玉米秸稈高效降解微生物復合菌系的構建及降解效果評價

王新光 田磊 王恩澤 鐘成 田春杰

（1.天津科技大學生物工程學院，天津 300457；2.中國科學院東北地理與農業生態研究所 黑土區農業生態重點實驗室，長春 130102）

我國是世界農業大國，以秸稈為代表的農業廢棄物產量十分豐富，尤其是玉米秸稈。據統計，2014-2018年我國秸稈年均產量約為65 386.6萬t，其中玉米秸稈占總秸稈產量的45%左右［1］。玉米秸稈中含有多種營養元素，包括C、N、P、K和微量元素等，是重要的生物質資源［2］，如果加以合理高效利用，則會避免出現焚燒而導致的環境污染問題。早在2017年，黨的十九大報告提出了鄉村建設的發展方向，其中最關鍵的就是農業廢棄物的無害化、資源化利用［3］。因此，研究如何高效利用玉米秸稈是十分必要的。

玉米秸稈是典型的纖維素類物質，目前采用物理和化學的方法處理纖維素類物質存在成本高和污染環境等問題，而生物降解法相對于其它處理手段具有成本低、無污染等優點，是降解纖維素物質的重要手段［4-5］。近年來，利用微生物降解秸稈成為國內外研究的熱點，主要關注玉米秸稈和水稻秸稈的降解。蘇玉春等［6］從長白山腐殖土樣品中篩選出一株毛頭鬼傘菌（Coprinus comatus），其纖維素酶活為3.57 U/mL，28℃條件下發酵玉米秸稈，15 d后玉米秸稈失重率達到23.65%，其中纖維素降解率為17.06%。真菌降解纖維素能力強，但相對于細菌來說生長緩慢，纖維素酶耐熱性和耐堿性差，實際應用中限制因素多［7-8］。Olowomofe等［9］從土壤中分離出一株密歇根克雷伯氏菌（Klebsiella michiganensis），通過條件優化發現其在pH 7條件下培養后，纖維素酶活可達35.6 U/mL。以往的研究大多是利用分離得到的單菌降解秸稈，獲得的單菌酶活較低，產生的酶系較單一，導致秸稈不能被高效降解［10］。

復合菌系處理秸稈被認為是一種穩定高效的降解手段，它主要是依靠不同菌株之間的協同作用來發揮更強的秸稈降解能力［11-12］。Sui等［13］將纖維素降解菌N05、N13和N21組合成復合菌群，在30℃的條件下培養5 d后酶活達到最大值為6.07 U/mL，與單菌相比酶活提高了2倍。崔鴻亮等［14］將蠟狀芽孢桿菌（Baccillus cereus）、解淀粉芽孢桿菌（B.amyloliquefaciens）、地衣芽孢桿菌（B.licheniformis）和中間蒼白桿菌（Ochrobactrum intermedium）組合構建成復合菌群，在30℃條件下培養8 d后水稻秸稈的降解率達到73.3%，比蠟狀芽孢桿菌單菌的降解能力提高了22.4%。顯然，復合菌系纖維素酶活及對秸稈的降解能力均優于單菌，構建高效復合菌系對提高秸稈的降解率具有積極作用。

目前復合菌劑因其高效的降解能力備受關注，但對于細菌組合構建的復合菌系的研究報道比較少［15-17］。尤其對于細菌和放線菌組合構建的復合菌系發酵體系優化研究相對不足。鏈霉菌作為一種最高等的放線菌，常被用于制備抗生素，但鏈霉菌也具有較強的降解秸稈的能力。有研究報道，通過高通量測序的方法對降解秸稈細菌群落中主要降解菌進行分析發現，鏈霉菌是降解秸稈的主要降解菌［18］。因此，本研究將芽孢桿菌屬與鏈霉菌屬組合構建玉米秸稈高效降解復合菌系，為秸稈資源化利用提供菌種資源，并對其進行發酵條件及培養基的優化，對高效發揮微生物功能及玉米秸稈降解復合菌劑的開發制備具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 玉米秸稈及降解菌株 玉米秸稈來自中國科學院東北地理與農業生態研究所玉米試驗田，切割粉碎至2-5 cm的小段；秸稈降解菌株為：枯草芽孢桿菌WF-8（Bacillus subtilis WF-8）、地衣芽孢桿菌 WF-11（B.lincheniformis WF-11）、蠟 狀 芽 孢 桿菌WS-1（B.cereus WS-1）、和黑胡桃鏈霉菌WF-10（Streptomyces nogalater WF-10）由中國科學院東北地理與農業生態研究所土壤與微生物養分循環學科組提供。

