長枝木霉菌肥對玉米生長、土壤肥力和根際微生物的影響

祝靜 于存

（貴州大學林學院，貴陽 550025）

玉米（Zea mays L.）是世界上第一大糧食作物，富含蛋白質、維生素等多種營養物質。目前施用化肥是提高玉米生長和產量的主要方式，但長期施用化學肥料會降低土壤的理化性質，導致土壤養分含量不平衡，嚴重影響土壤環境［1］。隨著微生物技術的不斷突破，傳統的化肥極有可能被微生物菌肥所代替，因為微生物菌肥對植物的生長發育、抗逆性等起到積極的作用，同時可以有效避免化學肥料應用后產生的一系列弊端［2］。以往已有多個關于利用微生物菌肥促進玉米生長的報道，但由于應用環境條件的差異，使其應用效果不理想［3-5］。因此，針對玉米開發高效的微生物菌肥，可以減少玉米栽培過程中無機化肥的用量，對玉米生物菌肥的開發和應用具有重要意義。

木霉（Trichoderma spp.）是一類廣泛分布于自然界中的絲狀菌物，木霉作為植物病害的生防菌已被人們所熟知［6］。此外，木霉還可以通過產生揮發性因子和生長素等類似物促進植物的生長、促進植物根系發育和提高作物產量。木霉憑借其生長速度快、無污染、對人畜無毒害等優點，在農業上被作為一種具有重要開發價值的微生物資源。微生物肥料作為一種新型肥料，既能發揮促生和抗病功能還能避免化肥和農藥長期使用的一系列弊端［7］。以往有人通過將木霉制作為微生物肥料后作用于植物，以發揮其促生、抗病的功能。例如有研究利用哈茨木霉（T.harzianum）菌肥進行白菜（Brassica pekinensis L.）的增產試驗，發現與傳統的肥料相比，木霉菌肥處理具有操作簡單且促生效果顯著的優點［8］。

菌株1-cg-18是由閩楠（Phoebe bourne（Hemsl.）Yang）體內分離獲得的一株具有較強溶磷、解鉀、產IAA能力，同時還具有明顯抗病效果的長枝木霉（T.longibrachiatum）［9］。前期研究中我們發現菌株1-cg-18菌液對玉米體現出了較好的促生效果。在此基礎上，本研究通過檢測長枝木霉菌肥對玉米幼苗生長、生理、土壤養分、土壤酶活性和根際土微生物群落的影響，揭示長枝木霉菌肥對玉米提質增效的效果及其作用機制，為玉米微生物肥料的開發和應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗所用土壤購買于什邡市綠源美家農業科技有限公司，其理化性質如下（pH 7.40、有機質含量399 g/kg、全氮7.76×104mg/kg，全磷含量0.09 g/kg，全鉀為360 mg/kg），土壤經121℃高溫高壓滅菌60 min后備用。玉米種子采用惠玉788，購買自貴州友禾種業有限公司。長枝木霉（T.longibrachiatum 1-cg-18）菌種由貴州大學森林保護學科實驗室提供，GenBank號為MK284517.1，PDA斜面菌種現保藏于該實驗室4℃冰箱，所用化學肥料為尿素（含氮N：46%）。供試菌肥是按每克菌肥固態基質（酒糟∶麥麩=3∶7）添加1.0 mL蒸餾水，于121℃滅菌60 min后，每克菌肥固態基質接入0.3 mL的長枝木霉（106CFU/mL）菌液，于28℃恒溫培養箱中培養7 d后獲得長枝木霉菌肥，菌肥的孢子濃度為1010CFU/g。

1.2 方法

1.2.1 試驗設計 采用盆栽試驗，共設置3個處理：（1）每克土加入0.01 g菌肥（YJ）；（2）0.07%化肥（YF）；（3）每克土加入0.01 g菌肥基質（YD）。選取籽粒飽滿、大小均勻的玉米種子用5%的NaClO溶液進行種子消毒10 min后，用無菌水洗滌3-5次，每穴盆撒入5粒玉米種子（播種穴盆為上口12.5 cm、下口9 cm、高10 cm），每個處理設60盆苗，于2020年5月在貴州大學林學院溫室內進行常規管理。通過肉眼觀察各處理玉米高度上出現明顯差異后，檢測不同處理玉米的各項生長、生理、根際土養分、根際土酶活和根際土微生物群落。

