真核細胞延伸因子2激酶（eEF2K）在膠質母細胞瘤發病機制中的作用

岑麗蘭　周欣鴻　顧倩　陸海善　田喆　楊茜

【摘要】目的膠質母細胞瘤（glioblastoma，GBM）具有高度的異質性和侵略性。真核細胞延伸因子2激酶（eEF2K）在多種腫瘤中均過表達，但其在GBM中的作用尚不清楚。本研究基于腫瘤基因組圖譜（TCGA）數據庫中的數據，旨在闡明eEF2K與GBM的關系。方法通過TCGA數據庫用Wilcoxon檢驗和配對檢驗了解eEF2K在GBM和正常組織中eEF2K的表達水平。制作受試者工作特征（ROC）曲線，利用曲線下面積（AUC值）評價eEF2K作為二元分類法的價值。Cox回歸分析和Kaplan-Meier曲線用于評估eEF2K mRNA表達與預后的相關性。基因集富集分析（GSEA）被用于闡明eEF2K在GBM中的生物學功能。結果與正常組織相比，eEF2K在GBM組織中的表達顯著升高（P<0.001）。ROC曲線顯示eEF2K對GBM的診斷能力較低（AUC=0.697）。Kaplan-Meier生存分析顯示eEF2K高表達與GBM患者預后無關。GSEA發現eEF2K的表達與G-alpha（s）信號通路、亨廷頓病（Huntington disease）、阿爾茲海默病（Alzheimer's disease， AD）、TP53調節代謝基因、線粒體中的電子傳輸鏈、反應性生物氧化有關，而ssGSEA顯示eEF2K的表達與多種免疫細胞浸潤水平有關。結論eEF2K在GBM中上調并不能作為預后不良的生物標志，但是參與GBM中多種免疫細胞浸潤。此外，eEF2K在GBM中的生物學功能可能與G-alpha（s）、TP53調節代謝基因、線粒體中的電子傳輸鏈、反應性生物氧化有關。這些發現有助于闡明eEF2K在腫瘤發生中的作用，為進一步研究奠定基礎。

【關鍵詞】真核細胞延伸因子2激酶;膠質母細胞瘤;免疫細胞浸潤;預后;泛癌分析

中圖分類號：R739.41文獻標志碼：ADOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2022.05.002

Role of eukaryotic elongation factor 2 kinase （eEF2K）

in the pathogenesis of glioblastoma

CEN Lilan ZHOU Xinhong GU Qian LU Haishan TIAN Zhe YANG Qian

（1. Center for Clinical Pathology Diagnosis and Research， Youjiang Medical University for Nationalities，

2. Department of Clinical Pathology， Affiliated Hospital of Youjiang Medical University for Nationalities，

3. College of Basic Medicine， Youjiang Medical University for Nationalities， 4. Neuroscience Research

Laboratory， Affiliated Hospital of Youjiang Medical University for Nationalities， Baise 533000， Guangxi， China）

【Abstract】ObjectiveGlioblastoma （GBM） is highly heterogeneous and aggressive， and eukaryotic elongation factor 2 kinase （eEF2K） is overexpressed in a variety of tumors， but its role in GBM is unknown. This study aimed to elucidate relationship between eEF2K and GBM based on data from The Cancer Genome Atlas （TCGA） database. MethodsThe expression levels of eEF2K in GBM and normal tissues were studied by Wilcoxon test and pairing test through TCGA database. Receiver operating characteristic （ROC） curve was used to evaluate the value of eEF2K as a binary classification method. Cox regression analysis and Kaplan Meier curve were used to evaluate correlation between eEF2K mRNA expression and prognosis. In addition， gene set enrichment analysis （GSEA） was used to clarify the biological function of eEF2K in GBM. ResultsCompared with normal tissues， the expression of eEF2K in GBM tissues was significantly higher （P<0.001）. ROC curve showed that eEF2K had low diagnostic ability for GBM （AUC=0.697）. Kaplan Meier survival analysis showed that the high expression of eEF2K was not related to the prognosis of GBM patients. Meanwhile， GSEA found that the expression of eEF2K was related to G-alpha （s） signal pathway， Huntington disease， Alzheimer's disease（AD）， TP53 regulates metabolic genes， electron transport chain in mitochondria， and reactive biological oxidation， while ssGSEA showed that the expression of eEF2K was related to various levels of immune cell infiltration. ConclusionThe up-regulation of eEF2K in GBM can not be used as a biomarker of poor prognosis， but it involves in a variety of immune cell infiltration in GBM. In addition， the biological function of eEF2K in GBM may be related to G-alpha （s）， Tp53 regulates metabolic genes， electron transport chain in mitochondria， and reactive biological oxidations. These findings help to clarify the role of eEF2K in tumorigenesis and lay a foundation for further research.9860FF2B-6653-4F43-81A5-22CFDB094EDF