1.1.2 培養基 LB（Luria-bertani）液體培養基：胰蛋白胨10.0 g，酵母粉5.0 g，NaCl 5.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH調節至7.0。

ISP2（International Streptoyces Project 2） 液 體培養基：酵母粉4 g，麥芽浸出物10 g，碳酸鈣2 g，葡萄糖4 g，蒸餾水1 000 mL。

液態發酵培養基/發酵產酶培養基：玉米秸稈粉 15 g，NaCl 0.1 g，KH2PO41.0 g，NaNO32.5 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，CaCl20.1 g，FeCl30.01 g，蒸餾水1 000 mL。

無 機 鹽 培 養 基：KH2PO41.0 g，NaCl 0.1 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，NaNO32.5 g，CaCl20.1 g，FeCl30.01 g，蒸餾水1 000 mL。

1.2 方法

1.2.1 單菌纖維素酶活的測定 將4株活化后的菌株分別接種到發酵產酶培養基，于28℃ 200 r/min條件下振蕩培養，每隔24 h取一次樣，8 000 r/min離心5 min，上清液即為粗酶液。

CMCase酶活（羧甲基纖維素酶活性）和FPA酶活（濾紙酶活性）采用DNS法［19］測定。

酶活力定義：在50℃的反應條件下，1 mL粗酶液1 min內反應生成1 μmol葡萄糖所需的酶量為1 U/mL。

1.2.2 復合菌系的構建及確定最佳組合 將4種單菌株分別接種到LB液體培養基和ISP2液體培養基，28℃ 200 r/min條件下恒溫搖床振蕩培養24 h，4株菌通過等比例組合進行復配試驗，并將復合菌OD600調至約108CFU/mL。構建的復合菌系如表1所示。

表1 不同菌種組合的復合菌系Table 1 Microbial consortiums formed by the combination of different strains

將4組復合菌系以4%比例分別接種至發酵產酶培養基，于28℃ 200 r/min條件下振蕩培養，每隔24 h取一次樣，8 000 r/min條件下離心5 min，然后取上清測定CMCase酶活和FPA酶活（方法同1.2.1）。

1.2.3 單因素及正交試驗優化培養基 在發酵產酶培養基的基礎上，以CMCase酶活為優化指標，對不同碳源（CMC-Na、秸稈粉、微晶纖維素、蔗糖、淀粉）、碳源添加量（5、7.5、10、12.5、15 g/L）、氮源（蛋白胨、硫酸銨、硝酸銨、酵母粉、尿素）和氮源添加量（1、2、3、4、5 g/L）進行單因素優化試驗。將復合菌系按4%的接種量接入不同因素水平下的發酵產酶培養基，28℃ 200 r/min振蕩培養5 d，實驗設置3個重復。以單因素試驗優化結果設置4因素4水平的正交試驗L16（45）（表2），以CMCase酶活為優化指標，最終確定最優培養基配方。

表2 碳氮源正交試驗表Table 2 Orthogonal test table for carbon and nitrogen sources

1.2.4 單因素及響應面試驗優化發酵產酶條件 以CMCase酶活為優化指標，對不同培養時間（1、2、3、4、5、6、7、8 d）、培養溫度（25、30、35、4℃、45℃）、接種量（1%、2%、3%、4%、5%、6%）和初始pH（4、5、6、7、8、9、10）進行產酶條件優化試驗。實驗設置3個重復。

