馬尾松NAC轉(zhuǎn)錄因子基因PmNAC8的克隆及表達(dá)分析

鎬青青 姚圣 劉佳禾 陳佩珍 張夢(mèng)洋 季孔庶

（南京林業(yè)大學(xué) 南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心 林木遺傳與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210037）

植物經(jīng)常遭受自然界中有害的環(huán)境脅迫（如干旱、高溫、冷害、凍害以及高鹽等非生物脅迫），對(duì)植物的生長(zhǎng)和發(fā)育產(chǎn)生不利影響，對(duì)農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)和生態(tài)環(huán)境造成嚴(yán)重的損失［1-2］。為了應(yīng)對(duì)不利的環(huán)境條件，植物通過(guò)調(diào)節(jié)自身基因的表達(dá)來(lái)抵御脅迫，從而獲得脅迫耐受性［3-4］。AP2/EREBP、WRKY、bZIP、MYB和NAC等類型的轉(zhuǎn)錄因子（transcription factors，TFs）已被證明在植物非生物脅迫反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用［5］。NAC轉(zhuǎn)錄因子家族是植物特有的一類轉(zhuǎn)錄因子，它的命名取自最早發(fā)現(xiàn)的矮牽牛（Petunia hybrida Vilm.）NAM 基因、擬南芥（Arabidopsis thaliana）ATAF1基因和CUC2基因的首字母［6］。

在擬南芥中首次報(bào)道了NAC轉(zhuǎn)錄因子參與干旱反應(yīng)的調(diào)控，據(jù)報(bào)道，過(guò)表達(dá)ANAC019、ANAC055和ANAC072可以調(diào)控?cái)M南芥干旱應(yīng)答基因的表達(dá)，提高轉(zhuǎn)基因植物的耐旱性［7］。水稻 OsNAP［8］、小麥 TaNAC69［9］和 玉 米 ZmSNAC1［10］等 NAC 轉(zhuǎn) 錄因子均參與干旱反應(yīng)的調(diào)控。此外，一些干旱相關(guān)的NAC基因也參與植物激素介導(dǎo)的信號(hào)通路，如脫落酸、茉莉酸、水楊酸和乙烯的信號(hào)通路［11］。Mahmood等［12-13］研究表明ANAC032促進(jìn)植株葉片衰老的同時(shí)，在非生物脅迫（如蔗糖、鹽和氧化）下，又能抑制花青素的合成；而擬南芥ANC046既能促進(jìn)葉片衰老也能促進(jìn)花青素的合成［14］。在馬鈴薯（Solanum tuberosum）中，StNAC2對(duì)鎘脅迫有一定的應(yīng)答和調(diào)節(jié)作用［15］。在水稻（Oryza sativa L.）中，過(guò)表達(dá)OsNAC5可以增大水稻根系的直徑，提高對(duì)干旱的耐受性，從而增加水稻產(chǎn)量［16］。在豆科植物中間錦雞兒（Caragana intermedia）中，過(guò)表達(dá)CiNAC1可促進(jìn)擬南芥葉片衰老，并且在乙烯處理后與葉綠素降解和衰老相關(guān)的基因表達(dá)量明顯提高［17］。在山葡萄（Vitis amurensis）中，VaNAC26 可以通過(guò)上調(diào)茉莉酸合成基因和茉莉酸信號(hào)通路中的基因表達(dá)，提高擬南芥體內(nèi)的茉莉酸含量來(lái)增強(qiáng)對(duì)干旱的耐受力［18］。在桃樹（Amygdalus persica）中，PpNAC72在桃樹果實(shí)中高表達(dá)，推測(cè)該基因可能參與果實(shí)成熟［19］。

馬尾松（Pinus massoniana）是松科（Pinaceae）松屬常綠喬木，具有速生、豐產(chǎn)、適應(yīng)性強(qiáng)、經(jīng)濟(jì)價(jià)值高等優(yōu)良特性，是我國(guó)南方最主要的優(yōu)質(zhì)針葉用材樹種之一［20］。由于我國(guó)南方紅壤中有效磷含量低，頻繁發(fā)生干旱、低溫等非生物脅迫，使得馬尾松造林存活率和生產(chǎn)力降低，造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。NAC作為植物特有的一類轉(zhuǎn)錄因子，在植物生物和非生物脅迫反應(yīng)的調(diào)控中起著關(guān)鍵作用。而且，現(xiàn)階段對(duì)NAC基因的研究主要集中在模式植物，如擬南芥、水稻和大豆等，對(duì)木本植物的研究較為薄弱，尤其是馬尾松等針葉樹種。因此，對(duì)馬尾松NAC轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行功能鑒定是必要的。

