。