【Key words】eEF2K; glioblastoma; immune cell infiltration; prognosis; pan-cancer analysis

膠質母細胞瘤（glioblastoma，GBM）是成人原發性腦腫瘤中最常見的惡性腫瘤之一。盡管目前有可用的治療方法，但預后不佳，1年生存率為35.7%，5年生存率為4.7%，總生存期為14.6個月，平均生存期低于20個月[1～2]。目前治療GBM患者的傳統方法是手術切除腫瘤（在可能的情況下），同時進行放療和替莫唑胺（TMZ）化療，然后輔以替莫唑胺[3]。新出現的免疫療法在治療方案上取得一定進展，但由于缺乏共同表達的分子靶點和有效的靶向治療，患者的生存并未得到實質性改善。因此，為了開發高效的分子靶向治療方法，迫切需要更好地了解GBM的生物學機制，尋找新的治療靶點。

鈣/鈣調蛋白依賴性蛋白激酶Ⅲ（Ca²⁺/calmodulin-dependent protein kinases Ⅲ），也被稱之為真核細胞延長因子2激酶（eukaryotic elongation factor-2 kinase，eEF2K），是一種控制蛋白質的關鍵酶，在膠質瘤和其他幾種類型的人類癌癥中表達上調[3～4]。通過不同的途徑和機制，發現eEF2K的活性與腫瘤細胞的增殖有關，在幾種類型的惡性腫瘤中檢測到eEF2K的高表達水平[5～6]。此外發現TMZ聯合eEF2K抑制劑可以使GBM患者獲得更好的治療效果[3]，所以我們認為eEF2K可能是GBM新的治療靶點。

本研究使用來自基于腫瘤基因組圖譜（TCGA）數據庫的數據，我們試圖證明 eEF2K與GBM之間的相關性，確定eEF2K在GBM腫瘤組織中表達情況。此外，我們進行預后和臨床相關性研究，以探索eEF2K的潛在診斷和預后價值;并通過富集分析和免疫浸潤相關分析確定eEF2K的生物學意義。

1 材料與方法

1.1 eEF2K單基因表達差異分析所有癌癥類型包括腎上腺皮質癌（ACC）、膀胱尿路上皮癌（BLCA）、乳腺浸潤癌（BRCA）、宮頸鱗癌和腺癌（CESC）、膽管癌（CHOL）、結腸癌（COAD）、彌漫性大B細胞淋巴瘤（DLBC）、食管癌（ESCA）、多形性成膠質細胞瘤（GBM）、頭頸鱗狀細胞癌（HNSC）、腎嫌色細胞癌（KICH）、腎透明細胞癌（KIRC）、腎乳頭狀細胞癌（KIRP）、急性髓細胞樣白血病（LAML）、腦低級別膠質瘤（LGG）、肝細胞癌（LIHC）、肺腺癌（LUAD）、肺鱗癌（LUSC）、間皮瘤（MESO）、卵巢漿液性囊腺癌（OV）、胰腺癌（PAAD）、嗜鉻細胞瘤和副神經節瘤（PCPG）、前列腺癌（PRAD）、直腸腺癌（READ）、肉瘤（SARC）、皮膚黑色素瘤（SKCM）、胃癌（STAD）、睪丸癌（TGCT）、甲狀腺癌（THCA）、胸腺癌（THYM）、子宮內膜癌（UCEC）、子宮肉瘤（UCS）和葡萄膜黑色素瘤（UVM）。為了分析eEF2K在以上癌癥和鄰近組織中表達差異，我們使用UCSC XENA （https：//xenabrowser.net/datapages/）網站下載TCGA和基因型-組織表達（genotype-tissue expression， GTEx）的TPM （transcripts per million reads）格式的RNAseq（RNA sequencing）數據，樣本數共15 776個。將TPM格式的RNAseq數據進行log2轉化后通過Mann-Whitney U 檢驗比較分析。從中提取TCGA的GBM和GTEx中對應的正常組織數據并繪制受試者工作特征（ROC）曲線。運行R 語言（3.6.3版本） 加載ggplot2包（3.3.3版本）[7]和pROC包（1.17.0.1版本）用于可視化分析。

