拓撲替康對裸鼠非小細胞肺癌的治療效果及機制研究

任磊鵬，張新偉，王瑞潔，李 潛，孫黨澤，劉玉鋼

(1.西安市胸科醫院胸外科，陜西 西安 710100；2.陜西省腫瘤醫院胸外科，陜西 西安 710065；3.西安市東方醫院內科，陜西 西安710043)

1 材料與方法

1.1 實驗動物 80只SPF級健康雄性裸鼠，體重18～22 g，購自陜西省中醫藥研究院食品化妝品檢驗檢定中心，許可證號：SYXK(陜)2018-009。于溫度20～24 ℃、相對濕度40%～60%條件下進行飼養，光照每日12 h，自由攝食和飲水，喂養1周。

1.2 主要試劑 TPT(批號：AZ21090101)購自成都艾博克生物科技有限公司；人NSCLC細胞H1993(批號：YS1790C)購自上海晶風生物科技有限公司；兔抗人Ki-67(批號：ab15580)購自英國Abcam公司；DMEM培養基(批號：51435C)、胰蛋白酶(批號：T2600000)購自西格瑪奧德里奇(上海)貿易有限公司；TUNEL凋亡檢測試劑盒(批號：C0002)購自北京普利萊基因技術有限公司；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3，批號：ab32042)、血管內皮生長因子C(VEGFC，批號：ab9546)、基質金屬蛋白酶-2(MMP-2，批號：ab181286)抗體均購自美國Abcam公司；小鼠胱抑素C(Cys-C)ELISA檢測試劑盒(批號：PC215)購自上海碧云天生物科技有限公司。

1.3 細胞培養 將人NSCLC細胞H1993接種于含10%胎牛血清的DMEM培養基中，置于5% CO2、37 ℃培養箱中進行培養。待細胞融合度達到80%～90%時，用0.25%胰蛋白酶消化后制成1×107/ml細胞懸濁液。

1.4 動物模型的建立與分組 每只裸鼠注射0.2 ml細胞懸濁液，注射部位為左側腋部皮下。造模后，每間隔5 d，測量腫瘤直徑，當腫瘤體積≥100 mm3時開始給藥。將造模成功的裸鼠隨機分成對照組(CG組)、TPT低劑量組(LG組)、TPT中劑量組(MG組)和TPT高劑量組(HG組)，每組20只。TPT給藥組以TPT灌胃，劑量依次為0.5、1.0、1.5 mg/(kg·d)。對照組裸鼠灌胃等量0.9%氯化鈉溶液。每日給藥1次，連續30 d。

1.5 觀察指標

1.5.1 一般情況：治療過程中觀察各組裸鼠的飲食、飲水、體重及死亡等情況。

1.5.2 腫瘤體積及腫瘤抑制率：每隔5 d采用游標卡尺對腫瘤的長徑(a)和短徑(b)進行測量，腫瘤體積(V)=(a×b)3/2×0.35。治療30 d后將裸鼠斷頸處死，剝離皮下腫瘤后稱重，計算腫瘤抑制率。腫瘤抑制率(%)=(對照組平均瘤重-給藥組平均瘤重)/對照組平均瘤重×100%。

1.5.3 細胞凋亡率：對腫瘤組織稱重后，用4%多聚甲醛溶液固定，石蠟切片，進行一系列處理，包括梯度脫水、清洗、顯色、透明和封片等，采用光學顯微鏡觀察并拍照，并用Image-Pro Plus 6.0軟件對細胞凋亡情況進行分析。細胞凋亡率(%)=凋亡細胞數/細胞總數×100%。

1.5.4 相關蛋白表達水平：取部分腫瘤組織于液氮中速凍、研磨，加入1000 μl RIPA裂解液于冰上裂解30 min后，1500 r/min離心10 min，采用BCA試劑盒測定蛋白濃度。然后，采用蛋白免疫印跡法(Western blot)對腫瘤組織中相關蛋白表達情況進行檢測。獲得的圖片采用Image-Pro Plus 6.0軟件對蛋白條帶灰度值進行分析。內參為甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)。

