16S rRNA在常見致病分枝桿菌菌種鑒定中的應用*

紀凌云,李馬超,蔣 毅,趙秀芹,萬康林,王琳琳,劉海燦△

1.同濟大學附屬東方醫院南院檢驗科,上海 200120；2.中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所/傳染病預防控制國家重點實驗室，北京 102206;3.同濟大學附屬東方醫院門診護理部,上海 200120

非結核分枝桿菌(NTM)指除結核分枝桿菌復合群(包括結核分枝桿菌、牛分枝桿菌、非洲分枝桿菌和田鼠分枝桿菌)和麻風分枝桿菌以外的所有其他分枝桿菌屬,該菌廣泛存在于水、土壤和灰塵等自然環境中,為條件致病菌,至今已發現150余種,大約有50種能引起人類疾病[1]。目前研究者對已知分枝桿菌的16S rRNA基因已經全部測序，通過基因比較分析，發現分枝桿菌16S rRNA基因既含有屬特異的保守序列，又含有種特異性的高變區。以16S rRNA基因為靶基因，采用PCR測序方法，通過序列的分析可以鑒定分枝桿菌。本研究結合美國國家生物技術信息中心(NCBI)基因庫現有的55株常見致病性分枝桿菌16S rRNA序列，以及28株人源和6株牛源NTM分離株16S rRNA測序結果，探討16S rRNA序列在常見致病性分枝桿菌菌種鑒定中的價值，現報道如下。

1 材料與方法

1.1菌株來源 收集2012-2015年四川人源性19株4種、2014年內蒙古牛源性6株2種、2005-2012年福建人源性6株2種、2010年甘肅人源性2株1種、2015年北京人源性1株1種，共計34株NTM，均為羅氏培養基培養陽性，經噻吩-2-羧酸(TCH)、對硝基苯甲酸(PNB)培養初步鑒定為NTM，再經多位點序列分析及保守基因16S、16S-23S rRNA(ITS)、RNA聚合酶的β-亞基(rpoB)和熱休克蛋白65(hsp65)等的測序結果與NCBI序列庫比對鑒定到種，并由中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所結核室傳代保存。具體信息見表1。

表1 臨床菌株信息

1.2方法

1.2.1細菌DNA制備 采用水煮法提取DNA，挑取3～4周齡新鮮菌落并用生理鹽水洗脫菌體，80 ℃滅菌30 min，離心收集菌體，用500 μL TE緩沖液重新懸菌，沸水浴15 min，12 000 r/min離心3 min，取上清液即為模板DNA，-20 ℃保存備用。

1.2.216S rRNA序列擴增 (1)擴增體系：反應體系總體積25.0 μL，2×Taq Master Mix 12.5 μL，10 μmol/L上下游引物各1.0 μL，雙蒸水8.5 μL,DNA 模板2.0 μL。為獲得34株NTM的16S rRNA基因全序列，采用正向引物Fd1、反向引物Rp2進行擴增，擴增長度約為1 500 bp，引物由北京天一輝遠有限公司合成，引物序列參照文獻[2]。正向引物Fd1:5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′；反向引物Rp2：5′-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′。將PCR產物送至北京天一輝遠有限公司進行雙向測序分析。(2)擴增條件為94 ℃預變性10 min，94 ℃變性1 min，58 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，30個循環，最后72 ℃延伸10 min。

1.2.316S rRNA序列下載 從NCBI上下載1 324 bp以上23種55株常見致病分枝桿菌及用來建外群的1株諾卡菌16S rRNA全長序列。

1.2.4核苷酸序列分析 采用PCR擴增電泳的方法驗證目的片段并將測得的序列輸入NCBI數據庫，用局部相似性基本查詢工具BLAST程序進行比對分析，驗證是否為所測菌的16S rDNA 序列。

1.2.516S rRNA進化樹的建立及序列分析 將拼接好的34株NTM分離株16S rRNA序列和從NCBI上下載的16S rRNA序列共90條，采用Mega6.0軟件中的MUSCLE進行多序列比對，參數保持默認值不變，選擇Maximum Likelihood法構建進化樹，Bootstrap法生成1 000個重復序列組。種間及種內相似性計算使用DNASTAR/MegAlign中的Clustal W方法完成。

2 結 果

2.1NTM分離株16S rRNA序列PCR擴增電泳結果 34株NTM分離株均可擴增出1條約1 500 bp的條帶，與預期片段大小相符，見圖1。測序結果大小為1 345～1 362 bp，與NCBI數據庫進行比對后發現，不同種的16S rRNA序列與NCBI數據庫中現存序列相似性均在99%以上，可見該片段為本實驗所要研究的目的片段。