以單因素試驗優化后的最佳培養條件為中心點，利用Design Expert 8.0.6軟件中的Box-Benhnken模型，以CMCase酶活為響應值，對發酵時間、發酵溫度、接種量及初始pH四個影響因素進一步優化，設計四因素三水平的響應面試驗（表3）。

表3 響應面試驗因素及水平Table 3 Factors and levels of response surface experiments

1.2.5 復合降解菌系發酵試驗及秸稈降解效果評價 為了驗證構建的復合菌系的高效性和實際應用性，對構建的復合菌系進行液態發酵和固態發酵試驗［20］。

液態發酵試驗：取5 mL復合菌液接種到優化后的液態發酵培養基中，以不接菌液的培養基作為對照，在最優發酵條件下培養10 d后，離心棄上清，加稀酸溶液反復沖洗秸稈，然后再用蒸餾水沖洗，離心后采用失重法測定秸稈的相對降解率。

固態發酵試驗：按照1.2.2中最佳復合菌系組合進行單菌復配，取5 mL混菌接入優化后的固態發酵培養基中，以不接菌液的培養基作為對照，在35℃的培養箱中進行固態發酵，每3 d搖勻一次。30 d后將秸稈取出，加稀酸溶液反復沖洗秸稈，然后再用蒸餾水沖洗，離心后采用失重法測定秸稈的相對降解率。

1.2.6 實驗設計與數據統計分析 采用Origin 2019b繪圖軟件進行繪圖，利用SPSS26進行正交試驗數據分析，利用Design-Expert 8.0.6軟件進行響應面試驗數據分析，每組試驗均做3次重復。

2 結果

2.1 復合菌系的構建篩選

將構建的復合菌系以及單菌接種到產酶培養基中28℃振蕩培養，每24 h測定一次酶活。以纖維素酶活為指標，通過測定比較單菌與復合菌系的CMCase酶活和FPA酶活來篩選構建高效復合菌系。結果如圖1和圖2所示，單菌以及復合菌系的纖維素酶活基本上都是呈先升高后降低的趨勢，4株單菌中WF11表現出較高的纖維素酶活，在第6 天達到最大，高于其它單菌；4組復合菌系都在第6天的時候酶活均達到最大，其中復合菌系HD產酶活性最高，CMCase酶活達到86.53 U/mL，FPA酶活達到22.03 U/mL，均顯著高于單菌酶活。

圖1 單菌和復合菌系的CMCase酶活Fig.1 CMCase activity of a single bacterial strain and microbial consortiums

圖2 單菌和復合菌系的濾紙酶活Fig.2 FPA enzyme activity of a single bacterial strain and microbial consortiums

2.2 單因素試驗篩選碳、氮源種類及其添加量

以CMCase酶活值為評價指標，通過混菌發酵對不同碳源、氮源及其添加量進行單因素實驗優化，結果如表4和表5所示。復合菌系HD酶活隨碳源種類及添加量的不同變化較大，以秸稈粉為碳源時，酶活較高，添加量為15 g/L時酶活最高；以蔗糖為碳源時，酶活較低，添加量為5 g/L時酶活最低。氮源種類及其添加量對酶活影響較大，硫酸銨更有利于復合菌系發酵產酶，添加量為4 g/L時酶活最高；以尿素為氮源時最不利于復合菌系發酵產酶，添加量為5 g/L時酶活最低。

表4 不同碳源及其添加量對復合菌系HD纖維素酶活的影響Table 4 Effects of different carbon sources and contents on the cellulose produced by microbial consortium HD

表5 不同氮源及其添加量對復合菌系HD纖維素酶活的影響Table 5 Effects of different nitrogen sources and contents on the cellulose produced by microbial consortium HD