本研究運(yùn)用RT-PCR的方法成功克隆了馬尾松PmNAC8，對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析、亞細(xì)胞定位，組織特異性以及在干旱、損傷等非生物脅迫和外源激素方面的響應(yīng)表達(dá)模式分析，以期為馬尾松抗逆分子育種提供候選基因資源和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

馬尾松植物材料取自南京林業(yè)大學(xué)樹木園中15年生實(shí)生苗和實(shí)驗(yàn)室盆栽的30 d幼苗；本氏煙草在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24℃長(zhǎng)日照（18 h光照/6 h黑暗），28 d后取長(zhǎng)勢(shì)較好且一致的植株作為試驗(yàn)材料。

多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（離心柱型）購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；大腸桿菌菌株Trans1-T1感受態(tài)、克隆載體pEASY-Blunt Simple購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；PrimeScriptTMRT Master Mix（Perfect Real Time）、SMARTer RACE5′/3′Kit和 3′-Full RACE Core Set with PrimeScrip RTase Kit購(gòu) 自 TaKaRa公 司；DNA marker、Green Taq Mix、Phanta Max Super-Fridelity DNA Polymerase均購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司；本研究所有引物均由Primer 5軟件設(shè)計(jì)，并由擎科生物科技有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 RNA的提取和cDNA合成 參照TIANGEN多糖多酚植物總RNA提取試劑盒說(shuō)明書，提取30 d盆栽馬尾松幼苗全株RNA，所得產(chǎn)物經(jīng)1.2%凝膠電泳檢測(cè)，保證RNA完整性，同時(shí)，使用超微量紫外分光光度計(jì)（NANODROP 2000，ThermoFisher公司）對(duì)RNA濃度進(jìn)行測(cè)量，若OD260/280、OD260/230比值為1.8-2.1，說(shuō)明RNA質(zhì)量較好。選取2 μg濃度較高且純度較好的RNA，利用全式金反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一條鏈，作為基因克隆的模板。根 據(jù) SMARTer?RACE 5′Kit 和 3′-Full Core Set with PrimeScriptTM RTase試劑盒說(shuō)明書，合成5′和3′末端模板。

1.2.2 PmNAC8的克隆 從NCBI（national center for biotechnology information）搜索不同植物的NAC序列，與馬尾松當(dāng)年生嫩枝轉(zhuǎn)錄組（PRJNA655997）數(shù)據(jù)［21］相比較，篩選出目的基因，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)中間片段引物PmNAC8-Mid（表1）。以馬尾松幼苗的cDNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，總反應(yīng)體系為 cDNA（50 ng/μL）2 μL、PmNAC8-Mid F 1 μL、PmNAC8-Mid R 1 μL、5×GXL Buffer（Mg2+Plus）10 μL、DNTP Mix-ture 5 μL，ddH2O 補(bǔ)至 50 μL ；反應(yīng)程序?yàn)?98℃ 3 min ；98℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃2 min，35個(gè)循環(huán)；72℃ 7 min，4℃保存。

以測(cè)序獲得的PmNAC8中間片段的序列為參照，利用Primer 5.0軟件分別設(shè)計(jì)3′RACE特異性引物 ：3′RACE-PmNAC8-F、3′RACE-PmNAC8-R 以 及5′RACE 特異 性引物 5′RACE-PmNAC8-F、5′RACEPmNAC8-R（表1），分別以 3′-Full Core Set with Prime-ScriptTMRTase 試劑盒和 SMARTer?RACE5′ Kit試劑盒反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，分別與接頭引物 3′RACE Outer、3′RACE Inner 和 5′RACE Outer、5′RACE Inner進(jìn)行巢式PCR，各反應(yīng)均遵循試劑盒說(shuō)明。將反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)過(guò)1.2%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證、回收，與pEASY-Blunt載體連接，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞Trans1-T1，挑取陽(yáng)性單克隆送上海杰李生物公司進(jìn)行測(cè)序。用Seqman軟件拼接序列獲得基因全長(zhǎng)。

