孕婦腸道菌群對新生兒出生體質量的影響研究

肖雪，王宇琦，賴曉嵐，鐘紹濤，趙翠柳，劉丹，李琳，譚榮韶*，楊紅玲

新生兒出生體質量不僅對其生長發育和健康狀況評估具有重要意義，而且是兒童后期生長發育預測和成年期疾病預測的重要指標［1］。新生兒出生體質量過高或者過低都會嚴重影響新生兒的健康，甚至影響其母親的健康［2］。新生兒出生體質量受多種因素影響，如母親文化程度、新生兒性別、孕次、流產史、孕期患病、孕期被動吸煙等［3］。已有研究表明，腸道菌群組成與體質量有密切關系［4］。腸道菌群結構受宿主基因型、飲食、分娩方式、抗生素使用和益生菌等因素的影響，其中飲食結構是最直接且最容易控制的因素［5］。有研究揭示，飲食、宿主能量代謝和肥胖表型之間存在明顯相關性［6］。胚胎期的環境和營養狀況、遺傳因素等都與新生兒出生體質量有密切聯系［7］。另一方面，管理孕期體質量是孕期保健工作的重要內容之一，孕期體質量異常對妊娠結局及母嬰健康都有重要影響［8-9］。以往研究多圍繞孕婦腸道菌群與孕婦BMI、不良妊娠結局和新生兒腸道菌群的關系開展［10-11］，較少有研究關注孕婦腸道菌群與新生兒體質量的關系。因此，本研究擬探討孕期母體腸道微生物群及代謝狀態與子代出生體質量的關系，從而為通過改善孕期腸道微生態結構來降低子代健康風險提供參考。

1 對象與方法

1.1 研究對象 以2017年1—9月在廣州市婦女兒童醫療中心出生的516例新生兒及其孕母為研究對象。納入標準：（1）孕婦無精神疾病史，能配合完成問卷調查和相關實驗室檢查；（2）自愿參與本研究并簽署知情同意書。排除標準：（1）孕婦在過去6個月內使用過全身抗生素、皮質酮、細胞因子、氨甲喋呤或其他免疫毒性藥物、激素拮抗劑和大劑量益生菌藥物；（2）孕婦患嚴重心血管疾病、炎癥性腸病、腸易激綜合征、腹腔疾病等；（3）孕婦為人類免疫缺陷病毒感染者；（4）孕婦5年內進行過腸道手術；（5）孕婦患有由艱難梭菌或不明原因引起的慢性腹瀉；（6）孕婦患有慢性便秘；（7）孕婦患有妊娠期糖尿病或妊娠期高血壓；（8）孕婦在近4周內進行過常規抗生素治療或益生菌補充。本研究經廣州市婦女兒童醫療中心倫理委員會審批（倫理批件編號：2018030306）。

1.2 研究方法

1.2.1 資料收集及分組方法 在孕母至醫院產檢時，通過調查問卷收集其一般資料（如年齡、身高、體質量），并留取其血液、尿液及糞便樣本。通過查閱醫院病歷系統，采集新生兒的出生醫學信息。根據新生兒出生體質量，將其分為低出生體質量兒組（LW組，出生體質量＜2 500 g，n=24）、正常體質量兒組（NW組，出生體質量為2 500～3 999 g，n=479）、巨大兒組（OW組，出生體質量≥ 4 000 g，n=13）［12］。

1.2.2 腸道菌群檢測

1.2.2.1 糞便樣本采集和DNA提取 使用帶穩定液的糞便采集管收集孕婦的晨起空腹糞便，采集花生米大小的新鮮便樣，編號后置于-80 ℃保存。采用Qiagen公司Stool DNA提取試劑盒提取糞便DNA，DNA提取完成后行瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA純度和濃度，合格DNA用無菌水稀釋至1 ng/μl。

1.2.2.2 生物學的聚合酶鏈反應（PCR）擴增和PCR產物回收純化 以稀釋后的DNA為擴增模板，使用 通 用 515F（5'-GTGYCAGCCGGTAA-3'） 和 806R（5'-GGACTACNVGGWTCTAAT-3'） 引 物 擴 增16S rRNA基因的V4區域，反應程序設置為：95 ℃預變性5 min；30個循環（包括94 ℃，30 s；60 ℃，30 s；72 ℃，40 s）；72 ℃，4 min，使用 New England Biolabs公司的Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer進行擴增，所得PCR產物使用2%的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測質量；選擇主帶大小為300～350 bp的序列，割膠回收目標條帶。產物純化使用Thermo Scientific公司Gene JET膠回收試劑盒。