注：M為DNA標志物；1～7為部分NTM分離株16S rRNA序列PCR擴增電泳結果；N為陰性對照。

2.2分枝桿菌16S rRNA序列測定結果

2.2.1驗證目的片段 將所測定的34株NTM分離株的16S rRNA序列用NCBI的BLAST程序比對分析，結果顯示與分枝桿菌的相似性均達99%，說明擴增片段為目的基因。

2.2.2分枝桿菌16S rRNA序列種間、種內相似性分析 將34條所測NTM 16S rRNA序列和NCBI中55條常見致病分枝桿菌16S rRNA序列導入DNASTAR/MegAlign軟件采用Clustal W方法進行多序列比對，以及種內及種間相似性分析。種內、種間兩兩比對后統計相似性范圍，結果顯示，種內相似性為99.0%～100.0%，其中膿腫分枝桿菌、鳥分枝桿菌、龜分枝桿菌、偶發分枝桿菌、胞內分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌、瑪爾摩分枝桿菌、海魚分枝桿菌、瘰疬分枝桿菌、蘇爾加分枝桿菌、人型分枝桿菌種內相似性均可高達100.0%，種內相似性最小值出現在戈登分枝桿菌種內比較中，為99.0%，提示16S rRNA序列的種內保守性很高。分枝桿菌種間相似性為91.5%～100.0%，其中部分人型分枝桿菌與牛型分枝桿菌、鳥分枝桿菌與胞內分枝桿菌、胃分枝桿菌與堪薩斯分枝桿菌的種間相似性可達100.0%。其次，海魚分枝桿菌和潰瘍分枝桿菌、瑪爾摩分枝桿菌與蘇爾加分枝桿菌、膿腫分枝桿菌與龜分枝桿菌表現出較高的種間相似性，均在99.4%以上(分別為99.8%、99.8%、99.9%)。蟾分枝桿菌、草分枝桿菌與其他分枝桿菌相比，種間相似性普遍較低，蟾分枝桿菌與其他分枝桿菌比較，相似性為91.5%～94.9%，其中蟾分枝桿菌與龜分枝桿菌相似性僅為91.5%。草分枝桿菌與其他分枝桿菌種間相似性為92.6%～97.2%，其中，草分枝桿菌與蟾分枝桿菌相似性僅為92.6%，草分枝桿菌與恥垢分枝桿菌種間相似性較高，為97.2%。這提示通過16S rRNA序列難以有效區分同一復合體的不同分枝桿菌亞種，但對于其他分枝桿菌種間能得到較好區分。

2.3NTM 16S rRNA系統進化分析結果 以34株臨床株測序所得的34條16S rRNA序列和55條從NCBI下載的常見致病分枝桿菌16S rRNA序列，并以諾卡菌作為外群，構建系統進化樹，見圖2。除了龜分枝桿菌和膿腫分枝桿菌、鳥分枝桿菌和胞內分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌和胃分枝桿菌、潰瘍分枝桿菌和海魚分枝桿菌、人型分枝桿菌和牛型分枝桿菌不能分開外，使用16S rRNA可以很好地將常見致病分枝桿菌各種分開，共分為18群。

圖2 16S rRNA聚類結果

2.4NTM不同種16S rRNA堿基變異分析 選取本研究所測34株NTM臨床分離株16S rRNA序列和從NCBI上下載的所有常見致病性分枝桿菌的16S rRNA序列(若分枝桿菌種內相似性為100%，則合并為1株進行分析)共90條，采用Clustal W分析剪齊后獲得的序列大小為1 248 bp。分析易變區，以M.abscessus_ATCC19977作為變異位點的參考序列，分枝桿菌16S rRNA整體保守性較高，存在易變區有7個，分別在40～90、306～352、414～487、706～741、871～890、983～1 017、1 136～1 138堿基位點。具體堿基變異分析見表2。

表2 堿基變異分析

3 討 論

基于16S rRNA基因的分子生物學檢測技術對于NTM感染的診斷和進化分析是非常重要的，尤其對于那些不能培養的或者已經被殺死的菌株[3]。16S rRNA 5′端存在A區和B區，含有針對分枝桿菌的高度變異的核酸序列，使用特異靶基因16S rRNA進行序列分析，已經被廣泛接受作為鑒定分枝桿菌的“金標準”。A區序列包含大多數分枝桿菌的種特異序列，通常用作鑒定序列，而后發現的B區序列亦為許多菌種共有，也被證實可用于個別菌種鑒定[4-5]。由于NTM感染后患者可以具有與結核病相似的臨床表現，但在治療和預防上與結核病有明顯不同，不同種的NTM對藥物的敏感性也不同，因此選擇正確和及時的NTM鑒定方法對該病患者的治療和流行病學研究是迫在眉睫的[1,6]。

