溫度和光照對克氏原螯蝦生物鐘基因PcClk與PcCry1表達的影響*

周 慧，吳海霞，謝 偉，王蕓蕓，蔣琦辰，李 鵬

(1.南京師范大學海洋科學與工程學院，江蘇南京 210023；2.南京師范大學生命科學學院,江蘇南京 210023；3.江蘇省淡水水產研究所，江蘇南京 210017)

生物鐘又稱“晝夜節律鐘”或“近日時間節律鐘”，是生物體適應環境周期性變化的內在計時機制，具有重要的功能[1]。Abe等[2]研究證實生物鐘基因調節生物體的穩態，與炎癥反應、血糖平衡、合成和分解代謝等有著密切的關系。晝夜節律的發生是以時鐘基因及其相關蛋白為物質基礎[3]，例如時鐘基因(clock，Clk)與生物體生命健康息息相關，其蛋白產物CLOCK (CLK)屬于bHLH/PAS家族的轉錄因子，驅動目標時鐘基因以及與組織特異性轉錄因子相關的其他基因表達[4]。在生物鐘調控系統中，CLK蛋白通常與CYC蛋白形成異源二聚體，激活下游基因轉錄，在反饋環中起正調控作用。它主要在視交叉上核和視網膜中表達，在外周組織器官(肝臟、心臟、肌肉、腎臟、胰臟、睪丸、卵巢等)中也有表達[5]。在對小鼠的研究中發現，敲除該基因的小鼠表現出生物節律紊亂，多巴胺在中腦頓腹部(Ventral Tegmental Area，VTA)的轉運增加，由此推斷出CLK蛋白與腦回路中的多巴胺運轉有關[6]。敲除斑馬魚Clk基因，會導致其他幾個相關基因的表達量下降[7]。

Cryptochrome(Cry)又被稱為“隱花色素基因”，其產物蛋白是一種對藍光極其敏感的黃素蛋白光受體，該蛋白是多細胞動物核心晝夜節律振蕩器的組成部分，可調節動物體內晝夜生物鐘光導引過程[8,9]。Cry基因是核心生物鐘基因，可分為3種基因類型：Cry1(或稱果蠅型Cry)、Cry2(或稱哺乳動物型Cry)和Cry3。其中CRY2是昆蟲和哺乳動物生物鐘的重要組成部分;而CRY1在果蠅研究中較為深入，在睡眠剝奪所引發的血管炎癥影響中發現，CRY1可明顯抑制血管炎癥的發生和發展[10]。

克氏原螯蝦(Procambarusclarkii)肉質結實，味道清新鮮美，是我國重要的水產養殖經濟蝦類。但在克氏原螯蝦規模化人工養殖過程中會遇到很多問題，如苗種繁育不足、個體小型化、疾病防控落后等。謝偉等[11]研究表明克氏原螯蝦諸多生理與行為節律均受體內生物鐘基因的調控，生物鐘基因對克氏原螯蝦的生長發育和攝食行為具有很大影響。作為重要的經濟蝦類，目前對克氏原螯蝦生物鐘相關基因的種類和功能研究還不夠全面，對其調控機制更是缺少了解，因此本研究運用生物信息學方法分析Clk基因(命名為PcClk)與Cry1基因(命名為PcCry1)的一些理化性質、功能結構，并使用熒光定量PCR 技術(qRT-PCR)探究克氏原螯蝦這兩個生物鐘基因在不同溫度和光照協同作用模式下的mRNA表達差異情況，并從進化生物學角度對克氏原螯蝦PcClk與PcCry1進行選擇壓力分析，以期了解溫度和光照周期對克氏原螯蝦生物鐘節律的影響，為其健康養殖提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

