桑黃素在脂多糖誘導的急性肺損傷中的相關機制

于 婧，馮丹丹，潘文森，*

(1．河北醫科大學第二醫院呼吸與危重癥醫學二科，河北 石家莊 050000；2．河北醫科大學基礎醫學院生物化學與分子生物研究室，河北石家莊 050017)

急性肺損傷(acute lung injury，ALI)是一種以高發病率、高致死率為特點的臨床常見危重癥疾病，主要由于多種致病因素導致肺泡上皮細胞和肺血管內皮細胞的損傷及過度炎癥，從而表現出急性呼吸窘迫和頑癥性低氧血癥等臨床特征。氧化應激是ALI 發病的關鍵因素之一， 煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH)氧化酶(NADPH oxidase，NOX) 根據細胞類型，可分為NADPH 氧 化 酶1(NADPH oxidase 1， NOX1)、NADPH氧化酶4(NADPH oxidase 4，NOX4)等[1]，它是正常和病理條件下血管細胞中細胞內活性氧(reactive oxygen species，ROS)的主要來源。有研究表明，ROS的增加可誘導促炎因子的產生和釋放，炎癥細胞通過浸潤肺組織引起炎癥細胞的聚集，進一步誘發氧化應激反應的發生[2-3]。因此，抑制ROS的產生，即抑制氧化應激反應的發生可能是減緩ALI 發生發展的有效策略。桑黃素(morin)是一種天然黃酮類化合物，具有抗炎、抗凋亡和抗氧化等多重藥理作用[4-5]。據報道[6]，桑黃素可以通過細胞抗氧化防御機制提供氧化應激保護，從而增加細胞或生物體階段的抗氧化活性。紅系衍生的核因子2 相關因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2)-血紅素加氧酶1(heme oxygenase-1，HO-1)是經典參與氧化應激的通路，當Nrf2被激活后，可與抗氧化基因啟動子結合并提高其表達，從而提高抗氧化系統的活性。HO-1 作為Nrf2 的下游抗氧化酶之一，能在抗炎及抗氧化應激中迅速作出反應，對組織損傷產生保護作用[7]。在目前針對急性肺損傷的研究中，關于桑黃素與氧化應激信號通路中蛋白的作用機制鮮見報道。因此本研究通過建立小鼠體內ALI 模型，探究桑黃素對氧化應激表達和ALI 的影響，以期為桑黃素的藥理學研究及急性肺損傷疾病的防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 動物雄性健康C57BL/6 小鼠32 只，8~10 周齡，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物生產許可證號SCXK(京)2016-0006。飼養于SPF 級環境中，環境溫度23~25 ℃，自由進食進水。所有實驗動物均受到人道對待，符合美國國立衛生研究院頒布的《實驗動物管理和使用指南》。動物實驗符合動物福利與實驗動物管理委員會相關規定，并通過動物實驗倫理審查，審查編號2022-AE250。

1.1.2 主要試劑和儀器桑黃素、 脂多糖(lipopolysaccharide， LPS)、 二 甲 基 亞 砜(methyl sulfoxide，DMSO)、細胞裂解液均購自美國Sigma 公司；NOX1 抗體、NOX4 抗體、Nrf2 抗體、HO-1 抗體和β-actin 抗體均購自美國Proteintech 公司；Total RNA 提取試劑盒(美國OMEGA 公司)；反轉錄試劑盒(美國Thermo Fisher 公司)；SYBR Green Mix 試 劑盒(美國Invitrogen公司)。

NanoDrop 2000超微量分光光度計(美國Thermo公司)；熒光實時定量PCR 儀、電泳儀及電泳槽(美國Bio-Rad 公司)；ECL 化學發光儀(法國Vilber Lourmat公司)；全自動酶標儀(美國Molecular Devices 公司)；CountessTM自動細胞計數儀(美國Invitrogen 公司)；組織脫水機、石蠟包埋機、輪轉式切片機、多功能顯微鏡(美國Leica公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 小鼠急性肺損傷模型的構建32只C57BL/6小鼠被隨機分成4 組即對照組(生理鹽水)、ALI 模型組(LPS 處理)、LPS+桑黃素低濃度(25 mg/kg)處理組和LPS+桑黃素高濃度(50 mg/kg)處理組，每組8只。處理劑量與方法參照文獻報道[8]。首先使用DMSO溶解桑黃素，配置好的桑黃素母液使用生理鹽水稀釋，對小鼠進行腹腔注射，對照組小鼠注射等量的DMSO 稀釋液，適應性給藥連續3 d，觀察小鼠狀態。第3天注射桑黃素后1 h，將小鼠麻醉經氣管滴注給予LPS(6 mg/kg)溶液，使藥液通過氣道進入肺中，直接刺激支氣管及肺組織，對照組小鼠經氣道滴入等體積生理鹽水。給藥處理后觀察小鼠狀態，待其穩定可正常活動后離開，24 h后，小鼠實施安樂死。肺組織置于離心管中作好組間標記并稱取質量，部分肺組織置于4%多聚甲醛固定進行形態學實驗，其余肺組織液氮保存備用。