1.2.2 指標測定 玉米生長指標測定：不同處理玉米高度上產生明顯差異后（40 d），每個處理隨機選取不同處理組的10株幼苗利用直尺測定其苗高、根長；采用稱重法測定玉米的鮮重和干重，其中干重是將玉米幼苗在105℃下烘干30 min，65℃烘干至恒量用電子天平稱量。

玉米生理指標測定：在不同處理玉米40 d后，隨機選取不同處理40株幼苗的葉片和根系，利用丙酮提取法測定葉片的葉綠素含量；采用考馬斯亮藍G-250法、蒽酮法測定玉米的可溶性蛋白和可溶性糖含量［10］；利用TTC法測定玉米的根系活力［11］；分別采用愈創木酚法、NBT還原法和高錳酸鉀滴定容量法測定玉米的過氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化氫酶（CAT）活性［12］。生理指標測定至少3個重復。

玉米根際土養分含量和土壤酶活性測定：隨機選取不同處理30株玉米幼苗，取出根系后輕輕抖落根系附著的外圍土壤，然后用無菌毛刷刷下靠近根系4 mm范圍內的土壤，將同一處理下10株幼苗根系土壤進行混合后作為一個重復，用于玉米根際土壤養分、土壤酶活的測定。其中土壤N、P、K的測定方法參考《土壤農化分析》［13］、土壤酶活性的測定方法參考《土壤酶及其研究方法》的方法［14］。

玉米根際土壤微生物群落測定：每個處理隨機選取30株幼苗，每10株幼苗根際土作為1個重復。根際土收集方式同根際土養分和酶活性測定中收集方法。參考王元基［15］的方法對樣本的基因組DNA進行提取，以土壤細菌總DNA為模板，應用通 用 引 物 341F（5′-CCTACGGGNGGCWGCAG -3′）和 805R（5′-GACTACHVGGGTATCTAATCC -3′） 擴增16S rDNA的V3-V4區，擴增體系為25 μL；以土壤真菌總DNA為模板，應用引物ITS1F（5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′）和 ITS2R（5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′）擴增真菌ITS1區，擴增體系為25 μL。委托貴州為萊科技有限責任公司采用IlluminaPE250對玉米根際細菌和根際真菌進行雙端測序。其中真菌和細菌總DNA的PCR產物純化回收、定量以及測序文庫構建、文庫質檢等參考許來鵬等方法［16］。土壤微生物的生物信息學分析步驟如下：按照QIIME2 dada2分析流程，依次進行序列去噪、OTU聚類、物種分類。根據去噪和聚類結果，對每個序列做物種注釋，選用STAMP、MetaStat、LEfSe、Anosim和MRPP等統計分析方法對分組樣本的物種組成和群落結構進行差異顯著性檢驗。

2 結果

2.1 長枝木霉菌肥對玉米生長的影響

長枝木霉菌肥對玉米幼苗生長指標的影響見表1。與對照（YD）相比，菌肥（YJ）和化肥（YF）處理均利于玉米的生長，且差異顯著（P＜0.05）。其中，菌肥和化肥對玉米生長指標的影響差異不顯著，且均呈現菌肥處理比化肥處理更利于玉米生長。其中菌肥處理的苗高、根長分別比對照處理高出了44.65%和75.74%；而化肥處理的苗高和根長比對照處理高出了39.87%和71.25%。此外，由干重和鮮重等生長指標也能發現類似的規律，如菌肥和化肥可有效提升玉米干重和鮮重（P＜0.05），但菌肥與化肥處理對比，兩者對玉米地上干重和鮮重的影響差異不顯著（P＞0.05）。另外，由圖1也可直觀的發現，不同處理對玉米生長影響的差異性。綜合不同處理對玉米生長的影響，菌肥比化肥對玉米的促生作用更為明顯。