克氏原螯蝦樣品均采集于江蘇南通野外生境，選取8-12 cm健康的雄性克氏原螯蝦個體，以排除性別對實驗的干擾。樣品帶回實驗室后對其進行適應馴化培養。

暫養馴化培養：在實驗室循環水箱中飼養2周，用全光譜日光燈模擬室外自然光照，光照周期為12 h光照和12 h黑暗(12 LD)，用增氧泵24 h不間斷充氧并維持室溫在25℃左右；同時，在養殖箱底鋪滿沙石，并放置尼龍管、石塊、易拉罐，為克氏原螯蝦提供隱蔽處，減少其打斗頻率。暫養期間于早(8:00)晚(20:00)投喂蝦蟹專用顆粒飼料，并保證每天投喂量一樣，及時吸取殘餌，2 d換水一次，換水量約為原來的1/3。

馴化2周后，將樣品放置在24 LL (24 h光照)、12 LD (12 h光照和12 h黑暗)和24 DD (24 h黑暗)模式下培養。24 h黑暗處理是將實驗室所有門窗使用不透光黑薄膜遮蔽，僅在喂食和換水時短暫開燈，其余時間均處于黑暗狀態；24 h光照處理是將處于自然光照射下的養殖水箱上方放置全光譜日光燈，并且24 h打開。由于在25℃、12 LD培養模式下克氏原螯蝦的生長狀況最好，在24 LL、24 DD或者溫度過高時，其成活率會降低(數據暫未發表)，所以在每種光照周期下設置恒定溫度25℃，同時在12 LD的光照周期下設置20℃、25℃和30℃ 3個不同溫度進行研究，水溫由加熱棒控制。在馴化期間正常喂食，馴化結束后分別挑取52只健康雄性克氏原螯蝦轉入各模式下繼續培養，3 d后于時間點8:00、12:00、16:00、20:00、00:00，次日4:00和8:00分別對每組取樣。每個時間點取兩只一組，共取3組平行實驗組。每組取腦、眼柄、肝胰腺各約30 mg的組織，加入RNA保護試劑，勻漿后于-80℃冰箱保存備用。

1.2 總RNA提取和cDNA合成

將狀態良好的克氏原螯蝦肝胰腺、腦、眼柄組織分別取出，按Trizol試劑盒(賽默飛世爾科技有限公司)說明書的方法提取總RNA，用焦碳酸二乙酯(Diethyl Pyrocarbonate，DEPC)處理水稀釋，使RNA沉淀溶解，并用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質量；使用超微量紫外分光光度計對RNA進行濃度定量測定。據PrimeScriptTMRT Master Mix (上海力敏實業有限公司)說明，將獲得的總RNA反轉錄為cDNA，-80℃冰箱保存備用。

1.3 cDNA序列和氨基酸序列分析

用cDNA末端快速擴增方法獲得的PcClk基因和PcCry1基因全長，于美國國家生物技術信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)進行PcClk基因(MN908585)和PcCry1基因(MG659714.1) cDNA全長完整性驗證。使用ExPASy服務器(https://web.expasy.org/)[12]的ProtParam和ProtScale工具分析PcCLK蛋白、PcCRY1蛋白的理化性質和疏水性。使用SignalP程序[13]預測信號肽，MotifScan程序查找motif，SMART軟件[14]分析結構功能域，PSORT Ⅱ軟件進行亞細胞定位，TMHMM v.2.0軟件[15]預測跨膜區，SWISS-MODEL網站預測蛋白質三級結構[16]。使用MEGA Ⅹ軟件的鄰接法構建系統發育樹，驗證PcCLK蛋白與PcCRY1蛋白在進化過程中與其他同源蛋白的關系[17]。