2.3 正交試驗優化培養基成分

根據單因素試驗結果，綜合考慮后去掉蔗糖、尿素、碳源添加量7.5 g/L和氮源添加量2 g/L，對碳源、氮源、碳源添加量和氮源添加量設計4因素4水平的正交試驗，優化結果及方差分析結果如表6和表7所示。4個因素對復合菌系發酵產纖維素酶活性的影響從高到低為A-碳源＞D-氮源添加量＞B-氮源＞C-碳源添加量，最優培養基組合為A4B3C4D3。綜上所述，復合菌系HD的最優培養基為：秸稈粉15 g，（NH4）2SO44 g，KH2PO41.0 g，NaCl 0.1 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，CaCl20.1 g，FeCl30.01 g， 蒸餾水1000 mL。進一步對最優培養基配方進行驗證，結果顯示復合菌系在最優發酵產酶培養基中發酵5 d后的纖維素酶活為98.63 U/mL，比未優化的培養基提高了1.46倍。

表6 正交試驗結果Table 6 Results of orthogonal experiment

表7 單因素方差分析結果Table 7 One-way ANOVA results

2.4 單因素試驗考察發酵條件對復合菌系產纖維素酶活性的影響

通過單因素試驗考察溫度、接種量、時間和初始pH對復合菌系HD產纖維素酶活性的影響，結果如圖3所示。由圖3-a可以看出，發酵溫度為35℃時復合菌系產生的CMCase酶活及FPA酶活性最高，分別達到146.38 U/mL和28.70 U/mL，45℃時所產生的FPA酶活性高于25℃，表現出一定的耐熱性。在最適溫度范圍內微生物酶促反應速度最大，酶活性最高，高于或低于最適溫度均會抑制微生物代謝活動［21］。

由圖3-b可以看出，FPA酶活隨接種量的增大呈先升高后降低的趨勢，CMCase酶活隨接種量的增大出現兩個峰值，當接種量為5%時，FPA酶活與CMCase酶活均達到最大值，分別為16.36 U/mL和155.23 U/mL。

由圖3-c可以看出，發酵6 d后纖維素酶活達到最大值，FPA酶活和CMCase酶活分別為16.97 U/mL和53.29 U/mL，纖維素酶活隨著發酵時間的繼續延長呈下降趨勢。

由圖3-d可以看出，pH為7時，FPA酶活和CMCase酶活達到最大值，分別為22.65 U/mL和111.82 U/mL，纖維素酶活隨著pH的增大逐漸降低。pH值的改變會影響酶活性中心的某些基團的解離程度，并且還會影響底物的解離程度，從而影響纖維素酶與底物的結合［22］。

圖3 環境因素對復合菌系D產纖維素酶的影響Fig.3 Effects of environmental factors on the cellulose production of microbial consortium D

2.5 響應面試驗優化復合菌系發酵條件

2.5.1 響應面模型的構建及方差分析 根據表3設計的因素和水平編碼表，以溫度（A）、接種量（B）、時間（C）和初始pH（D）為自變量，以CMCase酶活為響應值，利用Design-Expert 8.0軟件中的Box-Benhnken中心組合設計29組實驗，將實驗數據進行多元回歸方程擬合后得到的二次回歸方程預測模型如下：

對所得到的回歸方程預測模型進行方差分析及顯著性檢驗，如表8所示，可以看出模型F=14.64，P＜0.000 1，回歸模型達到極顯著，并且模型的失擬項P=0.785 9＞0.05，表現為不顯著，模型的決定系數R2=95.14%，說明此模型擬合度高，能夠很好的分析預測復合菌系發酵產纖維素酶的最優發酵條件。另外，根據表9中各因素的F值和P值的大小可以得出它們對復合菌系產纖維素酶活性的影響順序為：溫度（A）＞時間（C）＞pH（D）＞接種量（B）。

表9 回歸模型方差分析Table 9 Variance analysis of the regression equations

2.5.2 變量交互作用的顯著程度 響應面曲線圖可以直觀地反映出任意兩個變量的交互作用對響應值的影響，根據表8繪制響應面曲線圖（圖4），以進一步分析篩選復合菌系最優發酵條件。由圖4-a-c可知，當溫度保持不變時，CMCase酶活值隨著時間的增加而增加，隨著接種比例和pH的增加均表現為先增加后降低的趨勢，而其它因素保持不變時，隨著溫度的升高，纖維素酶活先增加后降低。結合曲面的傾斜程度以及方差分析結果可以看出，溫度與時間之間的交互作用對酶活的影響顯著，而溫度與接種比例、溫度與pH之間的交互作用對酶活的影響不顯著。