圖1 不同處理下玉米生長圖Fig.1 Real growth map of maize under different treatments

表1 長枝木霉菌肥對玉米生長的影響Table 1 Effect of T.longissima fertilizer on maize growth

2.2 長枝木霉菌肥對玉米幼苗生理的影響

長枝木霉菌肥對玉米幼苗生理的影響如圖2所示，與對照處理相比，菌肥和化肥處理均可提升玉米可溶性糖、可溶性蛋白、葉綠素含量、根系活力和3種保護酶活性，且均呈現菌肥處理效果優于化肥處理。菌肥和化肥對玉米生理指標影響中，除了可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、根系活力、地上CAT和POD的影響呈現差異顯著外（P＜0.05），其他指標二者之間均差異不顯著（P＞0.05）。其中，差異比較明顯的是玉米可溶性糖含量，與對照相比，菌肥處理比對照處理的地上和地下的可溶性糖含量分別高出了 431.25% 和369.27%（P＜0.01），而化肥處理與對照處理之間的可溶性糖含量差異不顯著（P＜0.05）。綜合以上玉米生理指標發現，長枝木霉菌肥可以發揮出比化肥對玉米生理指標更好的促進作用。

圖2 長枝木霉菌肥對玉米幼苗生理的影響Fig.2 Effects of T.longibrachiatum fertilizer on physiology of maize seedlings

2.3 長枝木霉菌肥對玉米根際土壤微環境的影響

2.3.1 長枝木霉菌肥對玉米根際土壤養分和根際土壤酶活性的影響 由表2可知，菌肥處理和化肥處理均可提高玉米根際土氮、磷、鉀的相對含量，二者與對照處理相比均差異顯著（P＜0.05）。此外，菌肥處理對玉米根際土養分含量的影響要優于化肥處理，但二者之間差異不顯著（P＞0.05）。其中菌肥和肥料對玉米根際土全磷、全鉀、有效磷、速效鉀、全氮和水解氮含量的提高幅度分別為38.04%和26.99%、29.81%和18.75%、52.60%和48.12%、14.21%和 8.74%、94.84%和 74.76%、24.00%和16.99%。

表2 長枝木霉菌肥對玉米根際土壤養分的影響Table 2 Effects of T.longibrachiatum fertilizer on soil nutrients in the rhizosphere of maize

由表3可知，菌肥和化肥處理對玉米根際土壤酶活性均有一定幅度的提高，但整體上菌肥處理對土壤酶活性的提高幅度要優于化肥處理。其中，菌肥處理對土壤脲酶和蔗糖酶的提高幅度更大，分別提高了37.04%和516.35%，而對磷酸酶的影響較小（P＞0.05）?；侍幚韮H對蔗糖酶的提高幅度較高（405.97%）（P＜0.05），而對脲酶和磷酸酶的提升幅度較小（P＞0.05）。

表3 長枝木霉菌肥對玉米根際土壤酶活性的影響Table 3 Effects of T.longibrachiatum fertilizer on enzyme activities in maize rhizosphere soil

2.3.2 菌肥對玉米根際土微生物群落的影響 菌肥處理對玉米根際土壤真菌和細菌數量的影響如圖3所示，不同處理下玉米根際土細菌OTU數量遠大于真菌的OTU數量。與對照處理相比，添加菌肥會減少土壤細菌OTU數量，但會增加土壤真菌OTU數量。添加肥料會增加根際土細菌OTU數量，但會減少真菌OTU數量。不同處理特有的細菌OTU數量排序為 YF（1 441個）＞YD（1 046個）＞YJ（981個）（圖3-A）。特有真菌OTU數量排序為YJ（163個）＞YD（112個）＞YF（109個）（圖3-B）。

圖3 不同處理下玉米土壤微生物OTU數量韋恩圖Fig.3 Wayne diagram of OTU number of maize soil microorganisms under different treatments