1.2 eEF2K在GBM患者中的預后分析GBM樣品的RNA測序結果以及臨床數據來自TCGA數據庫（https：//portal.gdc.cancer.gov/）和來自于Cell的文章的數據作為補充數據[8]。將數據進行篩選：剔除對照組以及不含有臨床信息的數據。采用Cox回歸分析eEF2K與GBM患者中總體生存率（overall survival，OS）、疾病特異性生存率（disease specific survival，DDS）和無進展間期（progress free interval，PFI）的關系，通過Kaplan-Meier曲線表示GBM患者eEF2K高低表達之間的生存情況。運行R語言軟件（3.6.3版本）加載survminer包（0.4.9版本）用于可視化;加載survival包（3.2-10版本）用于生存資料的統計分析。

1.3 GBM患者中與eEF2K相關的差異表達基因（differentially expressed genes， DEGs）在R語言軟件（3.6.3版本）加載DESeq2包（1.26.0版本）處理TCGA GBM項目中 level 3 HTSeq-Counts格式的RNAseq數據，去除對照/正常組。根據eEF2K基因的表達中位值，將樣本分為eEF2K高表達組和eEF2K低表達組。對數倍變化的絕對值|log2（FC）|>1.5和調整后的P值（p.adj）<0.05被認為是DEGs的閾值。設置差異倍數、生成差異分析結果后利用ggplot2（3.3.3版本）繪制火山圖。

1.4 基因本體注釋（GO）分析Enrichr （https：//maayanlab.cloud/Enrichr/）是基于網頁端的綜合性的基因集富集工具[9]。本研究利用Enrichr軟件對eEF2K相關DEGs進行GO分析。基于Enrichr在線工具，將涉及的生物過程（biological process，BP）、細胞成分（cellular component，CC）和分子功能（molecular function，MF）類別的GO術語按P值排序。9860FF2B-6653-4F43-81A5-22CFDB094EDF

1.5 基因集富集分析（gene set enrichment analysis， GSEA）GSEA用來評估一個預先定義的一組基因在兩種生物狀態之間是否表現出統計學上顯著的一致性差異[10]。在這項研究中，使用R語言包Cluster Profiler[11]進行GSEA可視化，以闡明eEF2K高表達組和低表達組之間的顯著功能和途徑差異。每個分析程序重復1000次。參考基因集合：c2.cp.v7.2.symbols.gmt（Curated），基因集數據庫來自MSigDB Collections。P<0.05且偽發現率（false discovery rate， FDR）<0.25的功能或途徑被認為具有統計學意義的富集。

1.6 免疫浸潤細胞與eEF2K表達的相關性分析通過R語言軟件 （3.6.3版本）加載GSVA包（1.34.0版本）利用ssGSEA（single-sample gene set enrichment analysis）免疫浸潤算法得出數據。采用Wilcoxon秩和檢驗和Pearson相關分析，評價免疫細胞浸潤與不同eEF2K mRNA表達組之間的關系。用TIMER軟件驗證不同eEF2K mRNA表達水平與TCGA數據庫中GBM免疫細胞浸潤的相關性。