由表1可知，在超稀植模式下，對油菜進行覆膜栽培及普通不覆膜栽培，油菜莖粗有較明顯的差異，與覆膜對油菜植株高度的影響類似，覆膜稀植油菜較不覆膜種植油菜莖粗在直徑上大約2.6 mm。

1.5.5 胱抑素C濃度：采用ELISA法對胱抑素C的濃度進行檢測，具體操作按照試劑盒說明書進行。

2 結 果

2.1 四組裸鼠一般情況觀察 在實驗過程中，MG組和HG組裸鼠一般狀態良好，反應靈敏，食欲旺盛。對照組裸鼠一般狀態較差，反應遲鈍，飲食、飲水差。LG組裸鼠一般狀態一般，反應相對遲鈍，飲食、飲水一般。與對照組相比，給藥30 d時LG組、MG組和HG組裸鼠體重明顯升高(均P<0.05)，見表1。LG組裸鼠于第11天開始出現死亡，給藥30 d時LG組、MG組和HG組裸鼠的死亡率明顯低于CG組(均P<0.05)，見表1。

2.2 四組裸鼠不同時間點腫瘤體積比較 見表2。在實驗過程中，四組裸鼠腫瘤體積均逐漸增加。與CG組比較，給藥5 d后，LG組、MG組和HG組裸鼠腫瘤體積顯著降低(均P<0.05)。

2.3 四組裸鼠腫瘤抑制率比較 LG組、MG組和HG組裸鼠腫瘤抑制率分別為30.65%、43.54%和65.93%。LG組、MG組和HG組平均瘤重顯著低于對照組(均P<0.05)。

表1 四組裸鼠體重和死亡情況比較

表2 四組裸鼠不同時間點腫瘤體積比較(mm3)

2.4 四組裸鼠細胞凋亡率比較 給藥30 d后，隨著給藥濃度增大，腫瘤組織中細胞凋亡率呈逐漸增加趨勢。LG組、MG組和HG組裸鼠腫瘤組織中細胞凋亡率分別為(12.62±2.53)%、(32.06±4.16)%和(53.32±4.61)%，CG組細胞凋亡率為(5.17±1.99)%，因此LG組、MG組和HG組裸鼠腫瘤組織中細胞凋亡率低于CG組(均P<0.05)。

2.5 四組裸鼠細胞相關蛋白相對表達水平比較 見表3。給藥30 d后，裸鼠腫瘤組織中Caspase-3表達水平升高，Ki-67、VEGFC和MMP-2表達水平降低，升高和降低幅度與TPT給藥濃度呈正相關關系。LG組、MG組和HG組裸鼠腫瘤組織中Caspase-3相對表達水平高于CG組，Ki-67、VEGFC和MMP-2相對表達水平低于CG組(均P<0.05)。

表3 四組裸鼠細胞相關蛋白相對表達水平比較

2.6 四組裸鼠胱抑素C表達水平比較 給藥30 d后，裸鼠腫瘤組織中胱抑素C表達水平降低，降低幅度與TPT給藥濃度呈正相關關系。LG組裸鼠腫瘤組織中胱抑素C表達量為(468.74±10.74)μg/ml，MG組為(403.13±13.71)μg/ml，HG組為(331.17±12.31)μg/ml，CG組為(574.03±13.19)μg/ml，因此，LG組、MG組和HG組裸鼠腫瘤組織中胱抑素C表達量低于CG組(均P<0.05)。