為驗(yàn)證拼接結(jié)果的準(zhǔn)確性，在序列兩端設(shè)計(jì)引物，分別為：PmNAC8-F和PmNAC8-R（表1），以馬尾松cDNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，產(chǎn)物經(jīng)連接轉(zhuǎn)化后，送至上海杰李公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.3 PmNAC8的生物信息學(xué)分析 利用ORF Finder（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/） 在線預(yù)測(cè)開放閱讀框，確定基因編碼序列；利用ExPASy（https://web.expasy.org/protparam/） 在 線 軟件分析氨基酸序列的基本理化性質(zhì)；利用ExPASy TMpred（https://embnet.vital-it.ch/software/TMPRED_form.html） 和 MHMM 2.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）在線分析蛋白質(zhì)的跨膜區(qū)和擴(kuò)膜方向；利用SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgibin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）在線軟件分析預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)；利用SWISS-MODEL（https://swissmodel.expasy.org/interactive）在線預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)；利用SignalP-4.0 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.0/）在線軟件預(yù)測(cè)蛋白的信號(hào)肽；利用Motif Scan（https://myhits.isb-sib.ch/cgibin/motif_scan）在線軟件分析蛋白的結(jié)構(gòu)域。

將PmNAC8編碼氨基酸序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行blastp比對(duì)，下載blast score較高的氨基酸序列，利用 MEGA X［22］，Evolview（https://www.evolgenius.info/ evolview/） 和 iTOL5.0（https://itol.embl.de/） 在線軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.4 PmNAC8同義密碼子偏好性分析 密碼子是生物體內(nèi)遺傳信息從DNA到蛋白質(zhì)準(zhǔn)確傳遞的載體［23-24］。不同生物對(duì)密碼子的選擇具有不同的偏好性，當(dāng)宿主不具備或僅含有稀少的外源基因密碼子時(shí)，外源基因的表達(dá)可能降低或終止。因此，對(duì)密碼子使用偏好性進(jìn)行分析，有助于選擇合適的外源表達(dá)宿主，保證外源基因順利表達(dá)。利用CodonW軟 件（http://codonw.sourceforge.net/）計(jì) 算 PmNAC8密碼子的使用特性參數(shù)，包括A3s、C3s、U3s、GC含量、有效密碼子數(shù)（effective number of codons，ENc）、密碼子中第3位堿基的GC含量（GC3s）、相對(duì)同義密碼子使用度（relative synonymous codon usage，RSCU）和密碼子適應(yīng)指數(shù)（codon adaptation index，CAI）等。運(yùn)用EMBOSS中的CUSP在線程序計(jì)算密碼子的使用頻率。

擬南芥、煙草（Nicotiana tabacum）、歐洲山楊（Populus tremula）、大腸桿菌（Escherichia coli）和釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的基因組密碼子使用頻率數(shù)據(jù)來(lái)自密碼子使用數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.kazusa.or.jp/codon）。

1.2.5 馬尾松PmNAC8亞細(xì)胞定位載體的構(gòu)建及農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化 使用Xba I和BamH I酶切瞬時(shí)表達(dá)載體PBI121-GEP，同時(shí)利用高保真酶擴(kuò)增含有酶切位點(diǎn)的目的基因，上下游引物分別為：PmNAC8-GFP-F和PmNAC8-GFP-R（表1），將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與雙酶切產(chǎn)物回收純化后重組并轉(zhuǎn)化大腸桿菌，選取陽(yáng)性菌液送至杰李公司測(cè)序。將構(gòu)建成功的融合表達(dá)載體質(zhì)粒（35S∷PmNAC8-GFP）轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101，以只含有GFP標(biāo)簽的質(zhì)粒農(nóng)桿菌菌株為對(duì)照。將P19菌液與目標(biāo)菌液等比例混合后按照李尊強(qiáng)等［25］方法將農(nóng)桿菌重懸液注射于生長(zhǎng)狀態(tài)較好的煙草葉片中，在人工氣候培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)48 h后，利用激光共聚焦顯微鏡LSM710（Zeiss，Jena，Germany）觀察GFP融合蛋白的位置。

