骨髓間充質干細胞衍生外泌體對脊髓損傷動物治療作用的系統綜述

魏娟芳，王琳杰，崔艷如，岑秋宇，張安仁

1.成都中醫藥大學養生康復學院，四川成都市 610075；2.西南交通大學醫學院，四川成都市 610031；3.同濟大學附屬上海市第四人民醫院康復醫學科，上海市200434

0 引言

脊髓損傷通常包括原發性損傷和繼發性損傷：原發性損傷指脊髓在直接作用力下造成的損傷；而繼發性損傷導致的級聯反應，損傷程度有時可大于原發性損傷，包括脊髓缺血水腫、氧化應激、神經元凋亡和脫髓鞘、興奮性氨基酸和離子失衡及功能障礙[1-2]。脊髓原發性和繼發性損傷是脊髓產生不可逆損傷的關鍵性因素[2-4]；大量活性氧、谷氨酸和內流Ca2+是產生細胞毒性和細胞凋亡的主要原因之一[1-2]。各種病理變化相互聯系，共同作用，最后導致神經元死亡和脊髓組織破壞。

骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSC)移植具有神經再生、神經保護和免疫調節特性，有望成為治療脊髓損傷的突破口；但免疫排斥和可能的腫瘤形成限制其應用。BMSC 的治療效果主要取決于可溶性旁分泌因子的釋放，外泌體(exosome,EXO)必不可少，BMSC 衍生的EXO (BMSC-EXO)有望替代BMSC 發揮作用[5]。BMSC-EXO 是BMSC起源的直徑30～150 nm膜囊泡，具有遞送率高、生物相容性高和免疫原性低等特性[6]；移植后可不同程度減輕病理變化和缺血缺氧，改善運動功能[7]。BMSC-EXO可通過改善運動功能和病理變化、促進血管生成和軸突生長、維持血-脊髓微循環、抗炎、抗凋亡等機制發揮治療作用。見表1。BMSC-EXO 治療脊髓損傷的結局指標和評定方法見表2。

表1 BMSC-EXO治療脊髓損傷的作用和機制

表2 BMSC-EXO治療脊髓損傷的結局指標及評定方法

1 資料與方法

1.1 文獻檢索

計算機檢索PubMed、Cochrane Library、Web of Science、中國知網和萬方數據庫。檢索年限為建庫起至2021 年10 月。中文檢索詞：脊髓損傷、骨髓間充質干細胞、外泌體等。英文檢索詞：spinal cord injury、bone mesenchymal stem cells、exosome 等。檢索策略如下(以PuMed為例)：

#1 exosome

#2 spinal cord trauma

#3 spinal cord injury

#4 cord trauma,spinal

#5 trauma,spinal cord

#6 traumatic myelopathy

#7 spinal cord laceration

#8 spinal cord injuries

#9 laceration,spinal cord

#10 spinal cord contusion

#11 cord contusion,spinal

#12 #2 OR #3 OR #4 OR #5 OR #6 OR #7 OR #8 OR #9 OR#10 OR#11

#13 bone mesenchymal stem cells

#14 bone marrow mesenchymal stem cell

#15 bone marrow stromal cell

#16 bone marrow stromal cells,multipotent

#17 bone marrow stromal stem cells

#18 bone marrow mesenchymal stromal cell

#19#13 OR#14 OR#15 OR#16 OR#17 OR#18

#20#1 AND#12 AND#19

納入標準：①采用BMSC 治療脊髓損傷的動物隨機對照試驗；②疾病為脊髓損傷，動物種屬和造模方法不限；③干預措施為BMSC-EXO 治療和安慰劑或其他對照；④主要結局指標為運動功能、脊髓組織病理學、抗炎、抗凋亡、軸突和血管生長、血-脊髓屏障的滲透性等。

排除標準：①重復發表；②非中、英文文獻；③無干預；④非對照研究；⑤無相關結局指標；⑥數據不全；⑦灰色文獻。

1.2 文獻篩選和資料提取

由2 名研究者獨立篩選文獻，進行資料和數據提取，并進行交叉核對；若有意見不一，則進行協商或由第三者協助判定。提取的資料包括：第一作者、發表年份、樣本量、動物種屬、體質量、動物模型、造模方式、干預方式和結局指標。篩選流程見圖1。