1.4 熒光定量PCR檢測

使用Prime Primer 5軟件設計引物[表1，以β-actin作為內參基因，引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成]，并對PcClk基因、PcCry1基因在不同光照和溫度協同作用模式下7個時間點的mRNA表達情況進行檢測。使用StepOnePlusTM實時熒光定量PCR儀(Applied Biosystems，美國應用生物系統公司)進行定量PCR實驗，按照實時定量PCR試劑盒SYBR?Premix-TaqTMⅡ (TliRNaseH Plus)說明書操作，熒光定量PCR反應體系如下：SYBR?Premix ExTaqTMⅡ (2×) 10 μL，PCR Forward Primer (10 μmol/L) 0.8 μL，PCR Reverse Primer (10 μmol/L) 0.8 μL，cDNA (100 ng/μL) 1 μL，再加上去離子水7.4 μL。反應程序為95℃ 5 min，95℃ 5 s，62℃ 30 s，72℃ 15 s，72℃ 1 min，16℃ 15 s。反應結束后分析相關數據，采用比較CT值的方法(基因相對表達量=2-ΔΔCT)[18]來分析PcClk基因、PcCry1基因的相對表達水平。采用SPSS17.0軟件對所有數據進行統計分析，利用單因素方差分析法(ANOVA)對不同處理組樣品進行差異顯著性分析，P<0.05表示差異顯著。

表1 PcClk基因和PcCry1基因mRNA表達檢測所用的引物信息Table 1 Primers information for detection of PcClk and PcCry1 genes mRNA expression

1.5 適應性進化分析

1.5.1 序列獲取

為研究克氏原螯蝦PcClk基因和PcCry1基因的適應性進化，選擇代表性節肢動物物種進行分析，涉及甲殼亞門、螯肢亞門和六足亞門。所有選取物種的Clk基因和Cry基因序列均從NCBI數據庫直接下載，相關信息如表2、表3所示。

表2 用于適應性進化分析的各物種Clk基因序列信息Table 2 Genetic sequence information of Clk in various species for adaptive evolutionary analysis

表3 用于適應性進化分析的各物種Cry1基因序列信息Table 3 Genetic sequence information of Cry1 in various species for adaptive evolutionary analysis

1.5.2 構建系統發育樹

去除所有序列的終止密碼子，使用將獲取的節肢動物PcClk基因、PcCry1基因序列通過PRANK軟件進行密碼子比對[19]。使用Trimal軟件處理密碼子的比對結果后，刪除一些低質量或高變異度的序列區域，僅保留進化保守的區域用于后續分析[20]。使用IQ-TREE自動測試功能并選擇最佳替代模型，構建系統發育樹[21]。該系統發育樹同時也被用于后續構建選擇壓力分析的樹文件。

1.5.3 選擇壓力分析

使用PAML 4.9軟件包的CODEML程序計算ω值，使用位點模型、分支模型和分支位點模型進行進化分析[22]。

首先使用位點模型檢測PcClk基因和PcCry1基因在節肢動物數據集中受正選擇的位點，并比較Ma和Ma0，M0和M3，M1a和M2a，M7和M8，M8和M8a模型。接著，利用似然率檢測方法計算2ΔlnL值與自由度之間的卡方分布。然后，利用貝葉斯方法BEB (Bays Empirical Bays)計算位點的后驗概率(Posterior Probability，PP)，若后驗概率>0.8，則被認為是潛在的正選擇位點[23]。此外，使用Datamonkey中的FEL、SLAC和FUBRA檢測正選擇位點，設置FEL和SLAC顯著水平小于0.2，FUBAR后驗概率值大于0.8[24]。最后，整合PAML和Datamonkey篩選的正選擇位點，將同時被PAML和Datamonkey檢測到的位點視為顯著的正選擇位點，并標注在模擬的克氏原螯蝦PcClk基因和PcCry1基因的蛋白質三維結構中。