表8 響應面試驗結果Table 8 Results of response surface experiments

同理，由圖4-d-f可知，CMCase酶活值隨著接種比例的增加呈先增加后小幅度降低的趨勢，隨時間的增加而增加。當pH保持不變時，酶活隨接種比例的增加先增加后降低，隨時間的增加呈小幅度的增加后緩慢降低，當接種比例與時間保持不變時，酶活隨pH的增加均表現為先增加后降低的趨勢。相對于圖4-e和圖4-f，圖4-d傾斜度較高，同時結合方差分析結果可以看出，接種比例與時間之間的交互作用對酶活的影響顯著，而pH與接種比例、時間與pH之間的交互作用對酶活的影響不顯著。

圖4 各因素交互作用的響應面圖Fig.4 Response surface diagram of the interactions among various factors

2.6 復合菌系最佳發酵條件的確定及模型驗證試驗

由各因素交互作用的響應面曲線圖可以看出此響應面存在最大值，通過Design-Expert 8.0軟件進行分析，得到復合菌系HD最優發酵條件為：溫度33.98℃、接種量4.93%、時間6.37 d和pH 7.17，在此條件下培養復合菌系，可以得到最大纖維素酶活的預測值為167.31 U/mL。考慮到實際操作的條件，將最優發酵條件調整為：溫度34℃、接種量5%、時間6 d和pH7.2。在此條件下進行驗證實驗，測得纖維素酶活實際值為164.21 U/mL，與優化前（圖1）相比，提高到原來的1.90倍。實際值和預測值相差很小，說明該模型擬合度高，并且準確可靠。

2.7 復合菌系降解玉米秸稈的效果評價

為了明確構建的復合菌系HD對玉米秸稈降解的有效性，進行了為期7 d的液態發酵實驗，并且考慮到實際應用，同時也進行為期15 d的固態發酵實驗，采用失重法考察復合菌劑HD對玉米秸稈的降解效率，結果如圖5所示。復合菌劑HD處理過的秸稈降解率顯著高于單菌處理過的秸稈。液態發酵實驗中，混菌HD處理過的秸稈降解率為47%，相對于對照組提高了35%，相較于單菌W1、W8、W10和W11分別提高了21.67%、18.33%、7.33%和12.67%；固體發酵實驗中，混菌HD處理過的秸稈降解率為63.6%，相對于對照提高了56.6%，相較于單菌W1、W8、W10和W11分別提高了44.1%、35.5%、9.3%和6.6%。以上結果表明，復合菌劑HD對秸稈有明顯的降解效果。

圖5 玉米秸稈液態和固態發酵結果Fig.5 Results of liquid and solid fermentation of corn straw

3 討論

當前，全球環境治理面臨挑戰，我國作為農業大國，秸稈資源化利用勢在必行［23-24］。其中生物法處理秸稈是一項重要的舉措。由于單一菌株酶活性較弱、降解效率低等問題，高效降解纖維素復合菌系的構建在秸稈資源化利用中就顯得尤為重要。

