結直腸癌原位移植造模技術研究進展

曹巍巍，郭修田

(上海中醫(yī)藥大學附屬市中醫(yī)醫(yī)院肛腸科，上海 200071)

結直腸癌(Colorectal cancer，CRC)是常見的一種消化道惡性腫瘤，在世界范圍內影響男性和女性最常見腫瘤中居第3位[1-3]。每年有超過100萬新病例報告，大約60萬患者死于這種疾病[4]。而在我國，CRC發(fā)病率和病死率也在不斷上升。根據《中國結直腸癌診療規(guī)范(2020年版)》[5]2018年中國癌癥統(tǒng)計報告顯示，我國CRC發(fā)病率、病死率在全部惡性腫瘤中分別位居第3及第5位，新發(fā)病例37.6萬，死亡病例19.1萬。

近年來，針對CRC的動物模型受到了廣泛關注。近5年來，關于CRC小鼠造模的綜述[6-9]也逐漸增多，CRC生物復雜性激發(fā)了更合適的研究設計的發(fā)展[10]。嚙齒類動物模型[11-12]具有許多重要的屬性，它們與人類的許多相同特征已被證明對理解CRC的許多復雜分子方面非常重要，它們也是開發(fā)新的化療藥物的寶貴工具[13-14]。這使得實驗室小鼠成為腫瘤學研究中最具吸引力的實體之一。目前常規(guī)使用的CRC動物模型分為自發(fā)性模型、誘發(fā)性模型、移植性模型以及轉基因模型。現(xiàn)對CRC移植模型中原位移植的最新研究進展進行闡述。

1 原位移植造模優(yōu)勢

以往的小鼠腫瘤模型均為異種移植瘤異位模型，為新型原位腫瘤模型的發(fā)展奠定了基礎[15]。這些異種異位移植模型傳統(tǒng)上是通過將人結腸癌細胞皮下植入裸鼠。在這個模型中，形成的腫瘤位于外部，因此它更容易完整地與組織分離，可以更加準確地測量腫瘤的生長情況和大小。然而，傳統(tǒng)的皮下腫瘤模型對大腸癌的研究并不理想，制作一個異位模型很容易，但它不能模擬人類的疾病過程[16]。因為腫瘤的解剖位置在皮下，且皮下轉移不存在，所以該模型不適合研究自發(fā)轉移過程[17-19]。大腸癌原位小鼠模型以癌細胞在自然位置生長為特征，高保真地復制了人類疾病過程，能更準確地預測腫瘤治療的臨床結果[20]。因此，原位移植模型是一種比較容易建立且腫瘤生物學特性與在體腫瘤較為一致的模型，是進行CRC生物學研究和腫瘤藥物篩選研究的理想模型[21]。

2 原位移植造模方法

原位異種移植模型的制備方法有多種，按技術方法可分為開放手術造模、灌腸造模、經肛門低劑量電凝造模以及內鏡微創(chuàng)造模四種。

2.1 開放手術造模 Zhu等[22]于2020年3月將來自于美國加州大學圣地亞哥分校外科腫瘤科(UCSD)1例術前未接受任何化療或放療的患者的CRC樣本移植在裸鼠皮下。腫瘤長大后再次采集，移植在表達綠色熒光蛋白的裸鼠皮下傳代兩代，提取最終表達綠色熒光蛋白的小鼠直腸癌細胞。麻醉非表達綠色熒光蛋白的裸鼠后，在腹部正中皮膚切開約1 cm，在盲腸上縫合一個5 mm×5 mm×5 mm的腫瘤碎片，使用6-0尼龍線縫合切口，建立原位移植的CRC模型。該模型的淋巴轉移率與遠處器官轉移率文中并未統(tǒng)計，但腫瘤發(fā)生率為100%。Hu等[23]在傳統(tǒng)的開放手術原位造模法的基礎上改良了腫瘤碎片的種植方式。傳統(tǒng)方式是用手術縫合線將1 mm×1 mm的腫瘤碎片縫合于直腸黏膜損傷區(qū)域，而改良模型是用黏合劑(氰基丙烯酸酯)代替手術縫合線，1 mm×1 mm的腫瘤碎片黏附于直腸黏膜損傷區(qū)域。對比傳統(tǒng)縫合方式，改良模型在手術耗時、小鼠成活率以及腫瘤大小方面有明顯優(yōu)勢。