2 結果與分析

2.1 PcClk、PcCry1基因序列與蛋白結構特征

將PcClk核苷酸序列在NCBI公共數據庫中比對，發現其與其他物種的Clk核苷酸同源性相似度區間為68%-92%，其中與十足目通訊螯蝦(Pacifastacusleniusculus)的Clk基因最為相似，相似度為92%，氨基酸序列比對結果類似。同樣地，將PcCry1核苷酸序列在NCBI公共數據庫中進行比對后發現，其與其他物種的PcCry1核苷酸同源性相似度區間為73%-84%，其核苷酸序列與美洲海螯蝦(Homarusamericanus)的Cry1基因最為相似，而氨基酸序列比對結果顯示PcCRY1蛋白與美洲海螯蝦(Homarusamericanus)CRY2蛋白相似性最高，相似度為96%。

2.2 PcClk基因和PcCry1基因正選擇位點的定位

通過SWISS-MODEL網站預測得到克氏原螯蝦PcCLK和PcCRY1三級結構(圖1)，強烈正選擇位點在三級結構中的定位如圖1標記所示。圖中顯示PcCLK蛋白與模板4f3l.1.B蛋白的匹配度最高，序列相似度為54.60%；PcCRY1蛋白與模板7d1c.1.A匹配度最高，序列相似度為71.72%。

圖1 克氏原螯蝦PcCLK和PcCRY1蛋白質三維結構預測結果(標注為強烈正選擇位點)Fig.1 Three-dimensional structure prediction results of PcCLK and PcCRY1 proteins of Procambarus clarkii (The strongly positive selection sites were labeled)

2.3 多序列比對和系統發育分析

基于MEGA Ⅹ軟件鄰接法的系統發育分析顯示，PcCLK與甲殼類動物的CLK聚在一起，而PcCRY1與甲殼類動CRY1聚在一起(圖2)?？耸显rPcCLK與南美白對蝦(Penaeusvannamei)、羅氏沼蝦(Macrobrachiumrosenbergii)、等足目蟲(Eurydicepulchra)的CLK蛋白形成甲殼動物亞門分支；克氏原螯蝦PcCRY1與南美白對蝦、大型溞(Daphniamagna)、等足目蟲、歐洲沙蚤(Talitrussaltator)、中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)的CRY1蛋白形成甲殼動物亞門分支(圖2)。

圖2 基于鄰接法構建的PcCLK和PcCRY1及其同源蛋白的系統發育樹Fig.2 Phylogenetic trees of PcCLK and PcCRY1 and their homologous proteins based on neighbor-joining method

2.4 PcClk基因和PcCry1基因表達水平分析

在12 LD、不同溫度條件下，PcClk基因、PcCry1基因在腦、眼柄、肝胰腺中的mRNA表達情況如圖3所示。PcClk基因在腦、眼柄、肝胰腺中的mRNA表達基本保持24 h的振蕩規律。隨著溫度的升高，PcClk基因在腦、眼柄中的mRNA表達特征均發生變化，表現為振蕩波動增強、節律性更明顯，尤其在30℃條件下，PcClk的mRNA表達量整體上明顯上調。而在肝胰腺中，隨著溫度的升高，PcClk基因的mRNA表達波動減弱，節律性相對20℃時變得不明顯。同樣地，隨著溫度的升高，PcCry1基因在腦和眼柄中的mRNA表達振蕩特征均發生變化，波動增強，節律性更明顯。與PcClk基因類似的是，相對于20℃，25℃、30℃情況下PcCry1基因在肝胰腺中的mRNA表達趨于平緩，振蕩波動減弱，節律不明顯。

圖3 克氏原螯蝦PcClk基因[(a)-(c)]和PcCry1基因[(d)-(f)]在不同溫度、不同組織中的mRNA表達水平(12 LD)Fig.3 mRNA expression levels of PcClk [(a)-(c)] and PcCry1 [(d)-(f)] genes of Procambarus clarkii under different temperatures and in different tissues (12 LD)

