鐵死亡相關lncRNA在神經(jīng)膠質(zhì)瘤的預后價值分析*

陳偉鴻，吳琪琪，周越菡

(桂林醫(yī)學院藥學院，廣西桂林 541199)

神經(jīng)膠質(zhì)瘤起源于神經(jīng)膠質(zhì)細胞，是最常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)原發(fā)性惡性腫瘤，占所有中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤的80%左右[1]。近年來，盡管神經(jīng)膠質(zhì)瘤的外科手術治療、靶向治療與免疫治療等治療方法取得了重大突破，但神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者的預后仍然較差[2,3]。隨著科學技術的不斷發(fā)展，神經(jīng)膠質(zhì)瘤的診斷與治療趨于基因和分子水平，尋找特異性的臨床標志物有助于神經(jīng)膠質(zhì)瘤的早期診斷和準確預后，為個體化治療提供了可能[4]。

鐵死亡是不同于自噬與調(diào)亡的新型細胞死亡方式，其依賴于細胞內(nèi)鐵離子與活性氧含量的變化，引起細胞脂質(zhì)過氧化，導致調(diào)節(jié)性細胞壞死[5]。Long non-coding RNA(lncRNA)是一類長度大于200個核苷酸、以缺少或者無開放閱讀框架為特征的RNA分子，是體內(nèi)重要的信號分子，調(diào)控基因的表達，參與各種生物調(diào)控過程如轉錄沉默、染色體修飾等，與腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉移等密切相關[6]。目前，國內(nèi)外對鐵死亡相關lncRNA的研究較少，有研究表明，LINC00618可以增加鐵離子與活性氧的水平并調(diào)控相關基因導致腫瘤細胞鐵死亡，同時改善抗腫瘤藥物的耐藥性，提示鐵死亡相關lncRNA在腫瘤治療中的重要性[7]。lncRNA可以在外泌體中選擇性地包裝、分泌和在細胞之間轉移，且外泌體能夠穿過血腦屏障(Blood-Brain Barrier，BBB)并調(diào)節(jié)神經(jīng)膠質(zhì)瘤增殖、侵襲、血管生成、免疫逃逸和治療抵抗等，展現(xiàn)lncRNA作為神經(jīng)膠質(zhì)瘤新型的生物標志物與潛在治療靶點的巨大潛力[8]。然而，通過鐵死亡相關lncRNA評估神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者預后與生存率的研究仍較少。

本研究將通過生物信息學方法，分析從癌癥基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas，TCGA)數(shù)據(jù)庫(https://portal.gdc.cancer.gov/)中獲得的神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者的轉錄組數(shù)據(jù)與臨床數(shù)據(jù)，借助基因共表達等方法尋找鐵死亡相關lncRNA，通過生存分析、獨立預后分析、受試者工作特征曲線(Receiver Operating Characteristic Curve，ROC Curve)、列線圖、基因富集分析(Gene Set Enrichment Analysis，GSEA)等方法，評估鐵死亡相關lncRNA在神經(jīng)膠質(zhì)瘤預后中的價值及臨床意義，通過TIMER、CIBERSORT、CIBERSORT-ABS等方法分析免疫浸潤情況，進一步對免疫功能、免疫檢查點以及N6-甲基腺苷(m6A)甲基化差異進行分析，為神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者的基因治療與靶向治療提供新策略。

1 材料與方法

1.1 獲得神經(jīng)膠質(zhì)瘤轉錄組數(shù)據(jù)與篩選鐵死亡相關lncRNA

從TCGA數(shù)據(jù)庫抽取698名神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者的轉錄組數(shù)據(jù)與臨床數(shù)據(jù)，通過FerrDB數(shù)據(jù)庫(http://www.zhounan.org/ferrdb/)獲得目前已知的259個鐵死亡基因，通過基因共表達的方法計算鐵死亡基因與lncRNA的關聯(lián)系數(shù)，根據(jù)|cor|>0.4，P-value<0.05進行初步篩選，再通過單因素Cox回歸分析結果再次篩選，得到預后相關的鐵死亡相關lncRNA，根據(jù)LASSO Cox回歸分析與鐵死亡相關lncRNA的表達情況計算每個樣本的風險評分，通過cytoscape 3.8.2軟件對上述結果繪制lncRNA-基因網(wǎng)絡圖。

1.2 風險評分獨立預后分析

將風險評分與臨床特征(年齡、性別、疾病分型)進行單因素獨立預后分析與多因素獨立預后分析，通過R軟件繪制森林圖，并通過繪制ROC曲線驗證觀察該模型預測患者生存情況的準確性，驗證獨立預后分析結果，繪制列線圖預測患者生存率。

