腎衰寧片對單側輸尿管梗阻大鼠腎間質纖維化的改善作用及機制研究

馬 飛，劉 琳

(1.錦州醫科大學附屬第三醫院腎臟內科，遼寧 錦州 121002；2.赤峰市醫院血液凈化中心，內蒙古 赤峰 024099)

腎間質纖維化(Renal interstitial fibrosis，RIF)作為各種腎臟疾病發展終末階段，最終導致終末期腎臟病(End stage renal disease，ESRD)，只能接受腎臟替代療法，因此已經成為一個日益嚴重的問題。RIF是慢性腎衰竭(Chronic renal failure，CRF)呈進行性發展的始動因素，表現出腎小管間質纖維化(Tubulo interstitial fibrosis，TIF)及腎小球硬化的病理特征[1-2]。在此基礎上各種腎臟損傷后的腎小管是如何觸發成纖維細胞活化已成為該領域研究的熱點問題。Wnt信號功能缺陷可能導致各種人類疾病，如生長發育異常和腫瘤[3]。目前已經發現在RIF中起關鍵作用的Wnt信號傳導通路蛋白和相關基因[4]，這可能為抗RIF治療的設計提供新的突破口。腎衰寧片主要用于治療慢性腎臟病(Chronic kidney disease，CKD)，且療效已被證實[5]。然而，對其如何發揮延緩RIF的作用機制尚不清楚。鑒于此，本研究觀察腎衰寧片對單側輸尿管梗阻(Unilateral ureteral obstruction，UUO)大鼠腎臟功能指標、蛋白尿水平、腎臟病理以及Wnt1、β-catenin的影響，為今后該類疾病的臨床治療提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 清潔級Wistar雄性大鼠45只[許可證號：SCXK(京)2019-0010]，體重180～220 g，月齡為6～8周，購于斯貝福(北京)生物技術有限公司。本研究經倫理委員會審核和批準。

1.2 主要試劑 腎衰寧片(國藥準字Z20060030)購于山西德元堂藥業有限公司；兔抗大鼠Wnt1單克隆抗體(批號：AF5315)購于Santa Cruz公司；羊抗大鼠β-catenin單克隆抗體(批號：51067-2-AP)購于Proteintech公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物分組與模型制備：將45只健康大鼠隨機分成假手術組(S組)、模型組(U組)和治療組(T組)，每組15只。U組及T組大鼠選擇右側腎盂和輸尿管交界區下2 cm處進行手術結扎，以造成右側腎臟積水模型。S組常規進行手術，不結扎右側輸尿管。

1.3.2 給藥方法：T組從術后第1日起給予腎衰寧片0.19 g/(kg·d)進行灌胃，S組和U組每日給予相同容量的0.9%氯化鈉溶液進行灌胃。

1.3.3 標本收集：三組大鼠在術后7、14、21 d分別處死5只。各組大鼠處死前1 d通過反射排尿法收集尿液并保存待查。取血后立即處死大鼠，在無菌條件下快速解剖出大鼠的右腎，用0.9%氯化鈉溶液沖洗干凈，用紗布吸干表面水分。經冠狀縱切口保存大鼠約1/4的全腎組織。標本腎組織采用10%福爾馬林溶液中固定，然后脫水、石蠟包埋、切片(厚度要求3～4 μm)，進行腎病理形態學、血液檢測和免疫組化染色。

1.4 觀察指標

1.4.1 血、尿指標檢測：采用生化檢測儀檢測血清肌酐(CREA)和尿素氮(BUN)。應用定量法檢測尿微量白蛋白(mAlb)。

1.4.2 腎臟病理形態：在400倍光鏡下選取10個腎實質視野，分別計算各個視野的評分，取平均值。HE染色后進行結果判定，根據分布情況進行RIF病變嚴重程度評分[6]。

1.4.3 膠原容積分數(CVF)：Masson染色后，RIF病變越重，腎間質藍色膠原沉積越重，并且著色越鮮亮。于400倍光鏡下選擇10個腎實質視野，計算膠原陽性的藍色面積與總面積的百分比，即CVF。

1.4.4 Wnt1和β-catenin表達情況：免疫組化染色后，陽性區域為棕黃色，顏色越重代表表達越明顯，核為淺藍色。在圖像分析系統的幫助下，利用光學顯微鏡采集切片圖像，隨機選取10個高倍鏡(400倍)視野，采用Image J軟件計算Wnt1和β-catenin的平均光密度(AOD)。

