棉花抗枯萎病相關(guān)基因GhERF5-4D的克隆及功能分析

趙曾強(qiáng) 郭文婷 張析 李瀟玲 張薇

（1.石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院，石河子 832000；2.新疆農(nóng)墾科學(xué)院生物技術(shù)研究所，石河子 832000）

棉花是紡織業(yè)主要原料，新疆作為我國(guó)主要棉花生產(chǎn)基地，2020年種植面積為250.19萬(wàn)hm2［1］，而枯萎病菌（Fusarium oxysporum）引起的棉花發(fā)病面積逐年加劇，培育抗病品種是防治棉花枯萎病最經(jīng)濟(jì)有效的措施，利用基因工程技術(shù)挖掘抗病基因，解析其調(diào)控機(jī)理，對(duì)培育抗病棉花品種具有重要意義［2-3］。

植物中第二大類轉(zhuǎn)錄因子AP2/ERF（ethylene response factor）能夠影響植物多種品質(zhì)特征［4-7］，該類家族基因含有典型的60-70個(gè)高度保守的氨基酸殘基組成的AP2/ERF型DNA結(jié)合域［8］，根據(jù)保守域數(shù)量該類轉(zhuǎn)錄因子分為4個(gè)亞族AP2、ERF、RAV 和孤單亞族［4，9］，而 ERF 亞族只含有一個(gè)保守的AP2/ERF型DNA結(jié)合域，其C-端由18個(gè)氨基酸殘基組成α-螺旋，與其他DNA元件或轉(zhuǎn)錄因子相互作用，N-端由3個(gè)反向平行的β-折疊構(gòu)成的堿性親水區(qū)域［10］。ERF轉(zhuǎn)錄因子是高等植物獨(dú)有的一類轉(zhuǎn)錄因子，位于乙烯信號(hào)傳導(dǎo)通路下游，參與一系列生物脅迫和非生物脅迫事件［4，11-12］。研究表明，擬南芥AtERF4過表達(dá)降低對(duì)枯萎病抗性，但該基因缺失后，其突變體提高對(duì)枯萎病抗性［13］，AtERF1［14］、AtORA59［15］過表達(dá)增強(qiáng)植株對(duì)灰霉病抗 性，AtERF1［14］、AtERF2［13］、AtERF14［16］過 表達(dá)增強(qiáng)植株對(duì)枯萎病抗性；煙草NtTsi1［17］、NtERF5［18］、NtOPBP1［19］過表達(dá)分別提高了煙草對(duì)細(xì)菌性斑點(diǎn)病、煙草花葉病毒病和煙草疫病抗性；番茄Pti4、Pti5、TSRF1過表達(dá)分別提高白粉病和細(xì)菌性斑點(diǎn)病、野火病和青枯病抗性［20］。總之，多數(shù)ERF轉(zhuǎn)錄因子過表達(dá)后能夠提高植物抗病性，說明該類轉(zhuǎn)錄因子在轉(zhuǎn)錄調(diào)控中具有轉(zhuǎn)錄激活特性，在植物抗病性中起關(guān)鍵作用。

除擬南芥、煙草、番茄外，在小麥［21］、大麥［22］、大豆［23］、水稻［24］、苜蓿［25］中均發(fā)現(xiàn)該類轉(zhuǎn)錄因子能夠參與植物對(duì)病原菌的脅迫響應(yīng)；棉花GhERF4［26］、GhERF5［27］、GhERF2［28］、GhERF3［28］與 GhERF6［28］均可響應(yīng) ET、ABA、鹽、冷及干旱誘導(dǎo)；GbERF1/2［29］在黃萎病菌侵染后其表達(dá)量明顯升高，將其在煙草中過表達(dá)后，轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)一些真菌病害的抵抗能力提高，PR-1b、PR2a和PR4等病程相關(guān)蛋白基因的表達(dá)量均明顯增加［10］。

雖然棉花中關(guān)于ERF轉(zhuǎn)錄因子研究較多，但主要以非生物脅迫為主，而關(guān)于棉花抗病相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子基因報(bào)道不多，與抗枯萎病相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子基因的報(bào)道更是甚少。