1.3 高、低風險組生存分析

根據(jù)風險得分的中位值將698個樣本分為高風險組與低風險組，對高、低風險組結合臨床生存數(shù)據(jù)進行Kaplan-Meier生存分析，通過R軟件繪制生存曲線與風險曲線，繪制熱圖，對lncRNA在高、低風險組總的表達情況進行可視化。

1.4 高、低風險組基因富集分析

對高、低風險組神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者的基因表達矩陣進行基因ID轉換，通過GSEA 4.1.0軟件對高、低風險組進行基因富集分析，設置GSEA分析參數(shù)，得到GSEA結果后根據(jù)歸一化富集分數(shù)(Normalized Enrichment Score,NES)>1、名義上(Nominal,NOM)P<0.05，錯誤發(fā)現(xiàn)率(False Discovery Rate,FDR)q<0.25進行篩選。

1.5 高、低風險組免疫與m6A相關基因差異分析

從TIMER數(shù)據(jù)庫獲得TCGA數(shù)據(jù)庫免疫浸潤樣本，通過TIMER、CIBERSORT、CIBERSORT-ABS、QUANTISEQ、MCPCOUNTER、XCELL、EPIC等方法，分析包括B細胞、CD4+T細胞、CD8+T細胞等免疫細胞在高、低風險組神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者中的免疫浸潤情況，通過R軟件制作熱圖，對高、低風險組的免疫浸潤情況進行可視化分析，計算高、低風險組免疫功能、免疫檢查點、m6A相關基因的差異，通過R軟件繪制箱線圖進行可視化分析。

2 結果與分析

2.1 鐵死亡相關lncRNA的篩選

經(jīng)過初步篩選，通過基因共表達的方法獲得鐵死亡相關lncRNA共2 536個，再經(jīng)過單因素Cox回歸分析，共確定14個預后相關的鐵死亡相關lncRNA，繪制lncRNA-基因網(wǎng)絡圖(圖1)，該14個lncRNA(包括AC002116.2、LINC02100、LINC00900、AL441992.1、LINC01426、CYTOR、AP001486.2、LINC01503、MIR4435-2HG、OSMR-AS1、CRNDE、AC022613.1、AL133415.1、WAC-AS1)與94個鐵死亡基因有關聯(lián)，將這14個lncRNA作為后續(xù)的研究對象，對其在698個膠質(zhì)瘤樣本中的表達情況與LASSO Cox回歸分析結果進行風險評分。

圖1 14個鐵死亡相關lncRNA-基因網(wǎng)絡圖Fig.1 14 ferroptosis-related lncRNA-gene network map

2.2 風險評分獨立預后分析

風險評分與各種臨床特征進行單因素、多因素獨立預后分析，如圖2(a)、圖2(b)所示，P值均小于0.001，說明風險評分結果可以作為一個獨立的特征來預測神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者的預后。圖2(c)、圖2(d)的ROC曲線表明，風險評分的曲線下面積(Area Under the Curve，AUC)為0.882，高于年齡、性別、疾病分型這些臨床特征，表明風險評分相較于年齡、性別、疾病分型這些臨床特征，更可以預測患者疾病生存率，且風險評分1，2，3 a的ROC曲線中的AUC值均大于0.7，均可以有效預測患者生存率。根據(jù)以上結果，如圖2(e)所示，繪制列線圖來預測臨床中患者的生存率，若為53歲左右的G3期女性高風險患者，根據(jù)列線圖可以評分為196分，其對應的生存時間小于5 a的概率為0.873，小于3年的概率為0.614，小于1年的概率為0.157，可為臨床中預測患者的生存率提供參考。

圖2 風險評分預后分析結果Fig.2 Prognosic analysis results of risk scores

2.3 高、低風險組生存分析

根據(jù)風險評分的中位值將698個樣本分為高、低風險兩組，根據(jù)Kaplan-Meier生存分析，如圖3(a)所示，高風險組的生存率顯著低于低風險組，差異具有統(tǒng)計學意義。同時在風險曲線圖3(b)中可以看到，698個神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者中高風險組的患者死亡數(shù)更高，且AC002116.2、LINC02100、LINC00900、AL441992.1、LINC01426、CYTOR、LINC01503、MIR4435-2HG、OSMR-AS1、CRNDE、AC022613.1、AL133415.1在高風險組中的表達相對低風險組顯著升高，而AP001486.2、WAC-AS1在低風險組的表達相對高風險組顯著升高，且在高、低風險組中，年齡和性別均有顯著差異。

圖3 高、低風險組生存分析結果Fig.3 Survival analysis results of high and low risk groups

2.4 高、低風險組基因富集分析

高、低風險組的GSEA結果如圖4所示。高風險組中同種異體移植排斥、DNA復制、錯配修復等較低風險組顯著活躍[圖4:(a)-(c)]，而低風險組中長時程增強效應、磷脂酰肌醇信號系統(tǒng)、長時程抑制效應等較高風險組顯著活躍[圖4:(d)-(f)]。