1.2.2.3 高通量測序分析腸道菌群 使用建庫試劑盒進行文庫的構建，構建好的文庫經過Qubit定量和文庫檢測合格后，使用HiSeq進行上機測序。測序完成后原始數據拼接、過濾，基于有效數據進行分類操作單元（operational taxonomic units，OTUs）聚類和物種分類分析，根據OTUs聚類結果，對每個OTU的代表序列做物種注釋，得到對應的物種信息和基于物種的豐度分布情況。

1.3 統計學方法 采用SPSS 22.0統計軟件進行數據分析，采用Adobe Illustrator CS5和R語言軟件繪圖。對計量資料進行正態性檢驗和方差齊性檢驗，滿足正態分布和方差齊性的資料以（±s）表示，三組間比較采用單因素方差分析。選擇香農指數和辛普森指數來反映三組孕婦腸道菌群的Alpha多樣性。通過分析不同樣品的OUTs 組成可以反映樣品間的差異和距離，主坐標分析（principal coordinates analysis，PCoA）運用方差分解，將多組數據的差異反映在二維坐標圖上，以觀察不同樣品、不同組別間微生物群落Beta多樣性的分類學差異。采用LEfSe分析，分別對三組孕婦腸道菌群屬水平上的相對豐度進行兩兩比較，識別組間具有明顯差異的菌群。通過線性模型MaAsLin進行多元分析，以捕獲各實驗室檢測指標與微生物屬之間的相關性。通過Boruta隨機森林分類器模型分別基于實驗室檢測指標和腸道菌群OTUs構建新生兒出生體質量分類預測模型，并繪制受試者工作特征（ROC）曲線，預測孕婦腸道菌群對新生兒體質量的影響。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 三組孕婦的基本情況及實驗室檢測指標比較 三組孕婦的年齡、身高、孕前體質量、孕前BMI、孕期體質量增長及各項實驗室指標比較，差異均有統計學意義（P＜0.05），見表 1～2。

表1 三組孕婦的基本情況比較（±s）Table 1 General characteristic of three groups of pregnant women

表1 三組孕婦的基本情況比較（±s）Table 1 General characteristic of three groups of pregnant women

注：LW組為低出生體質量兒組（出生體質量＜2 500 g），NW組為正常體質量兒組（出生體質量為2 500～3 999 g），OW組為巨大兒組（出生體質量≥4 000 g）

孕期體質量增長（kg）LW 組 24 30.5±0.8 156.9±1.1 50.6±1.0 20.5±0.5 12.7±0.7 NW 組 479 30.1±0.2 159.7±0.2 52.0±0.3 20.4±0.1 13.2±0.2 OW 組 13 31.5±1.5 161.2±1.4 57.2±1.4 21.9±0.6 17.3±1.2 F值 37.54 49.23 63.83 58.95 77.63 P值 0.04 0.03 0.03 0.03 0.02組別 例數 年齡（歲）身高（cm）孕前體質量（kg）孕前BMI（kg/m2）

表2 三組孕婦實驗室檢測指標比較（±s）Table 2 Results of clinical laboratory indices of three groups of pregnant women

表2 三組孕婦實驗室檢測指標比較（±s）Table 2 Results of clinical laboratory indices of three groups of pregnant women

嗜堿性粒細胞（%）LW 組 24 5.3±0.6 37.9±6.3 4.7±1.1 3.5±1.2 35.0±1.9 92.0±11.7 4.0±1.0 73.0±11.2 22.0±0.9 23.0±0.6 38.0±1.1 1.3±1.0 1.3±0.4 NW組 479 4.9±0.3 41.7±3.5 4.3±0.6 4.2±0.5 28.0±0.4 114.0±8.6 3.1±0.3 58.0±6.2 32.0±0.4 28.0±0.3 22.0±0.4 0.9±0.5 0.9±0.1 OW 組 13 5.5±0.7 37.2±6.8 4.8±1.2 3.6±1.1 37.0±1.8 87.0±13.0 3.8±0.8 69.0±10.4 24.0±0.8 22.0±0.7 43.0±1.4 1.3±0.9 1.4±0.4 F值 365.96 285.62 168.53 194.71 170.56 406.85 263.64 553.90 342.17 229.73 646.83 335.94 224.86 P 值 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01組別 例數 糖化血紅蛋白（%）紅細胞比容（%）空腹血糖（mmol/L）紅細胞計數（×1012/L）血清谷氨酰轉移酶（U/L）血紅蛋白（g/L）血漿纖維蛋白原（g/L）中性粒細胞（%）淋巴細胞（%）球蛋白（g/L）丙氨酸氨基轉移酶（U/L）血清胱抑素C（mg/L）