2.2 灌腸造模 Kishimoto等[24]將小鼠CRC細胞系CT26和人CRC細胞系HCT-116在含10%胎牛血清(FBS)的RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，造模過程是先通過化學破壞直腸黏膜屏障。將小鼠麻醉后，通過肛門將一根聚乙烯導管插入直腸腔，用6 ml PBS沖洗直腸腔，以清除腸道內容物。將牽開器插入肛門直腸區(qū)域，擴張直腸腔，然后用4%乙酸溶液浸泡直腸黏膜2 min，然后再次用6 ml PBS沖洗。在直腸黏膜屏障破裂后，立即將CT26-GFP細胞注入50 μl 基底膠，用一根針將其灌注到距肛門4 mm的直腸黏膜表面。在注入癌細胞后，立即用塑料膠帶將肛門密封，將牽開器夾在直腸內，以防止細胞滲漏。手術總時間約為每只小鼠15 min，沒有發(fā)生與醋酸治療和癌細胞植入相關的并發(fā)癥或死亡。最終，腫瘤發(fā)生率為100%，腸系膜下淋巴結轉移率為90.9%，主動脈旁淋巴結轉移率為54.5%，肺轉移率為91.8%，肝轉移率為9%。

2.3 經肛門低劑量電凝造模 Bhullar等[25]將CRL-2639、CRL-2638、HT-29、LS-174T腫瘤細胞系植入重癥聯(lián)合免疫缺陷(SCID)小鼠。麻醉后將小鼠仰臥放置。特別設計的可拆卸單電極的外護套由柔軟的橡膠制成，尖端光滑。首先把直腸引入橡膠護套，輔以水溶性凝膠潤滑，從而避免對結腸造成傷害。然后，將軟金屬單極電極穿過先前放置的外層橡膠護套，確保電極的非創(chuàng)傷性圓端剛好伸出外橡膠套為電極提供絕緣，將軟夾具應用于小鼠尾尖并連接到Bovie機器。電流過低時不能造成黏膜損傷，過高則會導致穿孔，通過嘗試不同的Bovie設置，最終選擇最佳的5 W設置進行研究。在預設的單個或3個點電凝結腸黏膜，每個點之間至少間隔5 mm的距離，從距離肛門口2 cm開始。去電極后，將一根24 Fr TeflonⅠ/Ⅴ套管插入直腸灌注腫瘤細胞。結果顯示，腫瘤發(fā)生率CRL-2638為100%，CRL-2639為92%，LS-174T為100%，HT-29為58%；淋巴轉移率CRL-2638為100%，CRL-2639為50%，LS-174T為83.3%，HT-29為33.3%；肝轉移率CRL-2638為41.7%，CRL-2639為0%，LS-174T為83.3%，HT-29為0%。

2.4 內鏡微創(chuàng)造模 Hite等[26]將HT-29細胞通過顯微鏡下注射在SCID小鼠直腸黏膜下。具體造模方式為：將小鼠麻醉后，用潤滑的鈍頭鉗擴張肛管，暴露遠端肛門和直腸黏膜。使用奧林巴斯解剖顯微鏡漢密爾頓微升注射器把腫瘤細胞注射到直腸遠端黏膜下層、肛管以上1～2 mm處。結果顯示，小鼠直腸原位腫瘤發(fā)生率為100%，肝轉移率為60%，肺轉移率為56%，淋巴轉移率文中未統(tǒng)計。Chen 等[27]描述了一種使用內鏡微創(chuàng)手術的新型CRC原位移植造模法，將CT26細胞系原位移植在BALB/C小鼠直腸黏膜下，MC38細胞系原位移植在C57BL/6J小鼠直腸黏膜下，植入細胞數分別為104、105和106個，各實驗組均取14 d觀察期，以觀察各組的腫瘤發(fā)生率及轉移率，結果顯示CT26各組腫瘤發(fā)生率均為100%，淋巴轉移率分別為75%(104個細胞)、100%(105個細胞)和50%(106個細胞)，肝轉移率分別為25%(104個細胞)、50%(105個細胞)和50%(106個細胞)；MC38腫瘤發(fā)生率發(fā)表為0%(104個細胞)、25%(105個細胞)和50%(106個細胞)，淋巴轉移率和肝轉移率各組均為0%。