本研究利用前期獲得的枯萎病菌誘導(dǎo)棉花根部基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)［30-31］，并從中篩選AP2/ERF家族表達(dá)差異基因?yàn)樘结?，結(jié)合棉花全基因組數(shù)據(jù)庫(kù)選取與枯萎病響應(yīng)相關(guān)AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子基因進(jìn)行深入研究，豐富作物抗病基因資源，為農(nóng)作物抗病性狀的遺傳改良奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

抗枯萎病陸地棉品種中棉所12、感枯萎病陸地棉品種新陸早7號(hào)、強(qiáng)致病力棉花枯萎病菌菌系F430、大腸桿菌感受態(tài)DH-5α由石河子大學(xué)棉花分子育種實(shí)驗(yàn)室提供，病毒誘導(dǎo)基因沉默（virus induced gene silencing，VIGS）載體由石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院劉慧英老師惠贈(zèng)。

1.2 方法

1.2.1 材料種植 選取飽滿的種子播種于蛭石中，待棉苗長(zhǎng)出第一片真葉后移至霍格蘭培養(yǎng)液中，于26℃（光照16 h/黑暗8 h）培養(yǎng)，棉苗第一片真葉完全展平后用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.2 枯萎病菌活化 將保存于-80℃的菌種在固體查式培養(yǎng)基劃線26℃暗培養(yǎng)4-5 d后，將其放入液體查式培養(yǎng)基于26℃暗培養(yǎng)一周左右，調(diào)節(jié)孢子數(shù)至1×107個(gè)/mL備用。

1.2.3 材料處理 （1）枯萎病接菌處理：待棉苗第一片真葉完全展開，選取長(zhǎng)勢(shì)一致的幼苗傷根，棉苗浸泡于孢子濃度為1×107個(gè)/mL的枯萎病菌孢子懸浮液中40 min，而后轉(zhuǎn)入霍格蘭營(yíng)養(yǎng)液。取未處理棉苗以及處理后1、3、6、12、24和48 h棉花根部組織，同時(shí)設(shè)置平行對(duì)照（mock），即相同生長(zhǎng)環(huán)境下清水處理的棉花根部組織，取樣時(shí)間一致。

（2）激素處理：待棉苗第一片真葉完全展開，選取長(zhǎng)勢(shì)一致的幼苗分別置于含有1 mmol/L ET、50 μmol/L SA、1 mmol/L JA溶液中浸泡40 min，然后，轉(zhuǎn)移至新鮮霍格蘭營(yíng)養(yǎng)液中，取未處理棉苗以及處理后1、3、6、12、24和48 h棉花根部組織，同時(shí)設(shè)置平行對(duì)照（mock），即相同生長(zhǎng)環(huán)境下清水處理的棉花根部組織，取樣時(shí)間一致，樣品經(jīng)液氮冷激后-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 棉花總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄 采用EASYspin Plus植物RNA快速提取試劑盒（北京艾德萊生物科技有限公司，中國(guó)，目錄號(hào)：RN38）提取棉花總RNA，使用TaKaRa公司cDNA第一鏈合成試劑盒（寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司（TaKaRa中國(guó)），中國(guó)，目錄號(hào)：6110A）進(jìn)行cDNA合成，試驗(yàn)過程嚴(yán)格按照說明書操作。

1.2.5 GhERF5-4D的克隆及表達(dá)特征分析 以枯萎病菌誘導(dǎo)棉花根部基因表達(dá)譜中獲得的差異表達(dá)基因?yàn)樘结?，結(jié)合棉花數(shù)據(jù)庫(kù)，通過序列比對(duì)，從陸地棉中獲得基因GhERF5-4D（GhERF5-4D原命名為GhERF1.1，Genbank：MF093148），依據(jù)ORF序列，利用Oligo7軟件分別設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量（qPCR）引物和ORF全長(zhǎng)引物（表1），利用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因GhERF5-4D，擴(kuò)增程序?yàn)?4℃ 5 min；94℃ 30 s，59℃ 30 s，72℃ 1 min，30 個(gè)循環(huán) ；72℃10 min，通過系列試驗(yàn)驗(yàn)證后，將獲得的陽(yáng)性菌株送上海生工進(jìn)行基因測(cè)序；利用qRT-PCR方法檢測(cè)GhERF5-4D在不同脅迫處理下表達(dá)情況，以GhUBQ7（DQ116411）為內(nèi)參基因，反應(yīng)體系及程序參考全式金公司Trans start Tip Green qPCR Super Mix說明書，試驗(yàn)設(shè)3個(gè)重復(fù)，采用2-ΔΔCt法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。