1.2.6 qRT-PCR分析 為了研究馬尾松PmNAC8的表達(dá)水平，根據(jù)天根生化科技有限公司的多糖多酚植物總RNA提取試劑盒說(shuō)明書，分別提取了15年生馬尾松不同組織及8種處理下30 d幼苗的RNA。利用超微量分光光度計(jì)測(cè)定總RNA濃度與OD260/280、OD260/230的值并進(jìn)行凝膠電泳檢測(cè)其彌散程度（方法同1.2.1），將檢測(cè)結(jié)果符合要求的RNA作為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。8種處理包括非生物脅迫和激素處理，分別是機(jī)械損傷、15% PEG6000、10 mmol/L MeJA、50 μmol/L ETH、10 mmol/L H2O2、2 mmol/L GA、1 mmol/L SA和400 μmol/L ABA，其中機(jī)械損傷的處理方法是通過(guò)切斷松針的上半部分、15% PEG6000處理方法是將植物浸泡在溶液中模擬干旱，其他脅迫和處理均采用噴淋植物表面的方式進(jìn)行［26］。每個(gè)處理選擇3株長(zhǎng)勢(shì)均勻的幼苗作為3個(gè)生物重復(fù)，每個(gè)植株收集3個(gè)樣品作為3個(gè)技術(shù)重復(fù)，每隔0、3、6、12和24 h取幼苗針葉作為樣品，經(jīng)液氮速凍后，-80℃保存?zhèn)溆茫渲校? h收集的樣品未經(jīng)任何處理用作對(duì)照組。利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)定量PCR特異性引物Q-PmNAC8-F和Q-PmNAC8-R，以Zhu等［27］篩選出的馬尾松較穩(wěn)定的Tubulin alpha（GenBank登錄號(hào)：KM496535.1）作為內(nèi)參基因，并設(shè)計(jì)內(nèi)參引物（表1），進(jìn)行定量PCR反應(yīng)。將得到的cDNA模板稀釋20倍，備用。反應(yīng)體系和反應(yīng)程序參考 Hieff UNICON?qPCR SYBR Green Master Mix試劑盒說(shuō)明書。反應(yīng)結(jié)束后，將數(shù)據(jù)導(dǎo)出，參照2-ΔΔCT法計(jì)算該基因的相對(duì)表達(dá)量，使用Microsoft Office Excel 2019和GraphPad Prism 8.0等軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析及基因表達(dá)圖的繪制。

1.2.7 啟動(dòng)子克隆和序列分析 根據(jù)在馬尾松近緣物種火炬松基因組數(shù)據(jù)庫(kù)檢索到的PmNAC8啟動(dòng)子序列，設(shè)計(jì)2條特異性引物GSP1和GSP2（表1），利用天根植物基因組提取試劑盒提取15年生馬尾松基因組DNA，按照TaKaRa生物公司染色體步移技術(shù)試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)，回收清晰條帶，連接克隆載體pEASY-Blunt，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，挑選正確的單克隆擴(kuò)大培養(yǎng)后送至上海杰李生物公司測(cè)序。根據(jù)測(cè)序序列設(shè)計(jì)特異性引物PmNAC8-Pro（表1），以馬尾松基因組DNA為模板克隆啟動(dòng)子全長(zhǎng)。

表1 本研究中使用的引物序列Table 1 Sequences of primers used in this study

利 用 PlantCARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）在線軟件預(yù)測(cè)PmNAC8的啟動(dòng)子內(nèi)部順式作用元件。

2 結(jié)果

2.1 PmNAC8的克隆與序列分析

根據(jù)馬尾松轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中找到的目的基因的EST序列［21］，設(shè)計(jì)特異性引物后，依次進(jìn)行中間片段擴(kuò)增、3′RACE擴(kuò)增、5′RACE擴(kuò)增，之后利用SeqMan軟件拼接獲得該基因的全長(zhǎng)cDNA序列1 726 bp，為驗(yàn)證拼接結(jié)果的正確性，對(duì)其全長(zhǎng)及ORF區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增（圖1）。測(cè)序結(jié)果顯示拼接結(jié)果正確，該基因的ORF為1 209 bp，3′端序列148 bp，5′端序列369 bp，預(yù)測(cè)其可編碼402個(gè)氨基酸，且具有NAC蛋白特有的NAM結(jié)構(gòu)域，因此將其命名為PmNAC8，基因登錄號(hào)為MZ291447。

圖1 馬尾松PmNAC8的全長(zhǎng)及ORF的擴(kuò)增Fig.1 Full-length and ORF amplification of PmNAC8 gene in P.massoniana

2.2 PmNAC8的生物信息學(xué)分析

2.2.1 蛋白理化性質(zhì)及跨膜區(qū)預(yù)測(cè)分析 將PmNAC8序列通過(guò)NCBI在線軟件進(jìn)行ORF預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，其含有開放閱讀框1 209 bp，編碼402個(gè)氨基酸，以ATG為起始密碼子，TGA為終止密碼子。通過(guò)Motif Scan在線分析PmNAC8蛋白的結(jié)構(gòu)域，顯示在其58-191位氨基酸序列是NAC蛋白特有的NAM結(jié)構(gòu)域，其E-value值為2.80E-26，說(shuō)明其屬于NAC轉(zhuǎn)錄因子（圖2-A）。