(a)-(c)上調(diào)前三位；(d)-(f)下調(diào)前三位(a)-(c) The top three up-regulated;(d)-(f) The top three down-regulated圖4 基因富集分析結果Fig.4 Results of GSEA

2.5 高、低風險組免疫及m6A相關基因的差異

基于TIMER、CIBERSORT、CIBERSORT-ABS、QUANTISEQ、MCPCOUNTER、XCELL、EPIC等方法，高、低風險組的免疫浸潤如圖5所示，在免疫功能上高、低風險組的免疫檢查點(Check-point)、趨化因子受體(C-C Chemokine Receptor，CCR)、人類白細胞抗原(Human Leukocyte Antigen，HLA)等均具有顯著差異，考慮高、低風險組在免疫檢查點上有顯著差異，對免疫檢查點作進一步分析，可以觀察到免疫檢查點PDCD-1(即PD-1)、CD44、CTLA4等在高、低風險組均具有顯著差異，且大部分的免疫檢查點在高風險組中顯著高于低風險組。m6A相關基因FTO、ALKBH5、METTL14、METTL3、HNRNPC、WTAP、YTHDF2、RBM15、YTHDC1、YTHDF1、ZC3H13、YTHDC2的表達在高、低風險組中也具有顯著差異。

圖5 高、低風險組免疫及m6A相關基因的差異Fig.5 Differences of immunity and m6A related genes in the high and low risk groups

3 討論

神經(jīng)膠質(zhì)瘤是一種惡性程度極高、侵襲性極強的惡性腫瘤，目前的治療手段仍無法根治，且不同的患者其預后也不相同。隨著腫瘤的基因治療與免疫治療的不斷發(fā)展，目前迫切需要尋找新的生物標志物協(xié)助臨床醫(yī)生完善神經(jīng)膠質(zhì)瘤的治療方案。生物信息學是信息技術與生物醫(yī)藥交叉融合發(fā)展的學科，應用生物信息學方法，對生物學數(shù)據(jù)進行分析，研究其生物過程[9]，同時可預測有效的治療靶點，指導疾病的診斷、治療、預后等，對藥物的研發(fā)、個體化治療有重大意義[10]。

腫瘤研究的主要挑戰(zhàn)之一是如何有效殺死腫瘤細胞，同時不影響正常細胞。腫瘤細胞為了促進生長，與正常細胞相比，腫瘤細胞內(nèi)鐵的需求增加，這種鐵依賴性的特性會使腫瘤細胞更容易受到鐵催化的壞死，引起腫瘤細胞鐵死亡，同時增敏化學治療藥物，減少耐藥，提示鐵死亡作用機制在治療腫瘤領域的巨大潛力[11]。lncRNA雖然不編碼蛋白質(zhì)，但是在生物體內(nèi)可以與某些miRNA結合，作為競爭內(nèi)源性RNA調(diào)控相關基因的表達，參與生物體內(nèi)各項生物過程[12]。近年來，有研究報道lncRNA可以通過影響鐵死亡相關的p53信號通路，抑制鐵死亡相關基因SLC7A11的表達來促進腫瘤細胞鐵死亡[13]，進一步表明lncRNA對調(diào)控腫瘤細胞鐵死亡有重要作用。lncRNA在多種癌癥診斷、預后與治療中有非常重要的意義，有研究表明lncRNA與神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者的腫瘤大小、WHO分級和預后相關，并且提出lncRNA可以作為神經(jīng)膠質(zhì)瘤臨床診斷、治療和預后的潛在分子生物標志物[14]。因此，本研究旨在研究鐵死亡相關lncRNA在神經(jīng)膠質(zhì)瘤預后中的價值及臨床意義。

本研究通過生物信息學的分析方法共篩選出14個鐵死亡相關lncRNA，包括AC002116.2、LINC02100、LINC00900、AL441992.1、LINC01426、CYTOR、AP001486.2、LINC01503、MIR4435-2HG、OSMR-AS1、CRNDE、AC022613.1、AL133415.1、WAC-AS1，它們在高、低風險組中的表達均有差異。除AP001486.2、WAC-AS1外，其余12個lncRNA在高風險組中的表達顯著高于低風險組。已有研究表明CRNDE、CYTOR可作為腫瘤患者的預后生物標志物[15,16]，本研究結果與現(xiàn)有研究結果相符，證明通過生物信息學方法篩選出的14個lncRNA作為預后生物標志物的可靠性。