由表4可知，不同處理對細菌群落的Chao1豐富度指數、Shannon指數和ACE豐度指數影響的排序為：YF＞YD＞YJ。不同處理對土壤真菌群落的Chao1豐富度指數、Shannon指數和ACE豐度指數影響的排序為：YJ＞YD＞YF。以上結果表明，添加菌肥會增加根際土真菌多樣性和豐富度，降低細菌多樣性和豐富度；而添加化肥會增加細菌多樣性和豐富度，減少根際真菌多樣性和豐富度。

表4 各處理樣本的微生物多樣性指數Table 4 Microbial diversity index of each treatment sample

玉米幼苗根際土真菌和細菌門水平群落結構分析結果顯示：在門水平上，3個處理真菌群落共有93個門，其top 3優勢菌門分別是球囊菌門（Glomeromycota）、子囊菌門（Ascomycota）和擔子菌門（Basidiomycota）（圖4-A）。而細菌群落中共有112個門，其top 6優勢菌門分別是變形菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、厚壁菌門（Firmicutes）、放線菌門（Actinobacteria）、疣微菌門（Verrucomicrobia）和芽單胞菌門（Gemmatimonadetes），相對豐度均大于1%以上（圖4-B）。由Heatmap圖和柱狀圖綜合分析發現，在真菌門水平上，添加菌肥會使壺菌門（Chytridiomycota）和子囊菌門豐富度比例增加，但會使球囊菌門（Glomeromycota）和擔子菌門（Basidiomycota）豐富度比例減少。而添加化肥會使擔子菌門的相對豐度比例增加，但會降低子囊菌門和壺菌門（Chytridiomycota）的相對豐度（圖4-C）。在細菌門水平上，添加菌肥會使變形菌門、芽單胞菌門、疣微菌門（Verrucomicrobia）豐度比例增加，但會降低軟壁菌門（Tenericutes）和梭桿菌門（Fusobacteria）的相對豐度，而施加化肥會增加厚壁菌門和軟壁菌門的相對豐度（圖4-D）。

圖4 各樣本在門水平上的群落結構Fig.4 Community structure of each sample at phylum level

玉米幼苗根際土真菌屬水平群落結構分析結果顯示：在真菌屬水平上，3個處理共包含181個真菌屬，其中存在大量未經得到分類學注釋以及未能辨認出的物種，已注釋的物種主要為Trichocladium和Others，但二者在181個真菌屬中所占比例較?。▓D5-A）。由Heatmap圖可知，與YD和YF處理相比，施加菌肥可顯著增加曲霉屬（Aspergillus）、青霉屬（Penicillium）、木霉屬（Trichoderma）、靈芝屬（Ganoderma）、單端孢屬（Trichothecium）、古根菌屬（Archaeorhizomyces）等屬的豐富度；而施加化肥可顯著增加鬼傘屬（Coprinus）、毛殼屬（Chaetomium）、蛇形蟲草屬（Ophiocordyceps）的相對豐度。分析不同處理對木霉屬的影響，與對照處理相比，菌肥處理可以增加木霉屬的相對豐度，而化肥處理會減少木霉屬的相對豐度（圖5-C）。

玉米幼苗根際土細菌屬水平群落結構分析結果顯示：在細菌屬水平上，3個處理共有2 408個屬，其優勢屬分別是蒼白桿菌屬（Ochrobactrum）、黃單胞菌屬（Stenotrophomonas）、纖維弧菌屬（Cellvibrio）、德沃斯氏菌屬（Devosia）、鞘脂單胞菌屬（Sphingopyxis）和土地桿菌屬（Pedobacter）等22個屬（圖5-B）。由Heatmap圖可知，與肥料和對照相比，施加菌肥能顯著增加蒼白桿菌屬、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）和魏斯氏菌屬（Weissella）等屬的相對豐度，會顯著降低棒狀桿菌屬（Corynebacterium）和普氏菌屬（Prevotella）的相對豐度；而施加化肥可顯著增加芽孢桿菌（Bacillus）、乳桿菌屬（Lactobacillus）、噬氫菌屬（Hydrogenophaga）和德沃斯氏菌屬（Weissella）的相對豐度，但會降低梭菌屬（Clostridium）、鞘氨醇單胞菌屬和莖菌屬（Caulobacter）的相對豐度（圖5-D）。