2.2 三組孕婦腸道菌群組成比較

2.2.1 門水平分析 516例孕婦的腸道菌群共檢測出厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、放線菌門（Actinobacteria）、變形菌門（Protecobacteria）、廣古菌門（Euryarchaeota）、疣微菌門（Verrucomicrobia）6個主要的門，其中Firmicutes在三組中占絕對優勢。三組孕婦在主要門水平上的菌群相對豐度比較，差異無統計學意義（P＞0.05），見表3。

表3 三組孕婦腸道菌群在門水平上的菌群相對豐度比較（±s，%）Table 3 The average relative abundance of intestinal floras at the phylum level of mothers of three groups of babies divided by birth weight

表3 三組孕婦腸道菌群在門水平上的菌群相對豐度比較（±s，%）Table 3 The average relative abundance of intestinal floras at the phylum level of mothers of three groups of babies divided by birth weight

注：Firmicutes=厚壁菌門，Bacteroidetes=擬桿菌門，Actinobacteria=放線菌門，Protecobacteria=變形菌門，Euryarchaeota=廣古菌門，Verrucomicrobia=疣微菌門

組別 例數 Firmicutes Bacteroidetes Actinobacteria Protecobacteria Euryarchaeota Verrucomicrobia 其他LW 組 24 85.52±9.20 5.63±0.70 5.92±0.70 1.29±0.20 0.11±0.01 1.43±0.20 0.10±0.01 NW 組 479 78.19±8.10 13.16±1.30 5.25±0.60 2.13±0.20 0.41±0.04 0.75±0.20 0.11±0.01 OW 組 13 78.42±8.90 13.67±1.70 1.93±0.30 1.68±0.30 0.35±0.06 3.86±0.50 0.09±0.01 F值 12.90 14.60 9.30 10.50 8.40 13.30 5.20 P值 0.23 0.18 0.41 0.37 0.45 0.20 0.73

2.2.2 Alpha多樣性分析 LW組、NW組及OW組的香農指數分別為（3.45±0.41）、（3.55±0.36）、（3.62±0.43），辛普森指數分別為（0.93±0.12）、（0.95±0.08）、（0.93±0.13）。三組香農指數、辛普森指數比較，差異無統計學意義（P＞0.05），見圖1～2。

圖1 三組孕婦腸道菌群Alpha多樣性香農指數比較Figure 1 Shannon Diversity Index measuring the alpha diversity indices of intestinal flora of mothers of three groups of babies divided by birth weight

圖2 三組孕婦腸道菌群Alpha多樣性辛普森指數比較Figure 2 Simpson's Diversity Index measuring the alpha diversity indices of intestinal flora of mothers of three groups of babies divided by birth weight

2.2.3 Beta多樣性分析 基于bray-cutis距離的二維PCoA值顯示，主成分1和主成分2的解釋度分別為5.33%和4.82%，三組間在菌群組成上比較，差異無統計學意義（P=0.22），見圖3。

圖3 三組孕婦腸道菌群的Beta多樣性Figure 3 Beta diversity analysis of intestinal flora of mothers of three groups of babies divided by birth weight

2.2.4 屬水平分析 三組孕婦腸道菌群中平均豐度較高的9個優勢菌屬分別為：普拉梭菌（Faecalibacterium）、羅氏菌（Roseburia）、布勞特氏菌（Blautia）、擬桿菌（Bacteroides）、巨單胞菌（Megamonas）、毛螺菌（Lachnospiraceae+）、瘤胃球菌（Ruminococcus）、普雷沃氏菌（Paraprevotella）、鏈球菌（Streptococcus）。其中，Faecalibacterium在三組中占優勢，Bacteroides在LW組中為第二優勢菌屬（占8.26%），而NW組和OW組的第二優勢菌屬為Roseburia（分別占8.71%和9.42%）。三組孕婦腸道菌群在屬水平上的相對豐度比較，差異無統計學意義（P＞0.05），見表4。

表4 三組孕婦腸道菌群在屬水平上的相對豐度比較（±s，%）Table 4 The average relative abundance of intestinal flora at the genus level of mothers of three groups of babies divided by birth weight