1.2.6 VIGS載體構(gòu)建 根據(jù)GhERF5-4D非保守區(qū)設(shè)計(jì)沉默引物GhERF5-4D-CO，采用酶切連接方法進(jìn)行VIGS載體構(gòu)建，將構(gòu)建好的pTRV2-GhERF5-4D-CO重組質(zhì)粒通過電擊法轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌GV3101，菌液PCR篩選鑒定陽(yáng)性菌株，引物見表1。

1.2.7 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的VIGS基因沉默 TRV為雙粒RNA病毒，因此需要二元病毒載體共侵染棉花，分別將含pTRV2-GhCLA1和pTRV2-GhERF5-4D-CO重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌GV3101，挑取單克隆至10 mL LB（含25 mg/L慶大霉素和50 mg/L卡那霉素）液體培養(yǎng)基中，于28℃、180 r/min過夜培養(yǎng)后，將上述菌液按1∶50比例分別加至含終濃度為10 mmol/L的MES和20 μmol/L的乙酰丁香酮150 mL的LB（含25 mg/L慶大霉素和50 mg/L卡那霉素）培養(yǎng)基中，于28℃、180 r/min過夜培養(yǎng)；次日離心收集菌體沉淀（5 000 r/min，10 min），用重懸液（10 mmol/L的MES、200 μmol/L的乙酰丁香酮及10 mmol/L的MgCl2）重懸，室溫放置3 h后，將含pTRV2載體、pTRV2-GhCLA1重組質(zhì)粒、pTRV2-GhERF5-4D-CO重組質(zhì)粒菌液分別與含pTRV1載體的菌液等體積混合，用注射器按壓棉花葉子背面侵染，接種后將植株置于光照16 h 25℃/黑暗8 h 20℃培養(yǎng)，15 d后基因沉默植株再接種棉花枯萎病菌7號(hào)生理小種F430，檢測(cè)沉默株系中抗病相關(guān)基因表達(dá)量情況，抗病相關(guān)基因引物詳見表1，試驗(yàn)設(shè)計(jì)3個(gè)重復(fù)，采用2-ΔΔCt法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。

表1 引物列表Table 1 Table of primers

2 結(jié)果

2.1 GhERF5-4D的克隆及序列分析

以實(shí)驗(yàn)室前期獲得的枯萎病菌誘導(dǎo)棉花根部基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，從中篩選AP2/ERF（ethylene response factor）家族表達(dá)差異基因?yàn)樘结槪Y(jié)合棉花數(shù)據(jù)庫(kù)，通過序列比對(duì)從陸地棉D(zhuǎn)07染色體上獲得一個(gè)ORF完整且無(wú)內(nèi)含子基因GhERF5-4D，根據(jù)此序列設(shè)計(jì)該基因ORF全長(zhǎng)引物，以棉花根部cDNA為模板進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，獲得ORF全長(zhǎng)為663 bp，編碼220個(gè)氨基酸（圖1-A-C），利用SMART分析氨基酸編碼區(qū)，結(jié)果（圖1-D）顯示，含有一個(gè)AP2結(jié)構(gòu)域，屬于ERF亞族，編碼蛋白分子量24 910.25 Da，等電點(diǎn)9.30，利用PlantCARE對(duì)GhERF5-4D上游2 000 bp啟動(dòng)子序列分析發(fā)現(xiàn)，序列中除啟動(dòng)子核心元件和光響應(yīng)元件外，還包括干旱響應(yīng)元件、乙烯、脫落酸及茉莉酸響應(yīng)元件、MYB結(jié)合位點(diǎn)及MYC識(shí)別位點(diǎn)（圖1-E）。