1.7 統計學方法所有統計分析和繪圖均使用R語言軟件（3.6.3版）進行。Mann-Whitney U檢驗（Wilcoxon rank sum test）用于eEF2K在泛癌中的表達情況。Wilcoxon秩和檢驗和Wilcoxon符號秩檢驗分別用于分析eEF2K在非配對樣本中的表達。使用 pROC 包生成 ROC 曲線以評估 eEF2K 表達的診斷性能。使用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，并通過對數秩檢驗評估組間差異。使用Spearman檢驗分析eEF2K與免疫細胞的關系。檢驗水準：α=0.05，雙側檢驗。

2 結果

2.1 eEF2K在GBM中表達上調為了評估人類癌癥中的eEF2K mRNA表達，我們使用來自TCGA的泛癌RNAseq數據檢查eEF2K mRNA表達（表1）。得出了33種腫瘤（包括GBM在內）與鄰近正常組織之間eEF2K mRNA的差異表達情況（圖1A）。TCGA數據庫中除了ACC、OV、PCPG表達無差異外，SARC的正常組織例數僅為2例，無法進行客觀的比較，其他腫瘤類型的 eEF2K mRNA 表達均存在差異。CHOL、DLBC、ESCA、GBM、HNSC、KIRC、KIRP、LAML、LGG、LIHC、 PAAD、STAD、TGCT、THYM表達均顯著高于正常組織; BLCA、BRCA、CESC、COAD、KICH、LUAD、LUSC、PRAD、READ、SKCM、THCA、UCEC、UCS表達均顯著低于正常組織。通過泛癌分析提示GBM患者中eEF2K mRNA顯著高于鄰近正常組織。我們進一步通過非配對標本分析，GBM組eEF2K mRNA的表達高于鄰近正常組織（圖1B）。ROC曲線顯示GBM中eEF2K mRNA的表達為0.697（95% CI：0.665～0.729）（圖1C），eEF2K的最佳截斷值為2.455（TPM）。

2.2 eEF2K表達與GBM預后無關為了探討eEF2K是否影響GBM患者的預后，我們通過Kaplan-Meier 曲線進行生存分析，如圖2A～C所示，eEF2K高表達（n=84，紅色）和低表達（n=84，藍色）與GBM患者的OS，eEF2K高表達（n=77）和低表達（n=78）的DSS、eEF2K高表達（n=84）和低表達（n=84）的PFI預后無相關性。

2.3 DEGs鑒定與eEF2K相關的37 832個基因我們對膠質瘤中與eEF2K相關的基因的進行DEGs。共鑒定了37 832個與eEF2K表達相關的基因，鑒定出滿足|log2（FC）|>1.5 & p.adj<0.05閾值的ID有357個，在這閾值下，上調基因（logFC為正）的數目有5個，下調基因（logFC為負）的數目有352個， 在熱圖和火山圖中顯示了DEGs的表達（圖3A、B）。

2.4 預測與eEF2K高、低表達的相關信號通路利用GO分析對GBM患者共表達的功能進行預測。在生物過程（BP）、細胞成分（CC）和分子功能（MF）組中， BP中GO術語前10的條目是CD4⁺αβT細胞增殖的負調節、維A酸受體信號通路、αβT細胞增殖的負調控、CD4⁺αβT細胞增殖的調節、CD4⁺αβT細胞活化的負性調節、鈉離子穩態、單價無機陽離子穩態、干擾素-γ產生的負調控、金屬離子的穩態、對維A酸的反應（圖4A）。CC中GO術語中P值排序靠前的條目是鈉通道復合物、陽離子通道復合物（圖4B）。MF中GO術語中P值排序靠前的條目是配體門控鈉通道活性、MAP激酶活性、蛋白質絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸激酶活性、WW結構域綁定、鈉通道活性、配體門控陽離子通道活性（圖4C）。我們還進行了GSEA分析，以確定與eEF2K相關的關鍵通路和疾病。由于文章篇幅有限，按照降序選取前19個滿足FDR<0.25，P<0.05標準的數據集，并結合相關文章報道利用GSEA分析，從中挑選六條最豐富的通路和相關疾病，包括G-α（s）信號通路（圖4D），Huntington病（圖4E），阿爾茨海默病（圖4F）， TP53調節代謝基因（圖4G），線粒體中的電子傳輸鏈（圖4H），反應組生物氧化（圖4I）。