圖5 各樣本在屬水平上的群落結構Fig.5 Community structure of each sample at genus level

使用FUNGuild預測不同處理屬水平上真菌群落的營養型和功能群，結果可被分為3個不同的營養型，分別為病原營養型、腐生營養型和共生營養型，3者所占比列分別為15.22%-26.25%、44.41%-70.00%和14.78%-28.94%（圖6-A）。其中，與對照和肥料處理相比，添加菌肥會增加腐生營養型的相對豐度，降低共生營養型和病原營養型的相對豐度。加肥料會增加腐生營養型相對豐度，降低共生營養型和病原營養型的相對豐度。利用PICRUSt 2軟件對不同處理玉米根際土壤屬水平的細菌進行初步的功能預測。由圖6-B可發現，3個處理內生細菌共包括氨基酸運輸和代謝能源生產和轉換、氨基酸轉運與代謝、翻譯、核糖體結構與生物發生、能源生產與轉換、碳水化合物運輸和代謝、細胞周期控制、細胞分裂及染色體分配等20類代謝通路。其中添加菌肥會提高能源生產與轉換、無機離子轉與代謝、脂質轉運與代謝等代謝活動，而添加化肥會增加防御機制、復制、重組和修復和碳水化合物運輸和代謝等代謝活動。

圖6 不同處理土壤微生物功能預測Fig.6 Function prediction of soil fungi in different treatments

RDA分析又叫冗余分析，其用來闡明微生物群落與環境因子之間的關系。將不同處理玉米根際細菌和真菌屬水平的種類與不同處理下土壤養分進行RDA分析，結果如圖7所示，在真菌群落水平上，兩主軸可以解釋為3個處理土壤真菌群落總變異的69.75%，其中TK、TN、TP、AK、AP和HN均與菌肥處理組呈正相關，與肥料組和對照組均呈負相關。在細菌群落水平上，兩主軸可以解釋為3個處理土壤細菌群落總變異的33.51%，其中TN、TK、TP、AK、AP和HN與菌肥處理組均呈正相關，肥料處理與AK、TN、AP和TP呈正相關，與HN和TK呈負相關。

圖7 玉米根際土壤微生物群落與土壤養分的RDA分析Fig.7 RDA analysis of soil microbial community and soil nutrients in maize rhizosphere

3 討論

本研究通過盆栽試驗檢測長枝木霉菌肥對玉米幼苗的促生作用，結果顯示，添加菌肥可以有效促進玉米的生長，并比化肥的促生效果更優。本研究中長枝木霉菌肥對玉米的促生效果顯著高于吳云艷［17］利用生物菌肥對玉米的促生效果。與化肥處理相比，長枝木霉菌肥對玉米的生理具有更積極的作用。比如，菌肥處理顯著提升了玉米根系活力，玉米根系活力的增加，可以菌增加根系對營養物質和水分的吸收，進而利于玉米的生長。同時，菌肥處理提高了玉米葉綠素含量，葉綠素含量的提升可有效促進植物光合作用的效率，這與郭成等［18］研究的長枝木霉可以提高玉米的光合作用結果相一致。此外，木霉菌肥處理提高了玉米可溶性糖和可溶性蛋白的含量，可溶性糖和可溶性蛋白的提升可以促進玉米體內脂肪、蛋白質等大分子物質合成，提高玉米細胞的保水能力。與楊春平等［19］研究綠色木霉L24處理可以提升玉米保護性酶活性的結果相似，本研究中木霉菌肥處理提升了玉米SOD、CAT、POD三種保護性酶活性。由此推斷長枝木霉菌肥在促進玉米生長的同時還可以激活玉米自身的防御系統而增加其對環境及生物脅迫的的抵御能力。