利用ExPASy ProtParam在線軟件預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)，結(jié)果表明，PmNAC8蛋白由碳、氫、氧、氮、硫5種元素組成，總分子式為C1941H3011N559O639S20，分子量為45 042.82 Da，由402個(gè)氨基酸殘基組成，理論等電點(diǎn)為5.11，其中帶正電荷（Arg+Lys）的氨基酸殘基數(shù)為43，帶負(fù)電荷（Asp+Glu）的氨基酸殘基數(shù)為65。利用ProtScale在線軟件進(jìn)行蛋白疏水性分析，其中橫坐標(biāo)為蛋白質(zhì)氨基酸殘基，縱坐標(biāo)為該位點(diǎn)氨基酸殘基疏水性值，正值表示疏水性氨基酸，負(fù)值表示親水性氨基酸。結(jié)果顯示，分值為負(fù)的氨基酸多于分值為正的氨基酸，即親水大于疏水，因此，推測(cè)PmNAC8蛋白為親水性蛋白（圖2-B）。通過(guò)在線軟件SignalP預(yù)測(cè)PmNAC8蛋白信號(hào)肽，結(jié)果表明，該蛋白不存在信號(hào)肽（圖2-C）。

圖2 PmNAC8蛋白的生物信息學(xué)分析Fig.2 Bioinformatics analysis of PmNAC8 protein

通過(guò)ExPASy TMpred和TMHMM在線軟件預(yù)測(cè)分析蛋白跨膜區(qū)、擴(kuò)膜方向。結(jié)果（圖3-A、B）表明，PmNAC8蛋白為非跨膜蛋白。

圖3 PmNAC8蛋白跨膜區(qū)的預(yù)測(cè)分析Fig.3 Transmembrane region prediction of PmNAC8 protein

2.2.2 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 利用SOPMA在線預(yù)測(cè)分析蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)。結(jié)果（圖4-A）表明，PmNAC8蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)由無(wú)規(guī)則卷曲（Cc）、α-螺旋（Hh）、延伸鏈（Ee）和β-折疊構(gòu)成。其中，無(wú)規(guī)則卷曲有251個(gè)氨基酸，占序列的62.44%；α-螺旋有70個(gè)氨基酸，占序列的17.41%；延伸鏈有61個(gè)氨基酸，占序列的15.17%；β-折疊有20個(gè)氨基酸，占序列的4.98%。通過(guò)SWISS-MODEL網(wǎng)站使用同源建模法在線預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)（圖4-B）。

圖4 PmNAC8蛋白二級(jí)（A）、三級(jí)（B）結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.4 Secondary（A）and tertiary（B）structure predictions of PmNAC8 protein

2.2.3 系統(tǒng)進(jìn)化樹分析 利用進(jìn)化樹設(shè)計(jì)軟件MEGA5.0采用鄰接法（neighbor-joining，NJ），設(shè)置參數(shù)自展值（Bootstrap值）為1 000次進(jìn)行進(jìn)化分析，結(jié)果（圖5）表明，馬尾松的NAC蛋白與火炬松、北美云杉的遺傳距離較近，說(shuō)明它們?cè)谶M(jìn)化的過(guò)程中親緣關(guān)系較為密切，而與其他雙子葉植物的遺傳距離較遠(yuǎn)，說(shuō)明與雙子葉植物的NAC蛋白在進(jìn)化過(guò)程中親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

圖5 PmNAC8蛋白系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹Fig.5 Phylogenetic analysis of PmNAC8 protein

2.3 PmNAC8密碼子偏好性分析

2.3.1 GC、GC3s、ENc和CAI分析 利用CondonW程序分析PmNAC8密碼子的CAI值、ENc值，同時(shí)運(yùn)用EMBOSS中的CUSP在線程序計(jì)算總GC含量以及GC3s有效密碼子數(shù)［28］。結(jié)果（表2）可知，PmNAC8基因的ENc值為50.19，ENc值偏大，說(shuō)明PmNAC8在編碼氨基酸時(shí)密碼子使用偏好性較弱，表達(dá)水平相對(duì)較低。CAI值為0.187，進(jìn)一步表明PmNAC8對(duì)密碼子的選擇偏好性較弱。GC含量和GC3s值分別為31.10%和42.50%，說(shuō)明密碼子偏好以A/T結(jié)尾。