為了進一步探討篩選出來的14個lncRNA在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中預后的臨床意義，本研究通過單因素與多因素Cox分析，得到的風險評分可作為獨立的預后因子，與年齡、疾病分型相同，可以評估患者預后情況，ROC曲線驗證獨立預后分析的結果，同時繪制列線圖可預測臨床中神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者的生存率。Kaplan-Meier生存曲線與風險曲線進一步驗證篩選出來的14個lncRNA在神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者中的預后價值，高風險組的患者表現(xiàn)出較低的生存率，低風險組的患者表現(xiàn)出較高的生存率，兩者之間的差異具有統(tǒng)計學意義。最后通過基因富集分析，研究高、低風險組的患者其生物學功能與相關信號通路的差異，發(fā)現(xiàn)高風險組中同種異體移植排斥、DNA復制、錯配修復等顯著活躍，而低風險組磷脂酰肌醇信號系統(tǒng)顯著活躍。考慮到磷脂酰肌醇信號系統(tǒng)涉及廣泛的細胞過程，包括生長、代謝、分化、增殖等，且與免疫細胞的正常功能和分化有著重要關系[17]，本研究進一步對高、低風險組患者中免疫相關的差異進行分析。

腫瘤浸潤免疫細胞是促進和調(diào)節(jié)腫瘤發(fā)展和生長的復雜微環(huán)境的重要部分，影響著腫瘤的診斷、生存和臨床治療敏感性等，近年來在中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤中浸潤免疫細胞取得了重要進展，有研究表明巨噬細胞、淋巴細胞(特別是T細胞和NK細胞，以及較少見的B細胞)對中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的浸潤程度顯著[18]。本研究通過不同的免疫浸潤分析方法分析高、低風險組的免疫浸潤情況，高風險組的免疫浸潤程度較低風險組顯著。進一步對高、低風險組的免疫功能進行比較，高風險組的免疫檢查點(Check-point)、趨化因子受體(CCR)、人類白細胞抗原(HLA)等免疫功能均顯著高于低風險組，考慮到高、低風險組存在顯著差異，且近年來免疫檢查點抑制劑對腫瘤治療的重要性，本研究進一步分析高、低風險組免疫檢查點的差異。

免疫檢查點是在免疫應答過程中，調(diào)節(jié)T細胞受體抗原識別的共刺激或者抑制信號，在正常生理條件下，免疫檢查點可以調(diào)節(jié)免疫功能，防止機體免疫功能過度活化，避免自身免疫性疾病的發(fā)生。但免疫檢查點過度表達時，免疫功能就會受到抑制；反之，當免疫檢查點表達下降時，機體的免疫功能也會異常。腫瘤細胞可以影響免疫檢查點，使得抗原不能有效被提呈，機體免疫功能不能被有效激活，從而抑制免疫細胞的功能，起到免疫逃逸的作用[19]。目前,臨床中已出現(xiàn)取得較好治療效果的免疫檢查點抑制劑，如PD-1單克隆抗體、CTLA-4抗體等，可以解除腫瘤細胞對免疫檢查點的作用，激活機體的免疫系統(tǒng)，有效殺傷腫瘤細胞[20]。通過對高、低風險組免疫檢查點的差異進行分析，發(fā)現(xiàn)PDCD-1(即PD-1)、CD44、CTLA-4等均有顯著差異，且高風險組中大部分的免疫檢查點顯著高于低風險組。

RNA甲基化是一種可逆的RNA轉錄后修飾，對許多生物過程有重大的影響。m6A被認為是最常見的真核細胞mRNA甲基化修飾類型之一，存在于多種生物體中。m6A甲基化在大腦的不同發(fā)育階段控制神經(jīng)干細胞的發(fā)育及其向神經(jīng)元、膠質(zhì)細胞(如少突膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞)的分化[21]。有研究表明，m6A修飾可以通過多種機制在膠質(zhì)瘤中發(fā)揮關鍵作用，為膠質(zhì)瘤的早期診斷、靶向治療、改善患者預后提供更多可能，具有重要的臨床意義[22]。因此,本研究對高、低風險組中m6A甲基化相關基因的差異作進一步分析，發(fā)現(xiàn)高、低風險組中FTO、ALKBH5、METTL14、METTL3、HNRNPC、WTAP、YTHDF2、RBM15、YTHDC1、YTHDF1、ZC3H13、YTHDC2均有顯著差異，提示靶向上述基因m6A甲基化的基因治療可為神經(jīng)膠質(zhì)瘤的治療提供新策略。

4 結論

根據(jù)篩選出的14個鐵死亡相關lncRNA在樣本中的表達情況與LASSO Cox回歸分析結果進行風險評分，將樣本分為高風險組與低風險組，高、低風險組的生存曲線、風險曲線等均具有顯著差異，風險評分結果可作為獨立預后因素，提示上述鐵死亡相關lncRNA可以作為神經(jīng)膠質(zhì)瘤新的生物標志分子。此外，本研究對高、低風險組免疫浸潤、免疫功能、免疫檢查點、m6A甲基化的差異進行了探討，為神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者的基因治療與免疫治療提供了有價值的參考。