微生物菌肥能夠提高土壤透氣度，增強土壤肥沃程度，進而促進植物生長［20］。本研究結果表明，與對照和肥料相比，長枝木霉菌肥對土壤養分和土壤酶活性的積極作用更優。分析菌肥改善土壤養分的原因可能是菌肥的施入產生了有機酸等類似物質，進而活化了土壤中難溶性的營養物質。土壤酶是土壤物質循環和能量流動的重要組成部分，土壤酶活性的增加可以促進根際土壤的代謝活動，作為土壤肥力的指標之一。在本研究中菌肥加入可以提高玉米根際土壤酶活性，其原因可能與土壤肥力水平、微生物種類和數量的差異有關［21］。

微生物多樣性指數是評價微生物多樣性的有效方法，且與土壤生態系統的穩定性密切相關。本研究中，菌肥處理增加了玉米根際土壤真菌群落的豐富度和多樣性。而肥料處理增加了土壤細菌群落的多樣性及豐富度，其原因可能是肥料中氮素的吸收與利用導致土壤中氮素下降，對細菌微生物的脅迫作用減弱，使微生物的活動和繁殖增加，從而使細菌微生物含量增多［22］。在門水平上，添加菌肥提高了變形菌門和子囊菌門的相對豐度，變形菌門可有效促進植物對氮、磷、鉀元素的循環利用，利于玉米對土壤中的營養成分吸收利用，子囊菌門多為腐生真菌門，對降解土壤中有機質有重要作用。這與Pang等［23］運用長枝木霉處理番茄根系得到的結果相似。施加化肥會提高厚壁菌門和擔子菌門相對豐度，擔子菌門多為腐生菌門，可促進土壤物質循環，為土壤有益菌。在屬水平上，添加菌肥提高了木霉屬、曲霉屬和蒼白桿菌屬的相對豐度，其中曲霉屬和青霉屬具有較強的溶磷作用，從而使磷元素的轉化得到提高，提升土壤理化性質，是溶磷微生物的重要類群［24］?；实奶砑訒姑珰亠@著增加，毛殼菌屬以產生豐富的降解纖維素的酶和產生具有生理活性的次生代謝產物而著稱，能對多種植物的多種病害的病原菌產生抑制作用［25］。

本研究中，腐生營養型為不同處理屬水平上真菌群落的主要營養型，這可能與子囊菌門為優勢菌門有關，子囊菌門多為腐生菌，是土壤中重要的分解者，可以分解難降解的有機質，在養分循環方面起著重要作用［26］。與對照組和肥料組相比，添加菌肥土壤的病原營養型相對豐度顯著降低，病原營養型真菌主要從宿主獲取營養來源，易造成植物病害。說明長枝木霉菌肥益于植株生長的同時，更有益于降低植株病害的發生。本研究將細菌、真菌屬水平種類與土壤養分開展RDA分析，其中全鉀為真菌群落最主要的影響因素，有效磷為細菌群落最主要的影響因素，且所有土壤養分含量均與菌肥處理呈正相關，說明菌肥能有效提高土壤養分含量，且對土壤真菌、細菌群落具有積極的影響。另外本研究在接種了長枝木霉菌肥后的育苗盆土壤表面可以觀察到大量的綠色的木霉孢子的產生，同時由玉米根際土壤微生物群落的多樣性的研究結果可知，長枝木霉可以有效定殖于根際土壤中。另外，以往多個木霉對不同植物的作用結果顯示，大部分的木霉可以定殖于植物的根部［9，27］。由此，推測長枝木霉可以同時在玉米根際和根內發揮作用。綜上，長枝木霉菌肥對玉米根際微生物群落的影響可能也是提升玉米根際土壤養分、促進玉米生長的重要原因。

4 結論

長枝木霉菌肥與化肥相比對玉米有更好的促生效果。長枝木霉菌肥對玉米的促生機制主要包括對玉米生理活性的積極作用、改善土壤養分、提升土壤酶活性和影響根際微生物群落等。