表2 PmNAC8密碼子選擇偏好性參數(shù)Table 2 Codon selection preference parameters of PmNAC8 gene

2.3.2 相對(duì)同義密碼子使用度 在馬尾松PmNAC8的密碼子中，有29個(gè)密碼子的RSCU值大于1（表3），為馬尾松PmNAC8偏好密碼子，并且其中有23個(gè)密碼子是以A/T結(jié)尾；其中偏好性較強(qiáng)的有UCA、GCA和UGA（RSCU＞2.0）；然而編碼甲硫氨酸（Met）的密碼子ATG、編碼色氨酸（Trp）的密碼子TGG、編碼亮氨酸（Leu）的密碼子CTC以及編碼異亮氨酸（Ile）的ATA，其RSCU值均等于1，表明馬尾松PmNAC8基因?qū)et、Trp、Leu和Ile的使用沒(méi)有偏好性。大多數(shù)G或C堿基結(jié)尾的密碼子的RSCU值和Fraction值均較低，表明這些密碼子在該基因中的使用頻率較低。

表3 PmNAC8同義密碼子相對(duì)使用度Table 3 RSCU of PmNAC8 gene

2.4 PmNAC8外源宿主的選擇

將PmNAC8密碼子使用頻率分別與擬南芥、煙草、釀酒酵母、大腸桿菌和歐洲山楊基因組密碼子的使用頻率進(jìn)行分析比較（表4），將比值大于或等于2.0和小于或等于0.5的密碼子作為篩選標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)計(jì)差異個(gè)數(shù)。結(jié)果表明，PmNAC8與煙草、擬南芥和歐洲山楊3種模式植物之間的絕大部分密碼子使用偏好性差異較小，其中，與煙草、擬南芥、歐洲山楊基因組密碼子的使用頻率差異較大的分別有12、14和13個(gè)，說(shuō)明在PmNAC8遺傳轉(zhuǎn)化試驗(yàn)中，煙草更適合作為異源表達(dá)的受體。與3種植物相比，PmNAC8與大腸桿菌和釀酒酵母2種微生物的基因組密碼子偏好性差異較大，尤其與大腸桿菌密碼子偏好性差異很大，而與釀酒酵母密碼子偏好性差異小于大腸桿菌，可能由于釀酒酵母為真核生物，而大腸桿菌為原核生物，可見，相較于大腸桿菌，酵母更適合PmNAC8微生物內(nèi)異源表達(dá)。

表4 PmNAC8與部分模式生物基因組密碼子使用偏好性比較Table 4 Comparison of codon usage preference between PmNAC8 and other model organisms

續(xù)表Continued

2.5 PmNAC8亞細(xì)胞定位試驗(yàn)結(jié)果

構(gòu)建PBI121-PmNAC8-GFP基因的融合表達(dá)載體，以空載體PBI121-GFP為對(duì)照，利用煙草瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)，通過(guò)農(nóng)桿菌將載體轉(zhuǎn)入煙草葉片中，在人工氣候培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)48 h后，利用激光共聚焦顯微鏡LSM710觀察GFP融合蛋白的位置。由圖6可知，PmNAC8蛋白質(zhì)主要定位在細(xì)胞核中，而對(duì)照組細(xì)胞核、細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中均能觀察到綠色熒光信號(hào)。

圖6 PmNAC8亞細(xì)胞定位結(jié)果Fig.6 Subcellular localization results of PmNAC8

2.6 PmNAC8的組織特異性表達(dá)分析

利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)分析了PmNAC8在15年生馬尾松不同組織中的表達(dá)情況。結(jié)果（圖7）表明，PmNAC8在花、幼葉、老葉、幼莖、老莖、根、木質(zhì)部和韌皮部中均有表達(dá)，但表達(dá)水平不同，在根中的表達(dá)水平顯著高于在其他組織，是花的21.4倍，是幼葉和老葉的9.0倍和7.6倍。因此，PmNAC8主要在馬尾松的根中表達(dá)。

圖7 馬尾松PmNAC8在不同組織中的表達(dá)水平Fig.7 PmNAC8 expression level in the different tissues of P.massoniana