在25℃、不同光照周期培養下，PcClk基因、PcCry1基因在腦、眼柄、肝胰腺中的mRNA表達情況如圖4所示。在12 LD的光照周期下，腦、眼柄、肝胰腺中PcClk基因的mRNA表達有一定的振蕩節律；而在24 LL和24 DD光照周期下，振蕩節律發生改變，尤其是眼柄中PcClk基因的mRNA表達表現出無振蕩節律。PcCry1基因的mRNA在腦和眼柄中的表達都基本遵循著一定的振蕩節律，在12 LD和24 LL光照周期下，PcCry1的表達量在白天緩慢堆積，在客觀夜晚期間達到峰值，隨后緩慢下降。而PcCry1基因的mRNA在肝胰腺的表達與腦、眼柄有所區別：在12 LD的光照周期下mRNA表達有一定的振蕩節律，但在24 LL和24 DD光照周期下振蕩波動減弱，節律不明顯。

2.5 克氏原螯蝦PcClk基因、PcCry1基因的適應性進化分析結果

2.5.1 系統發育關系

利用包括克氏原螯蝦在內的節肢動物PcClk基因和PcCry1基因序列，基于最大似然法構建系統發育樹。結果如圖5所示，PcClk基因和PcCry1基因的系統發育樹分為3個主要的進化枝：甲殼動物亞門進化枝(Crustacea clade)、六足動物亞門進化枝(Hexapoda clade)和螯肢動物亞門進化枝(Chelicerata clade)。

2.5.2 選擇壓力分析

為研究克氏原螯蝦PcClk基因和PcCry1基因是否受到正選擇作用，首先假設同一個基因的系統發育樹所有分支都有同一個ω值。PcClk基因和PcCry1基因one-ratio模型結果顯示，ω值分別為0.023和0.029，顯著小于1，表明該基因整體上受純化選擇作用(表4、表5)。Free-ratio模型假定系統發育樹上每一分支和節點都具有獨立的ω值，結果顯示free-ratio模型顯著優于one-ratio模型(P<0.05)，提示不同支系具有不同的進化速率。以克氏原螯蝦為前景枝，這兩個基因two-ratio模型擬合效果并沒有明顯優于one-ratio模型(P>0.05)，表明克氏原螯蝦PcClk基因、PcCry1基因與其他近緣甲殼動物有相似的進化速率(表4、表5)。其次，使用位點模型，發現這兩個基因的M1a模型和M2a模型、M7模型和M8a模型、M8模型和M8a模型之間均沒有顯著差異(P>0.05)，而PcClk基因的M0模型和M3模型有顯著差異(P<0.05)。最后，使用分支位點模型檢測PcClk基因、PcCry1基因，PcCry1基因的Ma模型優于Ma0模型(P<0.01)。

表4 分支模型、位點模型和分支位點模型對PcClk基因的選擇壓力分析Table 4 Selective pressure analysis of the PcClk gene based on branch model,site model and branch-site model

表5 分支模型、位點模型和分支位點模型對PcCry1基因的選擇壓力分析Table 5 Selective pressure analysis of the PcCry1 gene based on branch model,site model and branch-site model

續表5Continued table 5

通過PAML篩選，結果顯示PcClk基因沒有正選擇位點，而PcCry1基因中鑒定有121個正選擇位點(表6)。為得到更加精確的結果，進一步使用Datamonkey網站中的FEL、FUBAR和SLAC 3種方法檢測，共檢測到PcClk基因有2個正選擇位點，PcCry1基因有1個正選擇位點。最終，PcClk基因中的71，218位點可被FEL、SLAC同時檢測出來，而PcCry1基因中的63位點可被PAML、FEL、SLAC同時檢測出來，故這些正選擇位點被認為是強烈的正選擇位點(表6，幾種方法同時檢測出的正選擇位點以粗體加波浪線標注)。

表6 PcClk基因和PcCry1基因的正選擇位點Table 6 Positive selection sites detection of the PcClk and PcCry1 genes