1.2.2 小鼠肺組織濕/干質量比值測定剖取各組小鼠完整左肺，生理鹽水洗去多余血液，然后用濾紙吸干多余水分。稱取每只小鼠的左側肺組織濕質量，標記后，放入烘箱，烘干。取烘干肺組織再次稱質量，記錄每只小鼠左肺干質量。計算肺濕/干質量比值(W/D)，用來衡量小鼠肺組織的通透性情況。

1.2.3 切片制備及HE染色取出置于4%多聚甲醛中浸泡固定24 h以上的肺組織標本，經流水沖洗15 min后，置于包埋盒內按以下程序進行脫水、透明：70%、80%、90%、95%乙醇各5 min，無水乙醇Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各5 min，組織透明劑Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各10 min。取出標本后，浸蠟、包埋、切片、烤片。取出切片，按以下程序進行脫蠟：組織透明劑Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各10 min，無水乙醇Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各5 min，95%、90%、80%、70%乙醇各5 min。隨后蒸餾水浸泡5 min，蘇木精染色5 min，可根據具體染色情況，適當增加或減少染色時間。流水沖洗5 min，1%鹽酸酒精分化。流水沖洗5 min，伊紅染色30 s，根據染色情況，適當增加或減少染色時間。流水沖洗5 min。然后按以下程序進行梯度乙醇脫水：70%、80%、90%、95%、100%乙醇Ⅰ、Ⅱ各5 s，100%酒精Ⅲ、組織透明劑Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各5 min。中性樹膠封片，拍照。

1.2.4 實時定量PCR檢測收取各組肺組織于1.5 mL離心管中，根據細胞數量加入TRIzol 處理液，按照Total RNA 提取試劑盒說明書提取總RNA。經反轉錄獲得cDNA。加入引物和SYBR mix配制實時定量PCR(quantitative real-time PCR，qPCR)反應體系，反應條件為95 ℃、30 s；95 ℃、5 s；60 ℃、30 s，循環39次。每組設3個復孔。引物由上海生工生物工程股份有限公司設計并合成，序列如表1所示。

表1 各基因引物序列

1.2.5 Western blot檢測收取各組肺組織于1.5 mL離心管中，根據細胞數量加入蛋白裂解液，超聲裂解細胞提取細胞總蛋白，二辛可寧酸(bicinchoninicacid，BCA)法定量，加入5×上樣緩沖液混合后沸水浴5 min。10%分離膠十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electropho?resis，SDS-PAGE)電泳分離蛋白，經轉膜、封閉、一抗(NOX1抗體、NOX4抗體、Nrf2抗體、HO-1抗體均按照1∶500 濃度稀釋，β-actin 抗體按照1∶1 000 濃度稀釋)孵育、二抗(1∶10 000 濃度稀釋)孵育后進行化學發光，分別進行NOX1、NOX4、Nrf2 和HO-1 蛋白的檢測。ImageJ圖像處理系統分析條帶灰度值。

1.3 統計學方法

采用GraphPad Prism 5 軟件進行數據處理。計量資料以xˉ±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用t檢驗LSD 法。P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 桑黃素對LPS誘導的小鼠急性肺損傷的影響

HE染色后肺組織病理組織學檢測結果見圖1，顯示正常對照組小鼠肺組織形態規則，肺泡結構清晰完整，無明顯出血或炎性細胞浸潤；ALI 模型組小鼠肺組織肺泡塌陷、肺泡壁與肺泡間隔明顯增厚，炎性細胞浸潤；桑黃素低劑量(25 mg/kg)處理組小鼠肺泡組織較ALI 模型組病理形態略有改善，炎性細胞浸潤減少。桑黃素高劑量(50 mg/kg)處理組小鼠肺泡組織較ALI 模型組病理形態顯著改善，肺泡壁薄且結構完整清晰，較少炎性細胞浸潤。上述結果提示，桑黃素可有效抑制急性肺損傷小鼠的肺部病變。

圖1 桑黃素對LPS誘導的ALI肺組織病理學改變的影響(HE染色，×200倍)

2.2 桑黃素對急性肺損傷小鼠肺組織W/D 比值的影響

各組小鼠肺組織濕/干質量比值的比較見圖2，與正常對照組比較，ALI模型組小鼠肺組織W/D 值顯著增加(P＜0.01)。與ALI 模型組比較，桑黃素低劑量(25 mg/kg)和高劑量(50 mg/kg)處理組小鼠肺組織W/D值均顯著降低(P＜0.01)。

圖2 各組小鼠肺組織濕/干質量比值

2.3 桑黃素對急性肺損傷小鼠肺組織NOX1和NOX4表達的影響

qPCR 檢測結果(圖3)顯示，與正常對照組比較，ALI模型組小鼠肺組織中NOX1和NOX4的mRNA表達量顯著上調(P＜0.01)。與ALI模型組比較，桑黃素低劑量(25 mg/kg)和高劑量(50 mg/kg)處理組小鼠肺組織NOX1 和NOX4 的mRNA 表達量均顯著降低(P＜0.01)。Western blot 檢測各組肺組織中NOX1 和NOX4 蛋白表達，得到和mRNA表達類似的結果(圖4)。上述結果表明，桑黃素處理可有效抑制急性肺損傷小鼠肺組織中氧化應激的發生。