2.7 PmNAC8在非生物脅迫下的表達(dá)分析

以 10 mmol/L MeJA、50 μmol/L ETH、10 mmol/L H2O2、2 mmol/L GA、1 mmol/L SA、15% PEG6000、機(jī)械損傷和400 μmol/L ABA處理后的30 d馬尾松盆栽幼苗cDNA為模板，檢測(cè)PmNAC8在脅迫處理下表達(dá)情況（圖8）。在10 mmol/L MeJA和15%PEG6000處理下PmNAC8表達(dá)量均受到顯著抑制，在3 h時(shí)表達(dá)量約為對(duì)照組的1/2和1/4，脅迫至6h后表達(dá)量幾乎完全被抑制。在50 μmol/L ETH、10 mmol/L H2O2、2 mmol/L GA、1 mmol/L SA、損傷和400 μmol/L ABA處理下，PmNAC8表達(dá)量總體呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。在ETH、H2O2、GA、SA處理下，PmNAC8均在3 h時(shí)表達(dá)量最大，與對(duì)照組差異顯著，分別是對(duì)照組的1.13、1.86、6.89和1.15倍，其中在2 mmol/L GA處理下PmNAC8的表達(dá)量顯著高于對(duì)照組和其他脅迫組。在損傷和ABA處理下，PmNAC8的表達(dá)量分別在6和12 h時(shí)最高，與對(duì)照組差異顯著，分別是對(duì)照組的1.62和1.30倍。

圖8 馬尾松PmNAC8在不同脅迫下的表達(dá)水平Fig.8 PmNAC8 expression of P.massonniana under different stress

2.8 PmNAC8啟動(dòng)子順式作用元件分析

為明確PmNAC8啟動(dòng)子是否具有活性，克隆了PmNAC8上游1 492 bp啟動(dòng)子序列（圖9），命名為PmNAC8-Pro。PlantCARE分析顯示，該啟動(dòng)子除含有TATA-box（21個(gè)）、CAAT-box（34個(gè)）等核心啟動(dòng)子元件和光響應(yīng)元件（6個(gè)）以外，還包含與非生物脅迫相關(guān)的元件，如參與干旱誘導(dǎo)的MYB結(jié)合位點(diǎn)MBS（1個(gè)）、抗氧化反應(yīng)元件ARE（2個(gè)），以及植物激素相關(guān)響應(yīng)元件，如赤霉素響應(yīng)元件（1個(gè)）（表5）。基于上述結(jié)果，推測(cè)馬尾松PmNAC8啟動(dòng)子可能參與調(diào)控非生物脅迫以及響應(yīng)植物激素脅迫的功能。

表5 PmNAC8啟動(dòng)子中的順式作用元件Table 5 Cis-acting elements in the PmNAC8 promoter

圖9 PmNAC8啟動(dòng)子擴(kuò)增電泳Fig.9 Amplification electrophoresis of PmNAC8 promoter

3 討論

NAC是植物特有的一類轉(zhuǎn)錄因子，是植物長(zhǎng)發(fā)育及適應(yīng)環(huán)境脅迫的重要轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子。許多研究表明，NAC轉(zhuǎn)錄因子家族在植物中具有不可替代的生物學(xué)功能，如葉片衰老［29］、果實(shí)成熟［30］、胚珠發(fā)育［31］、逆境脅迫應(yīng)答［32］和激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)［33］等。目前，對(duì)NAC轉(zhuǎn)錄因子的報(bào)道主要集中在模式植物中，如擬南芥、水稻、玉米等，有關(guān)馬尾松NAC家族基因功能的研究和報(bào)道較少。本研究從馬尾松中克隆了PmNAC8，將其編碼的氨基酸序列與其他物種NAC進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果表明，PmNAC8蛋白具有NAC轉(zhuǎn)錄因子家族典型的NAM結(jié)構(gòu)域，N端具有150 bp組成的高度保守序列，C端具有高度特異性。另外，蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)是其整個(gè)空間結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)，在蛋白質(zhì)折疊過(guò)程的早期形成，為蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的形成奠定基礎(chǔ)，對(duì)亞細(xì)胞定位有一定作用［34］，預(yù)測(cè)PmNAC8蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)主要以無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)為主，這與大多數(shù)NAC蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)相似。系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果表明其編碼的蛋白與火炬松、北美云杉高度同源。對(duì)PmNAC8蛋白結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，其為親水性蛋白，且不存在信號(hào)肽，與大多數(shù)植物NAC蛋白相似［35］。亞細(xì)胞定位結(jié)果表明，PmNAC8定位于細(xì)胞核，屬于典型的核蛋白，表明PmNAC8可能在細(xì)胞核中發(fā)揮重要功能。