注：Faecalibacterium=普拉梭菌，Roseburia=羅氏菌，Blautia=布勞特氏菌，Bacteroides=擬桿菌，Megamonas=巨單胞菌，Lachnospiraceae+=毛螺菌，Ruminococcus=瘤胃球菌，Paraprevotella=普雷沃氏菌，Streptococcus=鏈球菌

組別 例數 Faecalibacterium Roseburia Blautia Bacteroides Megamonas Lachnospiraceae+ Ruminococcus Paraprevotella Streptococcus 其他LW 組 24 17.82±1.90 6.52±0.80 6.81±0.80 8.26±0.90 5.36±0.60 5.22±0.60 5.07±0.60 7.25±0.70 1.89±0.20 35.8±3.90 NW 組 479 17.39±1.60 8.71±0.80 7.96±0.80 5.79±0.60 4.35±0.50 6.52±0.60 5.81±0.60 5.22±0.50 2.75±0.30 35.5±3.60 OW 組 13 19.56±2.10 9.42±1.10 5.06±0.70 4.64±0.70 8.41±1.00 5.09±0.70 5.05±0.70 3.18±0.60 3.93±0.50 35.6±4.10 F值 6.80 7.50 8.30 12.10 10.90 5.50 4.60 10.90 8.90 4.10 P值 0.66 0.53 0.45 0.22 0.34 0.74 0.80 0.36 0.43 0.82

LEfSe分析結果顯示：（1）與LW組相比，優勢菌屬Streptococcus和非優勢菌屬羅斯氏菌（Rothia）在NW組明顯富集（P＜0.05），而非優勢菌屬芽孢桿菌（Bacillaceae）、蘿卜屬菌（Raphanus）、甲烷球形菌（Methanosphaera）、巴氏桿菌（Barnesiellaceae）、Paraprevotella的相對豐度降低（P＜0.05）；（2）與OW組相比，優勢菌屬Megamonas和非優勢菌屬糞球菌（Coprococcus）、cc_115、韋榮氏菌（Veillonellaceae）、梭菌（Closrtidiaceae）、另枝桿菌（Alistipes）在NW組明顯降低（P＜0.05），而優勢菌屬Blautia和非優勢菌屬伊格爾茲氏菌（Eggerthella）明顯富集（P＜0.05）；（3）LW組與OW組比較，非優勢菌屬Closrtidiaceae、Alistipes在OW組明顯富集（P＜0.05），非優勢菌屬Barnesiellaceae在LW組明顯富集（P＜0.05），見圖4。

2.3 孕婦腸道菌群與實驗室檢測指標的相關性分析結果顯示，實驗室檢測指標與微生物屬之間存在308個有統計學意義的相互關聯（q≤0.20，P＜0.05）。其中尿膽原與36個菌屬的相對豐度密切相關，見圖5。

圖5 孕婦實驗室檢測指標與腸道菌群物種的相關性網絡Figure 5 Correlation network between maternal laboratory test indices and intestinal flora species

2.4 基于實驗室檢測指標和腸道菌群OTUs建立預測出生體質量的模型 （1）基于實驗室檢測指標的分類器模型構建ROC曲線，區分NW組與LW組的AUC為0.62，區分NW組與OW組的AUC為0.65，見圖6～7。（2）基于腸道菌群OTUs分類器模型構建ROC曲線，區分NW組與LW組的AUC為0.77，區分NW組與OW組的AUC為0.78，見圖8～9。

圖6 基于實驗室檢測指標建立的區分NW組與LW組孕婦隨機森林分類模型的ROC曲線Figure 6 ROC curve of random forest classification model based on maternal blood test indices for distinguishing between babies born with normal and low weight

圖7 基于實驗室檢測指標建立的區分NW組孕婦與OW組孕婦隨機森林分類模型的ROC曲線Figure 7 ROC curve of random forest classification model based on maternal blood test indices for distinguishing between a baby with normal birth weight and a macrosomia

圖8 基于腸道菌群OTUs建立的區分NW組孕婦與LW組孕婦隨機森林分類模型的ROC曲線Figure 8 ROC curve of random forest classification model based on maternal intestinal flora OTUs for distinguishing between babies born with normal and low weight

圖9 基于腸道菌群OTUs建立的區分NW組孕婦與OW組孕婦隨機森林分類模型的ROC曲線Figure 9 ROC curve of random forest classification model based on maternal intestinal flora OTUs for distinguishing between a baby with normal birth weight and a macrosomia