3 四種原位移植造模方法優(yōu)缺點

Zhu等[22]在裸鼠盲腸上進行的原位移植造模是在裸鼠腹部切開皮膚，找到盲腸，在盲腸上縫合腫瘤細胞碎片，再縫合切口，所以造模的定位很準確，可以根據實驗需求自主選擇腫瘤細胞移植點位，且腫瘤移植成功率和成瘤率很高，這是開放手術造模相較于其他造模方式的顯著優(yōu)勢。Hu等[23]發(fā)表的改良模型用黏合劑(氰基丙烯酸酯)代替手術縫合線，在手術耗時、小鼠成活率以及腫瘤大小方面有明顯優(yōu)勢。但是同樣，開放手術帶來的開放性創(chuàng)口容易造成小鼠術后感染，增加模型病死率，且需要縫合切口，對手術操作本身有一定的要求。

Kishimoto等[24]介紹的灌腸模型沒有開放性創(chuàng)口，操作較為便捷且成瘤率高，而且淋巴轉移率和其他器官轉移率都較高。據我們所知，這是第一個可以可靠地提供真正的原位直腸癌在黏膜組織中生長，并隨后引起自發(fā)淋巴結和肺轉移的模型，這很容易被GFP熒光高靈敏度檢測到。該模型可用于研究腫瘤的早期生長或評估可能增強或抑制早期CRC生長的腔內因素(膳食化合物、膽汁酸、腸道菌群等)。但是灌腸模型不能根據實驗要求精準選取腫瘤細胞種植點位，這是該模型的明顯缺點。

Bhullar等[25]提出的經肛門低劑量電凝造模法結合了開放手術造模法和灌腸造模法的優(yōu)勢，在設定合適的電流量后，將電極經小鼠肛門到達直腸黏膜的目標點位，造成黏膜損傷后退出肛門，再使用灌腸法使得腫瘤細胞在黏膜下目標點位種植。這種造模法既沒有開放創(chuàng)口，也可以精確到幾個點位，是目前比較新的一種造模方式，具有其獨特的優(yōu)勢。但是該造模法對于設備有一定的要求，且調試電極過程中會造成小鼠的意外死亡。

Hite等[26]介紹的顯微鏡下注射模型是截至目前最安全、最可復制、最成功的具有原發(fā)腫瘤生長和自發(fā)遠處轉移特征的原位CRC小鼠模型。而且，該模型在主觀上是最快建立的，最容易學習，技術上最容易操作，對動物的壓力較小。腫瘤成瘤率和肝、肺轉移率都是實驗組中最高的，淋巴轉移率實驗未涉及。Chen等[27]介紹的內鏡微創(chuàng)造模法是目前比較先進的原位CRC造模法，是利用內鏡觀察并選取直腸目標注射點位，后引入柔性注射導管，使注射針輕輕穿過結腸黏膜，使其斜面朝向管腔。再由第2名研究員注射腫瘤細胞懸液，看到黏膜輕微抬起(“陽性抬升標志”)則為注射成功。該造模法腫瘤種植成功率高，操作簡單，淋巴轉移率和遠處轉移率都比較高，是目前比較先進的一種造模方式[28]，且效果較好，但是對實驗器材要求較高，造模成本很高，普及率較低。

4 結 語

目前主流的幾種原位CRC小鼠造模方式都各有其優(yōu)勢和不足之處。傳統(tǒng)的開放手術種植點位精準，操作簡便，器材易得，但是對小鼠創(chuàng)傷較大，病死率和感染率較高。最新的幾種非手術經肛門的造模方式相比于傳統(tǒng)開放手術和灌腸造模法有了一定的改良，在大大降低了小鼠病死率和感染率的同時提高了種植點位的精準度，但是對設備有較高的要求，較難進行推廣和普及。相信在科學技術的不斷升級和推動下，新的方法將會引入到CRC的造模之中，為臨床和科研提供更有利的數據支持。