探究PmNAC8基因密碼子偏好性，可以揭示其基因的密碼子組成特性，為深入研究PmNAC8的功能提供依據(jù)。本研究利用生物信息學(xué)的方法對(duì)PmNAC8的密碼子偏好性進(jìn)行分析，結(jié)果表明，該基因有29個(gè)密碼子的RSCU值大于1，其中23個(gè)密碼子是以A/T結(jié)尾，且該基因GC含量和GC3s值分別為31.10%和42.50%，這一結(jié)果均符合馬尾松基因總體上偏好第3位堿基為A/T密碼子的特征［36］。煙草、擬南芥、歐洲山楊等模式植物常用于基因功能的探究，大腸桿菌常作為基因的原核表達(dá)系統(tǒng)受體，而酵母菌常被用于真核系統(tǒng)受體，由于馬尾松轉(zhuǎn)基因平臺(tái)尚未構(gòu)建成功，因此，需要借助相應(yīng)遺傳轉(zhuǎn)化體系進(jìn)行異源表達(dá)。在異源表達(dá)過(guò)程中，為實(shí)現(xiàn)外源基因的成功表達(dá)并提高其表達(dá)量，應(yīng)盡量選擇密碼子使用偏好性差異較小的作為受體，本研究通過(guò)比較PmNAC8與擬南芥、煙草、歐洲山楊、釀酒酵母、大腸桿菌的基因組密碼子使用頻率的差異，發(fā)現(xiàn)酵母真核表達(dá)系統(tǒng)更適合作為PmNAC8基因的表達(dá)系統(tǒng)，而煙草相較于擬南芥和歐洲山楊更適合作為PmNAC8的異源表達(dá)受體。

本研究對(duì)馬尾松PmNAC8進(jìn)行qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，該基因在植物不同組織中均有表達(dá)，但在根中的表達(dá)水平明顯高于其他組織，其次是老莖和幼莖。同時(shí)，PmNAC8受損傷及植物激素GA、ABA的誘導(dǎo)表達(dá)，推測(cè)該基因可能參與植物非生物脅迫和激素的應(yīng)答調(diào)控。啟動(dòng)子影響外源基因的表達(dá)水平，是基因工程表達(dá)載體的一個(gè)重要元件，對(duì)基因的調(diào)控具有重要意義［37］。如水稻Os08PTS啟動(dòng)子序列能夠調(diào)控Os08PTS基因在水稻莖和種子胚中表達(dá)，驅(qū)動(dòng)下游基因轉(zhuǎn)錄［38］；谷子膜結(jié)合NAC家族基因SiNAC啟動(dòng)子參與生長(zhǎng)素、甲基茉莉酸和氧化脅迫應(yīng)答［39］等。本研究以馬尾松為材料經(jīng)染色體步移法克隆了馬尾松PmNAC8啟動(dòng)子，長(zhǎng)度為1 492 bp。序列分析發(fā)現(xiàn)PmNAC8-Pro啟動(dòng)子序列中包括多種光響應(yīng)元件、生物脅迫響應(yīng)元件及植物激素相關(guān)響應(yīng)元件，如赤霉素（GA）響應(yīng)元件，且序列分析結(jié)果與qRT-PCR結(jié)果一致，推測(cè)PmNAC8可能受到非生物脅迫和激素等的誘導(dǎo)響應(yīng)。

4 結(jié)論

從馬尾松中克隆出一個(gè)新的NAC基因PmNAC8，全長(zhǎng)1 726 bp，編碼402個(gè)氨基酸，其編碼蛋白質(zhì)分子量為45 042.82 Da，等電點(diǎn)為5.11，屬于親水性蛋白，且不存在信號(hào)肽，有明顯的NAM結(jié)構(gòu)域，屬于典型的NAC轉(zhuǎn)錄因子家族成員；密碼子使用偏性較弱，偏好使用A/T結(jié)尾的密碼子；酵母真核表達(dá)系統(tǒng)較大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)更適合PmNAC8異源表達(dá)，模式植物煙草較擬南芥和歐洲山楊更適合做PmNAC8的遺傳轉(zhuǎn)化受體。該蛋白定位在細(xì)胞核內(nèi)，與火炬松、北美云杉同源性較高；PmNAC8在植物不同組織中均有表達(dá)，可能參與植物非生物脅迫和激素的應(yīng)答調(diào)控。