3 討論

外源性和內源性因素都可能影響母體腸道微生物的構建，如母體易受膳食、肥胖、妊娠期并發癥、環境暴露、抗生素使用等病理因素的影響，進而影響正常妊娠過程，誘導各種妊娠并發癥的發生、發展，直接或間接影響妊娠結局，影響新生兒體質量的同時，也可能改變新生兒的表觀基因并且遺傳給子代，當子代成年后更易誘發肥胖、心血管疾病、糖尿病及其他代謝性疾病［13］。近年來，腸道菌群失衡已被證實與糖尿病［14］、高血壓［15］、過敏性哮喘［16］、神經系統疾病［17］等多種疾病相關。研究發現，腸道菌群對宿主的代謝、免疫反應、生理活動等具有廣泛影響［18-19］。由于妊娠期女性的解剖結構及生理、免疫功能發生變化，其腸道菌群也會受妊娠期特殊代謝過程的影響而發生改變［20-21］。本研究發現，516例孕婦的腸道菌群主要由Firmicutes、Bacteroidetes、Actinobacteria、Protecobacteria、Euryarchaeota、Verrucomicrobia 6個細菌門所組成，其中Firmicutes物種豐富度最高；而在屬水平上，優勢菌屬包括Faecalibacterium、Roseburia、Blautia、Bacteroides、Megamonas、Lachnospiraceae+、Ruminococcus、Paraprevotella、Streptococcus 9種，其中Faecalibacterium在三組中均占優勢，這與近兩年同類研究結果基本一致［22-23］。正常圍產期母體的腸道微生物基本保持“動態平衡”，但是因為孕期營養代謝需求量增加，激素分泌水平改變，調控血糖穩態、胰島素敏感性，胃腸道發生系列重構，腸道菌群組成也發生適應性改變［24］。另一方面，胎兒的增長導致孕婦體內激素水平不斷變化，從而引起體內微生物寄居環境變化，如各種微量元素、溫度、濕度和pH等，因此孕婦腸道菌群也會發生改變。

在本研究中，與NW組和LW組相比，OW組孕婦腸道菌群中富集梭菌綱和梭菌目。前期研究證明Clostridiaceae具有產生短鏈脂肪酸的功能［25］。短鏈脂肪酸是由膳食纖維、蛋白質和多肽發酵產生的一種少于6個碳的羧酸，其逃避了腸上部宿主酶的消化，并被盲腸和結腸的微生物群代謝，其中乙酸、丙酸和丁酸是重要的代謝產物。乙酸進入外周循環供周圍組織使用。丙酸是一類葡萄糖異生劑，具有抑制膽固醇合成的作用，因此很可能會降低血液血脂水平及心血管疾病的發生風險，同時短鏈脂肪酸被認為具有抗感染特性［26］。這表明，分娩巨大兒的孕母體內腸道菌群可能是被產生短鏈脂肪酸相關的細菌的代償機制所抑制。

目前在臨床上對孕期胎兒體質量干預的措施有限，難以奏效；即出生前已預知是巨大胎兒或體質量偏低的胎兒，在出生時仍然是巨大兒或低出生體質量兒；無論巨大兒或低出生體質量兒，都會影響其出生后的生長發育及疾病的發生。為此，本研究還探討了孕婦腸道菌群對新生兒體質量的影響：基于母體腸道菌群建立區分正常出生體質量孕婦與低出生體質量和巨大兒孕婦的隨機森林分類模型，其ROC曲線下面積分別為0.77和0.78，表明基于腸道菌群OTUs構建的分類器模型對正常出生體質量孕婦與低出生體質量孕婦和巨大兒孕婦的區分能力比基于實驗室檢測指標的區分能力更強，菌群的獨立預測作用高于臨床實驗室檢測指標。研究新生兒體質量的不同與孕婦的腸道菌群分布的變化來構建預測模型，找出對新生兒體質量預測有重要影響的微生物指標，可用于臨床上對于巨大兒和低體質量兒出生的提前預測。根據孕婦孕期的腸道菌群變化提早干預孕婦的營養攝入，運用各種干預手段調控孕婦的腸道菌群的組成和分布，以此降低不良妊娠結局發生風險，這對于提高孕期母嬰健康和改善分娩后母嬰的遠期健康都具有非常高的價值，也是現代醫學實現“未病先防”和個性化醫療的新方向和途徑。

作者貢獻：肖雪進行文章的構思與設計，撰寫論文并進行論文修訂，對文章整體負責；賴曉嵐、鐘紹濤進行研究的實施與可行性分析；趙翠柳、劉丹、李琳進行數據收集；王宇琦、楊紅玲負責數據整理、統計學處理、結果的分析與解釋；譚榮韶對文章進行監督管理。

本文無利益沖突。