圖1 GhERF5-4D的PCR擴(kuò)增及序列分析Fig.1 PCR amplification and sequence analysis of GhERF5-4 D gene

2.2 GhERF5-4D的表達(dá)分析

枯萎病菌侵染抗感病棉花品種后，運(yùn)用qPCR方法分析GhERF5-4D的表達(dá)特征，抗病品種中，GhERF5-4D在各處理時(shí)間點(diǎn)表達(dá)量均高于mock，其表達(dá)趨勢(shì)為先增加后降低，處理12 h時(shí)，其表達(dá)量是同時(shí)間點(diǎn)mock處理的2.4倍，為對(duì)照的8.4倍（圖2-A）；感病品種中，枯萎病菌處理后，除12 h外，該基因在其它時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)量均低于對(duì)照mock（圖2-B），表達(dá)模式與抗病品種截然不同，推測(cè)該基因在棉花抗枯萎病中發(fā)揮著一定作用。

圖2 棉花中枯萎病菌誘導(dǎo)下GhERF5-4D的表達(dá)模式Fig.2 Expression pattern of GhERF5-4 D gene after treat by Fusarium oxysporum in cotton

前期研究顯示GhERF5-4D啟動(dòng)子區(qū)域含有激素響應(yīng)順式元件，通過研究3種激素處理抗病棉花品種并分析其表達(dá)特征，結(jié)果（圖3）顯示，乙烯（ethylene，ET）和茉莉酸甲酯（methyl jasmonate，MeJA）處理后，GhERF5-4D上調(diào)表達(dá)，且在ET處理3 h時(shí)達(dá)最大值，為同時(shí)期mock的4.2倍，而在MeJA處理6 h時(shí)，相對(duì)表達(dá)量達(dá)到峰值，為同時(shí)期mock的1.4倍；水楊酸處理后，各處理時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)量均低于mock，為下調(diào)表達(dá)。

圖3 不同激素處理下GhERF5-4D的表達(dá)模式Fig.3 Expression pattern of GhERF5-4 D gene after the treatment of different hormones

2.3 GhERF5-4D的VIGS載體構(gòu)建

以棉花根部組織cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，干擾片段約400 bp（圖4-A），連接T載體進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證（圖4-B），將正確的重組質(zhì)粒與VIGS載體pTRV2進(jìn)行雙酶切（Kpn I和Xba I雙酶切），回收正確片段，利用酶切連接的方法構(gòu)建pTRV2-GhERF5-4D-CO重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，菌液PCR驗(yàn)證正確后提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證（圖4-C），獲得正確的重組pTRV2-GhERF5-4D-CO載體，采用電擊法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101，菌液PCR驗(yàn)證正確后-80℃保存?zhèn)溆茫▓D4-D）。

圖4 pTRV2-GhERF5-4D-CO載體的構(gòu)建Fig.4 Vector construction of pTRV2-GhERF5-4D-CO

2.4 GhERF5-4D的沉默效率檢測(cè)

以GhCLA1為報(bào)告基因，注射15 d后，棉苗真葉完全白化（圖5-A），表明報(bào)告基因GhERF5-4D已被沉默，該載體可用于棉花中基因功能研究，進(jìn)一步檢測(cè)GhERF5-4D的沉默效率，分別提取注射空載與pTRV2-GhERF5-4D-CO棉苗根部組織總RNA，利用qRT-PCR分析該基因的相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果（圖5-B）表明，其相對(duì)表達(dá)量均明顯低于對(duì)照，為對(duì)照表達(dá)量的20%。

圖5 GhERF5-4D沉默效率與葉片漂白情況Fig.5 GhERF5-4D gene silencing efficiency and leaf bleaching

2.5 沉默株系接菌試驗(yàn)及病原菌恢復(fù)培養(yǎng)