復合菌系的構建是一個復雜的過程，培養基成分以及發酵條件的優化是構建復合菌系發酵體系不可或缺的一部分［25-26］。目前微生物產酶培養基和發酵條件的優化大多數采用單因素實驗結合正交試驗或響應面實驗，可以快速準確地得到優化條件。馮紅梅等［27］從堆肥中篩選出6株纖維素降解菌，通過復配制成復合菌系M-1，發酵條件優化后纖維素酶活最高可達135.9 U/mL，產酶能力提高了1.8倍。菌種來源的選擇對于復合菌系的構建也是一個重要的條件。Li等［28］從腐爛的玉米秸稈中篩選出纖維素降解菌并構建復合菌ADS3應用于秸稈還田，7 d后纖維素酶活高達252.8 U/mL，對秸稈降解作用明顯。崔宗均等［29］從堆肥中篩選出4組混菌，經過混合培養成1組高效纖維素降解菌群，培養1 d后纖維素酶活最大，達到122.3 U/mL，對纖維素類物質具有較強的分解能力。本試驗將來源于長期秸稈還田的土壤及堆肥中的4株菌組合構建出高效復合菌系HD，對其培養基及發酵條件進行優化后，纖維素酶活高達164.21 U/mL，顯著高于優化前酶活，在以上研究中處于中等水平。顯然，培養基成分及發酵條件的優化對于微生物酶活性的提高依舊是一種有效的手段。

溫度是影響微生物的重要因素［30-31］。Qing等［32］成功構建了適應低溫的玉米秸稈降解菌群GF-20，在10℃條件下發酵15 d后玉米秸稈降解率為32%。薩如拉等［33］構建了1號和8號兩組復合菌系，在15℃條件下培養，15 d后玉米秸稈降解率分別達到30.21%和32.21%。而本研究構建的復合菌系HD在35℃時酶活性最大，具有一定的耐高溫性能，可以用作秸稈堆肥微生物降解菌劑，提高其產品附加值。復合菌系HD在35℃的條件下，經過液態發酵和固態發酵后，對玉米秸稈的降解率分別為47%和63.6%，相對于上述研究，降解效果較好。在發酵過程中，纖維素酶不僅是產物，也是纖維素水解的催化劑，除了溫度外，溶氧量和pH對于微生物發酵產纖維素酶也極為重要。溶氧量的大小取決于接種量的多少，接種量過大時，微生物生長過快，發酵體系溶氧不足，導致微生物活性和產酶速度降低；接種量過少，微生物生長緩慢，產酶速度同樣會下降［34］。本實驗中復合菌系在5%接種量的條件下酶活最高，顯著高于1%接種量和6%接種量條件下的酶活。pH是微生物發酵產酶過程中一個重要的控制因素，很早就有學者通過優化pH來提高纖維素酶活［35-36］。有研究表明，pH的大小會影響纖維素酶活性部位上相關基團的解離，在最適pH的條件下，活性部位上的解離程度最適合酶與底物結合發揮作用，高于會低于最適pH都會降低纖維素酶的分解能力［37］。另外，耿冰等［38］通過研究pH對綠色木霉（Trichoderma viride）發酵產纖維素酶活的影響發現，纖維素酶活發生變化的一個重要原因就是pH改變了纖維素酶的構象。本研究中復合菌系HD最適pH值為7，當pH增大或減小時，纖維素酶活明顯降低。并且在不同營養成分條件下纖維素酶最適pH也不同。楊振德等［39］對蒼白桿菌屬進行初始pH條件優化，以酵母膏為氮源，pH為6時纖維素酶活性最高，而以酒石酸銨為氮源，pH為7時纖維素酶活最高。由此可見，優化發酵條件前先優化培養基成分是提高纖維素酶活的一種比較合適的方式。

綜上所述，復合菌系HD具有較強的玉米秸稈降解能力，這對高效降解秸稈復合菌劑的研制開發具有一定的指導意義，但在構建的過程中尚未探究微生物之間的協同機制，下一步將對4株菌之間的相互作用機制進行研究，研制和開發高效玉米秸稈降解復合菌劑，并加以推廣應用。

4 結論

通過對4株玉米秸稈降解菌之間相互組合構建了不同復合菌系，以纖維素酶活指標，確定了最佳復合菌系HD。優化后的復合菌系產纖維素酶活為164.21 U/mL，是優化前的1.9倍。復合菌系HD處理過的玉米秸稈降解率分別達到了47%和63.6%，顯著高于對照組和單菌。研究結果表明復合菌系HD具有較強的產纖維素酶和降解秸稈能力。