3 討論

生物鐘是生物體對地球上環境因子周期變化長期適應而演變的內在調節機制[25]。本研究發現PcCry1基因的71與213位點受到強烈正選擇作用，該位點位于CLOCK蛋白的PAS結構域中。該功能結構域可介導CLOCK蛋白與另一個生物鐘基因的二聚體作用，對晝夜節律的產生和維持有一定作用，這與先前對其他甲殼類動物如羅氏沼蝦[26]的研究結果相似。PcCry1基因的63位點受到強烈正選擇作用，提示克氏原螯蝦可能通過增強自身的調節來適應外界環境的變化，這與李敬[27]發現鯨CRY蛋白對晝夜節律的調控有一定作用的研究結果一致。

迄今關于甲殼動物生物鐘基因表達的數據仍然很少。本研究中，在12 LD光照周期下，溫度升高，腦、眼柄中的PcClk基因和PcCry1基因mRNA表達增強，節律性更明顯，但兩個基因在肝胰腺中的mRNA表達量減弱，節律性不明顯。因此，推測克氏原螯蝦的PcClk基因和PcCry1基因都是由內源性節律驅動。腦作為核心生物鐘調控元件組織，在生物鐘基因調控中發揮中央指揮者的作用，其時鐘基因mRNA的表達最先受到調控;眼柄臨近腦組織，因此時鐘基因mRNA的表達相似;而外周組織器官離腦較遠，所以對節律性的保持沒有腦組織明顯。在對果蠅的研究中發現，Clk表達的節律性在腦中比在心臟中更明顯[28]，而在豌豆蚜(Acyrthosiphonpisum)和岡比亞瘧蚊(Anophelesgambiae)的研究中，Cry在各自的頭部存在更明顯的節律性表達[29]。這與本研究發現的克氏原螯蝦的生物鐘基因在腦中節律性更明顯的結果一致。

在溫度為25℃時，相對于24 LL和24 DD的光照周期，12 LD的光照周期下，克氏原螯蝦腦、眼柄、肝胰腺中PcClk基因的mRNA表達振蕩節律更明顯；同樣地，在25℃、12 LD培養模式下，腦和眼柄中PcCry1基因的mRNA表達節律性也較明顯。這可能是因為25℃、12 LD對克氏原螯蝦來說是適宜的溫度和光照，而適宜的溫度和光暗循環更有利于克氏原螯蝦PcClk和PcCry1基因節律性的保持。李龍[30]研究顯示光照的改變對斑馬魚生物鐘基因的調控有很大影響；蔡明岐[31]在研究光照和溫度對蚤狀溞(Daphniapulex)的影響時發現，在25℃且光照和黑暗比為8∶16時最有利于蚤狀溞生物鐘基因晝夜節律的保持，也最適合蚤狀溞生長；徐加元等[32]發現在適宜的溫度和光照周期下，適當延長光照周期可促進克氏原螯蝦雌蝦卵巢的發育，但過長的光照不僅不會促進雌蝦的性腺發育，反而會抑制其性腺發育。適宜的光照和溫度有利于克氏原螯蝦生物鐘基因的調節，而生物鐘調節的穩定對生物體健康狀況意義重大。本研究中，25℃、12 LD培養模式最有利于克氏原螯蝦PcClk和PcCry1基因節律性的保持，而生物鐘節律的穩定可以讓克氏原螯蝦保持更穩定的健康狀態。由此可見，在克氏原螯蝦的養殖過程中選擇合適的溫度和光照尤為重要。

4 結論

在溫度25℃、12 LD光照周期下，克氏原螯蝦腦中的PcClk和PcCry1的mRNA表達都呈現出一定的振蕩節律，說明PcClk基因和PcCry1基因是內源性的節律基因。選擇壓力分析顯示，通過PAML和Datamonkey共同篩選出的PcCLK正選擇位點為71與213，PcCRY1正選擇位點為63。這些位點在節肢動物CLK和CRY1蛋白進化中起重要作用，調控mRNA翻譯過程和蛋白質相互作用，可能參與節肢動物內在節律的調控。