圖3 各組小鼠肺組織中NOX1和NOX4 mRNA的表達情況

2.4 桑黃素對LPS 刺激下肺組織中Nrf2-HO-1 信號通路的影響

如圖5所示，Western blot檢測發現，與對照組比較，ALI模型組抗氧化應激指標Nrf2和HO-1的蛋白表達增加(P＜0.05)；與ALI 模型組比較，桑黃素處理組Nrf2和HO-1的蛋白表達水平進一步增加(P＜0.05或P＜0.01)。表明桑黃素可通過Nrf2-HO-1 通路降低LPS 誘導的ALI氧化應激水平。

圖5 各組小鼠肺組織中Nrf2和HO-1的蛋白表達情況

3 討 論

ALI 是一種由各種原因導致的肺泡毛細血管內皮和肺泡上皮損傷、微血管通透性增加而引起的以彌漫性肺水腫和微小肺不張、進行性低氧血癥為病理特征的炎癥反應綜合征，嚴重時可發展為急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)。多個國家的流行病學研究報告顯示，ALI 嚴重威脅著住院病人的生命健康[9-11]。目前臨床上針對ALI 和ARDS患者的治療主要依賴機械通氣、液體管理等手段，缺乏較為有效的藥物治療[12]。因此，發現更多與ALI 發生發展相關的細胞通路及作用機制，篩選出精準靶向信號通路和位點從而找到有效治療ALI 的藥物顯得尤為迫切。

近年來，隨著分子生物學、細胞生物學等實驗技術的飛速發展和我國中醫藥利好政策的不斷出臺，中醫藥的實驗研究和臨床應用得到了快速發展。越來越多的研究表明[13-14]，中藥在防治ALI發生發展中的作用日益顯著。其中，具有抗氧化和消除自由基作用的黃酮類化合物也引起了大家的關注。丹參酮IIA、細辛酮、木犀草素、黃岑黃素等黃酮類化合物能夠通過調節核因子-κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)和絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPKs)信號通路，降低腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和白細胞介素6(interleukin-6，IL-6)水平抑制炎癥發生，發揮抗ALI的作用[15]。研究[4]表明，黃酮類化合物桑黃素能夠通過清除ROS，提高抗氧化酶的活性發揮作用。此外，研究[1]還表明，桑黃素能明顯抑制LPS 對肺組織中性粒細胞的誘導，并降低肺組織中核苷酸結合域和富含亮氨酸的重復序列家族pyrin 結構域包含3(nucleotide-binding domain and leucine-rich-repeat-containing family pyrin domain containing 3，NLRP3)炎癥小體的蛋白水平。因此，我們推測，桑黃素能夠通過抑制氧化應激的發生減輕小鼠急性肺損傷。本研究發現，與對照組比較，LPS處理的ALI模型組小鼠肺濕質量與干質量(W/D)比值顯著升高，肺泡間隔明顯增厚，且肺泡內出現炎性細胞浸潤，桑黃素處理可有效減少ALI 導致的肺泡水腫及炎性細胞浸潤，緩解了LPS 誘導的急性肺損傷。此外，桑黃素還可顯著降低ALI 小鼠肺組織NOX1和NOX4的表達。LPS刺激可上調肺組織中Nrf2和HO-1 蛋白的表達，桑黃素處理則進一步上調了Nrf2和HO-1蛋白的表達，從而抑制NOX1和NOX4的表達及氧化應激的發生。結果表明，桑黃素通過激活Nrf2-HO-1 信號通路發揮抗氧化應激的作用，進而減輕ALI的肺泡水腫，抑制肺組織纖維化的形成。

最近的研究表明，氧化應激在病毒感染引起的呼吸系統疾病中發揮重要作用，例如由嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒和SARS-CoV-2 引起的病毒感染，特別是在ARDS感染階段[16-17]。Nrf2是細胞保護性抗氧化蛋白表達產物的主要調節因子，在防止氧化應激引起的細胞和組織損傷中起重要作用。研究[18]表明，Nrf2 能夠參與巨噬細胞代謝和炎癥介質的表達，并且Nrf2的激活對包括ALI/ARDS 在內的各種肺部疾病均具有保護作用[19]。HO-1 是Nrf-2 的下游抗氧化劑，激活的Nrf-2 能夠增強HO-1 表達，進而抑制氧化應激的發生[20]。在本研究中，通過檢測氧化應激相關指標在肺組織中的表達情況，證實桑黃素可通過激活Nrf2/HO-1信號通路抑制細胞中氧化應激的發生。

綜上所述，本研究通過建立小鼠體內ALI 模型，初步證實桑黃素可通過抑制氧化應激反應的發生，緩解ALI 導致的肺泡水腫等損傷。此外，桑黃素的抗氧化作用機制可能與激活Nrf2-HO-1 信號通路，抑制NOX1和NOX4的表達有關。本研究為尋找ALI的有效治療靶點提供了新的思路。