2 結 果

2.1 三組大鼠術后不同時間點血清CREA、BUN及尿mAlb水平比較 見圖1。術后7、14、21 d，U組血清CREA、BUN水平顯著高于S組和T組，且T組高于S組(均P<0.05)。術后7、14 d，三組大鼠尿mAlb水平比較差異無統計學意義(均P>0.05)。隨著梗阻時間延長，術后21 d三組尿mAlb水平出現顯著變化，S組尿mAlb水平最低，T組次之，U組最高，三組比較差異有統計學意義(均P<0.05)。

注：與S組比較，*P<0.05；與U組比較，#P<0.05

2.2 腎組織病理學改變

2.2.1 腎組織形態肉眼觀察：S組腎外形正常，大小正常，外觀呈暗紅色，各時間點均無明顯變化；術后7 d，U組和T組病側腎外形增大、腫脹，外觀顏色逐漸變淡，腎實質厚度變薄；術后14 d， U組和T組病側腎進一步增大，外觀顏色變淡，腎積液，腎實質厚度進一步變薄；術后21 d，U組和T組病側腎外形體積明顯增大，外觀顏色進一步變淡，腫脹明顯，腎積液加重，腎實質厚度更薄。

2.2.2 腎組織HE染色結果：見圖2。S組腎小管上皮細胞(RIEC)基本正常。術后7 d， U組和T組RIEC輕度萎縮及壞死，空泡變性，炎癥細胞在腎間質局灶性浸潤，RIEC刷狀邊緣脫落，腎間質出現輕度纖維化；術后14 d，U組和T組RIEC中度萎縮，空泡變性范圍增大，壞死，炎癥細胞在腎間質仍呈彌漫性浸潤，腎間質中度纖維化；術后21 d，U組和T組病變更為嚴重，RIEC嚴重萎縮，重度壞死，伴有大量炎癥細胞，腎間質膠原纖維增生明顯，RIF顯著。統計學分析顯示，U組及T組大鼠RIF病變嚴重程度評分明顯高于S組(均P<0.01)；與U組比較，T組各時間點RIF病變嚴重程度評分降低，但仍高于S組(均P<0.05)。見表1。

圖2 三組大鼠術后不同時間點腎組織病理學變化(HE染色，×400)

表1 三組大鼠術后不同時間點RIF病變嚴重程度評分比較(分)

2.3 三組大鼠腎間質CVF比較 見表2。Masson染色結果顯示，S組大鼠腎間質基本正常，各時間點無明顯變化；U組和T組藍染纖維化主要出現在小管的間質區。術后7、14、21 d，U組和T組腎間質CVF高于S組，且隨梗阻時間推移CVF呈進行性增高(均P<0.05)。T組術后各時間點CVF高于S組，但低于U組(均P<0.05)。

表2 三組大鼠腎間質CVF比較(%)

2.4 三組大鼠腎組織Wnt1和β-catenin AOD比較 見表3。免疫組化染色結果顯示，S組Wnt1和β-catenin表達呈陰性，U組和T組表達呈陽性，為深黃色，并且在腎小管上皮細胞和間質細胞上呈現強陽性表達，多為褐色。采用Image J軟件計算Wnt1和β-catenin的AOD后進行比較，S組最低，且術后各時間點AOD比較差異無統計學意義(均P>0.05)。U組和T組AOD高于S組，且隨梗阻時間推移AOD呈進行性增高(均P<0.05)。T組術后各時間點AOD高于S組，但低于U組(均P<0.05)。

表3 三組大鼠腎組織Wnt1和β-catenin AOD比較

3 討 論

RIF是許多不同原因引起CKD的共同病理學最終結果，其中Wnt/β-catenin信號傳導通路在RIF的進展中起著關鍵作用并逐漸被認識[7-9]。由于目前的治療方法療效有限，研發針對參與RIF發病機制的關鍵分子途徑的新藥物來阻止其進展仍是一項艱巨任務。抑制RIF是CKD的主要治療方向，雖然臨床治療取得了一定效果，但對Wnt/β-catenin信號傳導途徑的研究較少。