圖1 文獻篩選流程

1.3 質量評價

采用SYRCLE 動物實驗風險評估工具(SYRCLE's risk of bias tool for animal studies)[24]進行偏倚風險評估。SYRCLE 工具包括10 個條目，涉及選擇、實施、測量、失訪、報告和其他偏倚6種類型，結果以“是”“否”和“不確定”表示，分別代表偏倚風險“低”“高”和“不確定”。

證據質量評估采用定性研究綜述證據評估(Confidence in the Evidence from Reviews of Qualitative research,CERQual)[25]，包括4 個方面：方法學局限性、相關性、一致性、數據充分性。信度分級為高、中、低、極低。

由2 名研究者獨立對納入文獻進行質量評價，并進行交叉核對；如意見不一，則進行協商或由第三者協助判定。

1.4 統計學分析

由于納入的動物研究存在臨床異質性和方法學異質性，難以進行定量分析，故進行定性分析和Scoping分析[26-27]。

2 結果

2.1 一般情況

最終納入21篇文獻[5,10-11,13-15,17,19,21-22,28-38]，其中中文4篇，英文17篇。納入文獻一般情況見表3。

表3 納入研究的一般情況

2.2 文獻質量

2.2.1 偏倚風險

21項研究數據均完整；實驗動物基線情況均有報道，具有可比性；21項研究均提及“隨機”或“隨機對照試驗”，預期結果均得到報道；所有研究均對動物進行隨機化安置；所有研究均未明確交代對實施者和研究者盲法的使用；12項研究報告結果評估的隨機性；15 項研究報告評價者盲法；20 項研究無其他偏倚。見表4。

表4 納入研究的偏倚風險

2.2.2 證據質量

根據CERQual評估結果見表5。

表5 CERQual評估結果

2.3 系統評價

18 項研究選用雄性或雌性Sprague-Dawley 大鼠[5,10-11,14-15,17,19,21-22,28-29,31-34,36-38]，2 項研究為雄性Wistar 大鼠[30,35]，1 項研究 為雄性C57BL/6 小鼠[13]。除了2 項 研究只報告年齡為6～8 周外[11,13]，其他研究均報告體質量(200±50)g。損傷節段集中于T9-11，但損傷方式存在差異，1 項采用鉗夾模型[11]，1 項為橫斷模型[33]，其他研究均為挫傷模型，打擊器和力度有所差異。干預措施存在較大異質性，外泌體類型、干預時間、頻率、濃度和劑量等均不相同；對照干預，2 項使用生理鹽水[28-29]，2 項使用磷酸鹽溶液[36-37]，其他研究均使用磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline,PBS)。由于納入研究在動物種屬、造模方式、干預方法和結局指標測量等方面存在較大異質性，無法進行Meta分析。

2.3.1 運動功能

21 項研究均報告運動功能，20 項采用BBB 評分，1 項研究采用Basso 小鼠量表評分[13]；3 項研究聯合BBB 和運動誘發電位評估運動功能[11,13,19]，其中Huang等[19]還采用熱敏度和尿斑面積定量進行評定；3 項研究聯合BBB 和斜板實驗進行評定[35-37]。21 項研究均報告外泌體治療后運動功能改善，CERQual 信度分級高，結果可靠。

2.3.2 組織病理學

19 項研究報告脊髓組織病理，9 項采用HE 染色觀察脊髓組織形態[5,11,28-29,33-34,36-38]，9 項采用尼氏染色觀察神經元損傷[5,15,21-22,28-30,36-37]，8 項采用免疫熒光觀察相應蛋白和細胞表達[5,13,22,28-29,32,35,38]，2 項采用MRI 觀察病變總面積和體積[13,32]，2項采用透射電鏡觀察超微結構變化[5,38]，2 項采用固藍染色觀察髓鞘病理變化[36-37]。19 項研究均報告，外泌體移植后脊髓組織病理改善，CERQual信度分級高，結果可靠。

2.3.3 凋亡

11 項研究報告脊髓組織細胞凋亡[5,10,14-15,19,21-22,28-30,38]，8 項采用TUNEL 染色觀察神經元凋亡率[10,14-15,21-22,28-30]，外泌體干預后TUNEL 陽性細胞數量減少；2項觀察凋亡相關蛋白[14-15]，治療后促凋亡蛋白caspase-3/9 和Bax 下調，抗凋亡蛋白Bcl-2 上調，其中Luo 等[15]觀察到通過下調谷氨酸改善凋亡；1 項研究發現caspase-1 下調[38]。研究顯示，外泌體移植可對抗脊髓組織細胞凋亡，CERQual信度分級中等，結果較為可靠。