以注射空載植株為對(duì)照，對(duì)沉默目的基因的植株進(jìn)行枯萎病菌接菌處理并觀察發(fā)病情況，接菌12 d時(shí)，注射空載的棉苗和沉默目的基因的棉苗均出現(xiàn)發(fā)病跡象，但注射空載棉苗下部少量葉片變黃，出現(xiàn)萎蔫現(xiàn)象，而沉默目的基因（pTRV1∶pTRV2-GhERF5-4D-CO）棉苗葉片黃化數(shù)目明顯多于注射空載菌液的棉苗，且上部葉片也出現(xiàn)黃化癥狀（圖6-A）；接菌20 d時(shí)，棉苗葉片開始失綠發(fā)黃，逐漸變軟，最后呈干枯狀態(tài)，而沉默目的基因（pTRV1∶pTRV2-GhERF5-4D-CO）棉苗葉片黃化、干枯以及脫落的數(shù)量明顯高于注射空載菌液的棉苗；分別取子葉節(jié)上端同一部位莖段進(jìn)行病原菌恢復(fù)培養(yǎng)，培養(yǎng)20 d時(shí)注射空載棉苗和沉默目的基因（pTRV1∶pTRV2-GhERF5-4D-CO）棉苗均能分離出枯萎病菌，但沉默目的基因（pTRV1∶pTRV2-GhERF5-4D-CO）棉苗分離出的枯萎病菌生長(zhǎng)更快，以上結(jié)果說明沉默目的基因的植株與對(duì)照相比對(duì)枯萎病菌耐受性更弱，更易被枯萎病菌侵染，表明GhERF5-4D參與了棉花對(duì)枯萎病菌的抗性響應(yīng)。

圖6 GhERF5-4D沉默后接菌處理Fig.6 GhERF5-4 D gene silencing followed by bacterial treatment

2.6 沉默株系中防衛(wèi)基因的表達(dá)特征分析

以GhCLA1為報(bào)告基因，待棉苗真葉完全白化時(shí)，對(duì)沉默目的基因的棉苗進(jìn)行枯萎病菌接菌處理，取注射空載及沉默目的基因植株接菌6 h根部組織提取總RNA，利用qRT-PCR分析與抗病相關(guān)防衛(wèi)基因的表達(dá)特征，與對(duì)照相比，PR1相對(duì)表達(dá)量變化不明顯，而PR2、PR4、PR5、NPR1、ERF1相對(duì)表達(dá)量均不同程度低于對(duì)照，分別為對(duì)照表達(dá)量的64%、20%、69%、77%和72%，而WRKY70相對(duì)表達(dá)量高于對(duì)照，為對(duì)照的1.38倍（圖7）。

圖7 與抗病相關(guān)防衛(wèi)基因表達(dá)特征分析Fig.7 Expression characteristics of defense genes related to disease resistance

3 討論

植物在其生長(zhǎng)周期內(nèi)，無(wú)時(shí)無(wú)刻遭受生物脅迫和非生物脅迫危害，眾多研究表明轉(zhuǎn)錄因子家族通過調(diào)控乙烯、茉莉酸和水楊酸等次級(jí)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在抗病過程中扮演重要的角色［32-33］。ERF轉(zhuǎn)錄因子家族是高等植物獨(dú)有的一類轉(zhuǎn)錄因子，位于乙烯和茉莉酸信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，能夠調(diào)控下游抗病相關(guān)防衛(wèi)基因（如PR基因）表達(dá)，增強(qiáng)植物對(duì)病原菌的抵抗能力［34-35］。

本研究以枯萎病菌誘導(dǎo)棉花基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)為依據(jù)并結(jié)合棉花全基因組數(shù)據(jù)庫(kù)，從陸地棉D(zhuǎn)07染色體上獲得1個(gè)ORF完整、含1個(gè)AP2結(jié)構(gòu)域且無(wú)內(nèi)含子的ERF亞族基因GhERF5-4D，qRT-PCR技術(shù)分析該基因在抗感病品種中接種枯萎病菌后表達(dá)特征，結(jié)果顯示，GhERF5-4D在抗感病棉花品種中表達(dá)特征存在明顯差異，抗病品種中該基因上調(diào)表達(dá)，感病品種中該基因下調(diào)表達(dá)，此結(jié)果與Guo等［36］研究結(jié)果相似，即海島棉中獲得的ERF類轉(zhuǎn)錄因子基因GbERF1-like在抗病感病品種間受黃萎病菌誘導(dǎo)后表達(dá)模式存在差異，表明GhERF5-4D能夠響應(yīng)枯萎病菌侵染，且該基因在棉花抗枯萎病中發(fā)揮著一定作用。