近年來，基于16S rRNA建立的鑒定分枝桿菌的方法有很多，如：基于小段16S rRNA高變異區的焦磷酸測序技術，該技術主要用于分枝桿菌種內鑒定，可與16S rRNA基因的桑格測序法相比較，據報道，該方法與其他鑒定方法具有較高的符合率[7]。另外基于16S rRNA寡核苷酸的基因芯片技術也已經被應用，已在鼻腔、上消化道、腸道樣品中檢測到分枝桿菌的DNA[8]。此外，16S rRNA基因有一段138 bp片段的高度可變區，可用于鑒別已知及新型的分枝桿菌，且其鑒定NTM快速、準確，鑒定種多達40余種，如今已廣泛應用于分枝桿菌的鑒定。本次實驗中16S rRNA目的片段長度約為1 500 bp，測序所得片段長度在1 340 bp以上，比對剪齊后為1 248 bp，因此覆蓋16S rRNA的信息較全面。值得注意的是，本實驗使用的34株NTM來自5個地域，且不同地域菌種分布有差異，同一菌種分布于同一地域，無法對NTM的16S rRNA序列進行地域特征的分析。

本研究利用分離株及從NCBI數據庫中下載的16S rRNA序列，系統探討16S rRNA序列在常見致病分枝桿菌菌種鑒定中的應用價值。從系統進化樹中可以發現，除了龜分枝桿菌和膿腫分枝桿菌、鳥分枝桿菌和胞內分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌和胃分枝桿菌、潰瘍分枝桿菌和海魚分枝桿菌、人型分枝桿菌和牛型分枝桿菌等幾個關系較近的菌種不能分開外，使用全長16S rRNA序列可以很好地將13種常見致病性分枝桿菌各種分開。通過種間相似性水平分析可以發現，草分枝桿菌、蟾分枝桿菌與其他分枝桿菌差異較大，而部分人型分枝桿菌與牛型分枝桿菌、鳥分枝桿菌與胞內分枝桿菌、胃分枝桿菌與堪薩斯分枝桿菌的種間相似性最高可達100.0%，其次為膿腫分枝桿菌與龜分枝桿菌(99.9%)、海魚分枝桿菌和潰瘍分枝桿菌(99.8%)、瑪爾摩分枝桿菌與蘇爾加分枝桿菌(99.8%)。這幾種由于相似性極高，很難用16S rRNA鑒別開來，這與之前的相關研究結果相符[9]。但是16S rRNA可以將偶發分枝桿菌、日內瓦分枝桿菌、淺黃分枝桿菌、戈登分枝桿菌、嗜血分枝桿菌、不產色分枝桿菌、草分枝桿菌、瘰疬分枝桿菌、恥垢分枝桿菌、土分枝桿菌、蟾分枝桿菌很好地鑒別開來，因此可以作為一種較好的鑒定分枝桿菌的方法。而通過種內相似性比較，發現其中膿腫分枝桿菌、鳥分枝桿菌、龜分枝桿菌、偶發分枝桿菌、胞內分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌、瑪爾摩分枝桿菌、海魚分枝桿菌、瘰疬分枝桿菌、蘇爾加分枝桿菌、人型分枝桿菌種內相似性最高可達100.0%，可見分枝桿菌16S rRNA的種內保守性高。

通過NTM不同種16S rRNA堿基變異的分析，發現存在點突變、缺失突變、插入突變等變異類型。蟾蜍分枝桿菌的特異堿基變異較多，存在2處連續2個堿基的插入，3個單堿基的突變，1處連續2個堿基的缺失。日內瓦分枝桿菌、瘰疬分枝桿菌、淺黃分枝桿菌、草分枝桿菌、潰瘍分枝桿菌、不產色分枝桿菌均存在特異的堿基變異。此外，人型分枝桿菌和牛型分枝桿菌、龜分枝桿菌和膿腫分枝桿菌作為復合群分別存在特異的堿基變異。根據分枝桿菌特異的堿基變異，構建熒光定量PCR等高靈敏度的分子生物學檢測方法，對于分枝桿菌檢測及流行病學調查具有重要意義。雖然PCR產物直接測序技術存在一定的錯配率，但本實驗采用雙向測序的方法進行測序，且經北京天一輝遠有限公司對測序峰圖分析并拼接序列，可有效減少錯配事件發生。

雖然在鑒定分枝桿菌方面有一個健全的16S rRNA庫，且每種分枝桿菌有一個特異和穩定的16S rRNA序列，但是人們仍不能確定有多少個堿基不同才能區別一個種。據報道，如果16S rRNA不同的堿基數小于5個，或者它們的差異性小于1.5%，則可以認為是相同的種[10]。可見16S rRNA 鑒定方法也存在一定的弊端，基于hsp65的限制性片段長度多態性分析(PRA)方法以及ITS的序列分析均能將16S rRNA不能區分的膿腫分枝桿菌和龜分枝桿菌、胃分枝桿菌和堪薩斯分枝桿菌鑒別開來。因此，聯合應用其他分子生物學鑒定方法，會取得更好的效果。