2.3.4 炎癥

11 項研究觀察脊髓損傷動物的炎癥[5,10-11,13,19,21,31-32,34-35,38]，6 項觀察炎性因子[5,10,19,21,31,38]；3項觀察NF-κB[13,34-35]；3 項報告治療后小膠質細胞和巨噬細胞向M2 表型極化[10,13,34]；3 項發現A1 型星形膠質細胞活化程度減輕[11,32,38]。研究顯示，外泌體移植后，脊髓組織炎癥減輕，CERQual信度分級中等，結果較為可靠。

2.3.5 BSCB通透性

3 項研究觀察脊髓損傷后BSCB 通透性的變化[5,17,22]，均采用伊文思藍評估，還有研究聯合觀察claudin-5、occludin、ZO-1 等的水平[17]，3 項研究均顯示，外泌體移植抑制周細胞焦亡，從而減輕BSCB 滲漏和脊髓水腫，減少緊密連接蛋白丟失。外泌體移植可降低BSCB 的滲透性，CERQual 信度分級低，結果可靠性低。

2.3.6 軸突生長

1 項研究觀察軸突生長[11]，并通過神經絲蛋白和β-Tubulin 評估神經再生，發現外泌體干預促進PC12細胞中神經絲生成，促進軸突再生，減輕神經膠質瘢痕形成。CERQual信度分級低，結果可靠性低。

2.3.7 血管生長

1 項研究觀察血管生長[21]，采用免疫熒光染色測定，發現血管數在外泌體治療后增多。CERQual信度分級低，結果可靠性低。

3 討論

脊髓組織損傷后，會發生脊髓出血水腫、氧化應激、炎癥反應、細胞凋亡和脫髓鞘、興奮性氨基酸與離子失衡及功能障礙等一系列級聯反應，導致腦脊液中膠質纖維酸性蛋白和白細胞介素-6 增多，進一步產生活性氧和谷氨酸，過多的谷氨酸與其受體N-甲基-D-天冬氨酸、D-氨基-3 羥基-5 甲基-4 異惡唑丙酸、紅藻氨酸離子和代謝性受體等結合，持續產生興奮性神經毒性，加快神經元凋亡和壞死；加速Ca2+和Na+內流，進一步加快細胞死亡和軸突去極化脫髓鞘[1-2]。其各種病理變化相互作用，最終導致神經元死亡和脊髓組織破壞。

BMSC 是具有多種分化潛能的多能干細胞，可分泌大量外泌體，稱為BMSC-EXO。外泌體含有大量復雜分子，包括蛋白質、脂質和核酸等[39]，其中蛋白質主要參與代謝、能量通路、細胞生長、通信和運輸[40]，核酸包括mRNA、microRNA 和其他非編碼RNA(ncRNA)。外泌體可作為有效載體將特定的蛋白、脂質或核酸傳遞給受體細胞，從而參與生理和病理過程[41]；外泌體通過促進血管生成和軸突生長，調節炎癥和免疫反應，抑制細胞凋亡，維持BSCB 的完整性，單純外泌體移植比單純干細胞移植效果更好[16]。

本研究顯示，BMSC-EXO移植可促進脊髓損傷后的運動功能恢復，減少脊髓受損程度，增加殘存組織體積，發揮神經保護作用；可能的機制包括抗凋亡、抗炎、減輕BSCB 通透性、促進軸突和血管生長等。BMSC-EXO 的抗炎作用還可能與microRNAs 相關，如microRNA-21、microRNA146a-5p等[42]。

BMSC-EXO 可上調血管生成關鍵基因的表達[43]，誘導軸突生長和減少硫酸軟骨素蛋白聚糖的產生，緩解神經傳導障礙。

本研究納入的文獻有較大異質性，造模方法是異質性產生的基本原因；干預措施除劑量、時間、濃度不同外，還存在外泌體類型差異，包括單純外泌體和以不同microRNA修飾的外泌體。

本研究只納入公開發表的中、英文文獻，對灰色文獻檢索不夠，可能會產生偏倚；納入研究沒有進行功效分析以確定樣本量大小；部分研究未報告分組隱蔽和施盲，可能產生盲法偏倚；納入研究存在異質性，無法進行定量分析。

綜上所述，BMSC-EXO可改善脊髓損傷后運動功能，減少脊髓組織受損，增加殘存體積，可能通過抗凋亡、抗炎、減輕BSCB 通透性、促進軸突和血管生長等多種作用機制實現。受納入研究數量和質量限制，上述結論尚待更多高質量研究予以驗證。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。