在本研究中過程中，我們系統收集了血清CREA和BUN、尿mAlb以及腎臟病理結果，發現三組大鼠尿mAlb水平在術后7、14 d無顯著變化，但隨著梗阻時間延長，術后21 d三組尿mAlb水平出現顯著變化，S組尿mAlb水平最低，T組次之，U組最高，可見腎衰寧片對終末期腎臟病的蛋白尿控制有一定作用，從而發揮保護腎臟功能的作用。腎臟功能方面檢查發現在各個時間點U組及T組大鼠血清CREA、BUN均顯著高于S組，血清CREA、BUN進行性升高，提示腎功能進一步惡化，但T組仍能反映出腎衰寧片具有明顯的腎臟保護作用，可以降低血清CREA、BUN。肉眼觀察腎臟大體標本發現，S組外觀無明顯異常，各個時間點也無明顯異常變化，但在U組及T組腎臟體積逐漸腫脹。HE染色發現，S組腎臟病理無明顯變化，但偶有炎癥細胞輕度浸潤，考慮這種輕度變化與手術應激相關，U組及T組術后7 d開始逐漸出現炎癥細胞浸潤并伴有輕度纖維化，術后14 d大量炎癥細胞浸潤并出現中度纖維化，伴有小管壞死、萎縮，術后21 d病變進一步加重；通過對RIF進行病理評分發現，在各時間點T組病理損傷程度均比U組輕。Masson染色發現，藍染腎間質膠原纖維在U組和T組術后7 d時開始出現，并隨著時間延長，藍染面積逐漸擴大，統計學分析發現U組CVF最高，T組次之，S組最低，提示T組腎間質纖維化程度相較于U組明顯改善，說明腎衰寧片能減輕RIF病理變化，發揮腎臟保護作用，同時也能控制終末期腎臟病蛋白尿。

Wnt信號通路的功能主要體現在有節律地處于靜止及活化狀態，在這個過程中產生的糖脂蛋白物質可誘導正常組織細胞進行新陳代謝，參與組織代謝過程中的細胞增殖和凋亡[10-11]。正常情況下，腎臟中Wnt/β-catenin信號途徑處于靜態狀態，但當β-catenin持續積累時，Wnt信號通路被活化，導致大量炎癥細胞浸潤、增殖和分化[12-13]。因此，下調Wnt/β-catenin信號通路活性可在一定程度上抑制RIF的進展，達到保護腎功能的作用。Wnt1和β-catenin的表達在術后7、14、21 d逐漸增多，輸尿管梗阻引起Wnt/β-catenin明顯表達，主要表現在腎小管上皮。免疫組化染色結果發現，Wnt1和β-catenin表達呈現正相關，腎衰寧片可能是通過獨立于體內的這種信號通路的激活和中斷而干預這一機制來發揮其抗纖維化作用的。當然，RIF除了Wnt/β-catenin的激活，還受到其他信號通路的調控，最近的研究提出了幾種不同程度干擾Wnt信號的方法。Wnt拮抗劑Dapper3的缺失可導致UUO模型中β-catenin的聚集、Wnt靶向的促纖維化基因的激活和纖維化表型的惡化[14-15]。除了基因調控外，干擾Wnt信號的小分子也可以調節纖維化的發展，因此可能成為治療纖維化的新途徑[16]。例如，維生素D對腎間質纖維化有保護作用，其主要是通過對降鈣素與T細胞因子4(TCF-4)競爭β-catenin來抑制Wnt/β-catenin信號傳導[17]；ICG-001可抑制Wnt/β-catenin活性，同樣也能減緩RIF的發生及發展過程[18]。研究[19]發現，黃芪可以通過影響Wnt信號通路延緩RIF進程，從而減輕腎臟病變，保護腎臟機能。此外，有研究[20]報道黃精皂苷可以抑制Wnt/β-catenin信號通路的活化，從而抑制TIF的進展，最終達到保護腎臟的效果。

綜上所述，腎衰寧片可改善UUO大鼠RIF程度，保護腎功能，降低尿mAlb水平，其機制可能與抑制Wnt/β-catenin信號通路有關，選擇性抑制Wnt/β-catenin信號通路可能為纖維化腎病的治療提供新的策略。但本研究僅僅是針對動物模型的有效性研究，藥物用于臨床是否有效還需要在未來做大量的研究加以驗證。