2.5 eEF2K表達與免疫浸潤有關GO和GSEA富集分析提示eEF2K可能參與腫瘤免疫反應。我們進一步應用ssGSEA分析了eEF2K mRNA表達與免疫細胞浸潤水平的關系，詳細的分析結果見表2。免疫細胞浸潤與eEF2K mRNA表達的相關性如圖5A所示。結果表明，eEF2K mRNA表達與Tem cells、NK cells、Tgd cells、Tcm cells、輔助性T cells和Th2 cells浸潤呈正相關（圖5B～G）。eEF2K mRNA表達與細胞毒性T細胞、T cells和B cells浸潤呈負相關（圖5H～J）。9860FF2B-6653-4F43-81A5-22CFDB094EDF

3 討論

我們通過TCGA數據庫發現eEF2K在多種腫瘤組織中表達存在差異，eEF2K在胃癌、胰腺癌、食管癌、肝癌和腦腫瘤（多形性膠質母細胞瘤）等多種實體癌中表達上調[4，6，12～14]，在結直腸癌中，eEF2K的mRNA和蛋白質水平均顯著下調[15]。文章還揭示了eEF2K參與腫瘤的增殖、侵襲、浸潤和生長[5]。不僅如此，其還參與多種疾病狀態的調節，包括心血管、神經系統疾病及其他癌癥[16]。eEF2K似乎在腫瘤中充當了雙重作用，既可以有助于體內腫瘤的生長，又可以抑制腫瘤的發生。我們的分析證實了這一點，我們發現eEF2K在TCGA各腫瘤類型中既有高表達，也存在低表達。這些結果表明，eEF2K可能參與了多種癌癥的發生、發展。

結合TCGA數據庫中結果顯示，eEF2K在GBM組織中的表達高于正常組織，與非配對樣本分析中基因表達水平一致。eEF2K在膠質瘤細胞誘導自噬中起著關鍵作用，通過沉默BECN1來抑制eEF2K介導的自噬，可以顯著提高抗癌藥物對膠質瘤細胞的療效[17]。抑制自噬顯著降低了在營養耗竭條件下GBM瘤細胞的生長活力[4]。LIU等人[3]通過在膠質瘤模型中加用eEF2K抑制劑NH125，發現抑制eEF2K可增強TMZ對膠質瘤細胞生長、增殖、遷移和侵襲的抑制作用。此外我們還發現，eEF2K的表達可以作為GBM的診斷標志，其AUC（area under curve）為0.697。但基于目前關于eEF2K在GBM腫瘤中的研究甚少，其作用機制暫不清楚。

研究表明eEF2K與多種腫瘤生存預后有關，目前人們把eEF2K看成多種腫瘤預后不良的生物標志物和靶向治療的潛在新的分子靶點[18]。其高表達與肺癌患者總體生存期較短有關[5]。而在結直腸癌中，eEF2K陰性組的患者總體存活率明顯低于eEF2K陽性組[15]。因此，我們猜想eEF2K在GBM腫瘤中表達上調，是否可以作為GBM患者生存不良的潛在預后指標。但是令人失望的是，從TCGA數據庫中得出結論，eEF2K表達與GBM患者預后無關。eEF2K mRNA的表達與GBM患者的OS、DSS、PFI預后無關。這種無差異性可能基于TCGA中GBM患者的種群、地域性差異以及病例數過少引起，也許需要更大的樣本量來驗證上述結論。雖然我們的結論沒有支持eEF2K表達與GBM患者預后有關，但不排除其可能參與GBM的細胞生長、增殖、遷移和侵襲的抑制作用。