在此結(jié)果基礎(chǔ)上，通過3種激素處理抗病棉花品種并分析GhERF5-4D表達(dá)特征，結(jié)果顯示，乙烯（ET）、茉莉酸甲酯（MeJA）處理后，該基因?yàn)樯险{(diào)表達(dá)，而水楊酸處理后，該基因?yàn)橄抡{(diào)表達(dá)，表明該基因參與ET、JA和SA三條信號(hào)路徑，且ET、MeJA正調(diào)控GhERF5-4D表達(dá)，而SA負(fù)調(diào)控GhERF5-4D表達(dá)；研究顯示，多數(shù)與抗病相關(guān)的ERF轉(zhuǎn)錄因子基因的表達(dá)都受到病原菌以及不同激素誘導(dǎo)［37-38］，表明ERF家族基因大多數(shù)受ET、SA和JA等抗病信號(hào)分子所誘導(dǎo)，且在作物抗病反應(yīng)中起重要作用［39-41］；金莉［42］研究表明GbERF1在擬南芥中響應(yīng)ET和SA信號(hào)通路，ET-SA起協(xié)同作用誘導(dǎo)GbERF1的表達(dá)，增加了對(duì)黃萎病的抗性，因此，推測(cè)GhERF5-4D能被ET/MeJA協(xié)同誘導(dǎo)GhERF5-4D的表達(dá)，增加棉花對(duì)枯萎病抗性。

本研究利用VIGS技術(shù)沉默GhERF5-4D后并進(jìn)行接菌試驗(yàn)，結(jié)果表明，與對(duì)照相比，沉默株系更感病，選取接種6 h的根部組織進(jìn)行下游抗病相關(guān)防衛(wèi)基因表達(dá)特征分析，結(jié)果顯示，與對(duì)照相比，PR1的表達(dá)量變化不明顯，但PR2、PR4、PR5、NPR1、ERF1表達(dá)量均在不同程度低于對(duì)照，WRKY70相對(duì)表達(dá)量高于對(duì)照，由此推測(cè)GhERF5-4D通過調(diào)控下游 PR2、PR4、PR5、NPR1、WRKY70、ERF1表 達(dá)調(diào)節(jié)棉花對(duì)枯萎病的抗性。前人研究發(fā)現(xiàn)，ERF轉(zhuǎn)錄因子基因在植物抗病過程中是通過多數(shù)基因相互協(xié)同，如Moffat等［43］對(duì)擬南芥灰霉菌感病性研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥ERF5與ERF6的過表達(dá)株系抗病性明顯得到增強(qiáng)。O?ate-Sánche等［16］研究發(fā)現(xiàn)，許多轉(zhuǎn)錄因子具有相似的結(jié)合和調(diào)控效力，這導(dǎo)致大量的轉(zhuǎn)錄因子之間存在功能冗余現(xiàn)象。李文正等［44］研究發(fā)現(xiàn)，多數(shù)ERF轉(zhuǎn)錄因子基因受到ET、茉莉酸、水楊酸、脫落酸等次級(jí)信號(hào)分子的誘導(dǎo)，并且在植物的應(yīng)激反應(yīng)中起著極其重要的作用。

4 結(jié)論

從陸地棉獲得一個(gè)ERF亞族基因GhERF5-4D，ORF為663 bp，編碼220個(gè)氨基酸，啟動(dòng)子序列中包括多個(gè)激素和脅迫響應(yīng)元件，能夠響應(yīng)枯萎病菌與ET、MeJA、SA脅迫，基因沉默后，沉默植株更感病，推測(cè)GhERF5-4D可能通過參與乙烯、茉莉酸途徑調(diào)控下游抗病相關(guān)防衛(wèi)基因調(diào)節(jié)棉花對(duì)枯萎病的抗性。