GSEA分析發現，eEF2K的表達與Galpha（s）信號、亨廷頓病、阿爾茲海默病、TP53調節代謝基因、線粒體中的電子傳輸鏈、生物氧化反應等有關。因此，我們的研究為理解eEF2K在腫瘤發病機制中的潛在作用提供了見解，并證明了它作為潛在的神經退行性疾病生物標志物的用途。這也與以往的研究一致，以往的研究發現，eEF2K不僅可能參與多種生物學功能，如細胞增殖、遷移和侵襲[5]，還可以調節一些神經系統疾病的記憶缺陷，例如AD[19～20]。我們的研究也提示eEF2K與AD、亨廷頓病有關，可能因為兩者都存在共同癥狀記憶障礙現象，但目前具體作用機制還需要我們進一步探討。GBM中最常見的基因突變是EGFR（epidermal growth factor receptor）、PTEN（gene of phosphate and tension homology deleted on chromosome ten）、TP53、TERT（telomerase reverse transcriptase）或RB1（Rb gene1）基因等，TP53也被確定為低級別星形細胞瘤和繼發性膠質母細胞瘤的標志物[21]。抑制TP53 GOF（gain of function）突變可以抑制GBM的炎癥[22]，而且TP53和PTEN的聯合缺失導致eEF2K的乳腺癌（breast cancer，BC）加速發展[22]。有趣的是，在GBM中，TP53突變也與免疫浸潤增加有關[21]。

在腫瘤微環境中，免疫系統不僅保護宿主不受腫瘤發展的影響，而且還可以通過塑造和選擇免疫原性降低腫瘤逃逸變體來促進腫瘤的生長[23]。GBM進展過程中受損的血腦屏障允許免疫細胞從血液進入，誘導星形膠質細胞激活，從而促進神經炎癥[24]。而在生理條件下，免疫細胞透過血腦屏障是有限的[25]。我們試圖研究eEF2K與GBM免疫及24種免疫細胞的浸潤水平關系，eEF2K的表達增加與GBM中Tem、NK cells、Tgd、Tcm、T helper cells、Th2 cell浸潤呈正相關，與Cytotoxic cells、T cells和B cells浸潤呈負相關。近年來，免疫治療成為包括GBM腫瘤在內的顱內腫瘤疾病很有前景的治療方法[26]。目前腫瘤免疫治療的方法包括NK細胞的免疫療法[25]和T細胞療法[27]。研究表明，T細胞活化和浸潤是抗腫瘤免疫的關鍵步驟[28]。GBM通過觸發T細胞功能障礙來破壞腫瘤免疫反應，導致T細胞老化、耐受、無力和衰竭[29]。先前的研究發現，Th2細胞的浸潤與多種腫瘤的免疫抑制和生存不良有關[30]。Th2介導的免疫抑制降低了保護性細胞免疫，并與腫瘤進展有關，在本研究中，eEF2K表達增加會導致Th2細胞浸潤增強，提示eEF2K可能有助于介導GBM的免疫逃逸。在GBM患者的腫瘤組織和外周血中增加的Tgd細胞調節GBM的發展[31]。因此，我們推測eEF2K可能通過調節GBM中的免疫浸潤來影響患者的預后。

雖然這項研究可以為我們對eEF2K與GBM之間的相關性提供新的見解，但也存在一些局限性。首先，只評估了一個數據集，這可能會導致樣本偏差。其次，為了增加研究結果的可信度，應進一步擴大樣本量。第三，為了提高臨床應用水平，還應考慮更多的臨床因素。第四，缺乏體外實驗和活體實驗，我們的結果還需要進一步的實驗驗證。為了進一步研究eEF2K在GBM中的作用機制，我們應在不久的將來進行體內外研究實驗。9860FF2B-6653-4F43-81A5-22CFDB094EDF

綜上所述，eEF2K mRNA在GBM中高表達，本研究雖然沒有揭示eEF2K在GBM中的預后價值。但我們的研究結果表明，eEF2K可能通過促進多種免疫細胞的浸潤，調節腫瘤細胞的腫瘤微環境，抑制獲得性免疫，從而發揮致癌作用。本研究表明eEF2K可作為GBM診斷的潛在生物標志物，并強調它是一個潛在的免疫治療靶點。參考文獻[1] BRANDAO M，SIMON T，CRITCHLEY G，et al.Astrocytes，the rising stars of the glioblastoma microenvironment[J].Glia，2019，67（5）：779-790.

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（收稿日期：2021-11-03修回日期：2022-03-17）

（編輯：梁明佩）9860FF2B-6653-4F43-81A5-22CFDB094EDF