3 討 論

國家癌癥中心2019年公布的數據[9]顯示，肺癌位居我國惡性腫瘤發病和死亡首位，2015年我國新發肺癌病例約78.7萬例，發病率為57.26/10萬，中標率為35.96/10萬；死亡數約63.1萬例，病死率為45.87/10萬，中標率為28.16/10萬。如不及時采取有效控制措施，預計到2025年，我國肺癌患病人數將達到100萬，成為世界第一肺癌大國。其中，NSCLC占到所有肺癌80%以上，約30%～40%的患者確診時已進展為局部晚期，40%的患者為已進展轉移性肺癌。NSCLC有三種亞型，即腺癌、鱗狀細胞癌和大細胞癌，其中肺腺癌和肺鱗癌是常見的亞型。目前，手術、放療、化療仍是NSCLC的有效治療手段。對于早期及部分Ⅲa期NSCLC患者來說，手術治療仍是首選的治療方法[10]。晚期NSCLC患者因無法手術或手術治療效果不明確，臨床上多采用放療、化療等治療方法。化療幾乎適用于各種病理類型的肺癌，且可單獨或與其他治療方式聯合使用，是晚期肺癌主要治療方法。但化療藥物易出現不敏感或耐藥等問題，嚴重影響了臨床療效。TPT屬于新興喜樹堿衍生物的半合成藥物，其在體內分布速度快、吸收好，具有較強抗癌作用，被廣泛應用于婦科腫瘤、腦轉移瘤、SCLC、胃腸癌等的化療[11]。研究[8]表明，TPT是拓撲異構酶Ⅰ的抑制劑，一方面可通過干擾DNA復制控制DNA鏈斷裂位點，引起細胞不可逆損傷；另一方面，TPT可以通過作用于腫瘤細胞，影響其增殖和遷移等，從而抑制腫瘤轉移。

細胞凋亡于20世紀被首次提出。機體每天通過凋亡清除異常細胞，維持體內環境的穩定，防止疾病的發生。腫瘤的發生是由細胞增殖與死亡的速度平衡失調造成的。細胞凋亡受到多條信號通路的調控，其中細胞膜死亡受體介導的凋亡途徑和線粒體介導的凋亡途徑研究較多。半胱氨酸蛋白酶(Caspase)家族作為兩條途徑的共同通路，是程序性死亡或凋亡的關鍵介質[12]。Caspase-3作為凋亡過程中的關鍵酶，其活性受到抑制可引起細胞凋亡障礙，進而引起多種腫瘤細胞的增殖[13]。研究[14-15]表明凋亡蛋白Bax、Casepes-3在NSCLC中高表達，Bax、Caspase-3蛋白免疫組化陽性結果評分與腫瘤細胞的凋亡指數呈顯著正相關。而TPT對肺癌、宮頸癌、食管癌細胞具有較強的殺傷和誘導凋亡作用，其作用機制可能與Caspase-8、Caspase-3等的有序性活化有關。除凋亡過程受阻外，異常細胞無限增殖是惡性腫瘤發展的另一本質。Ki-67是一種重要的細胞增殖標志物，主要在細胞核表達。Ki-67被發現在NSCLC、結直腸癌、乳腺癌、甲狀腺癌等多種腫瘤組織中高表達，其表達水平與NSCLC淋巴結轉移、分化程度和臨床分期呈正相關[16]。Previs等[17]研究表明，納布-紫杉醇與TPT聯合使用可顯著降低腫瘤重量，其機制可能與Caspase-3表達刺激血管生成及Ki-67表達抑制相關。

腫瘤的侵襲、遷移指腫瘤細胞脫離原位置，侵入并穿過周圍基質，經血液或淋巴系統轉移至其他部位的過程，該過程也同樣受到多因素、多基因的相互協調作用。研究發現，腫瘤的浸潤和轉移與細胞外基質(ECM)的降解有關，而ECM的降解主要依賴各種蛋白水解酶，其中基質金屬蛋白酶(MMP)為ECM降解的主要酶類。MMP-2是MMP家族的重要成員[18]。研究[19]表明通過負調控MMP-2的表達可抑制腫瘤細胞遷移和腫瘤生長，從而影響腫瘤的發展，達到抑制或治療腫瘤的目的。VEGFC是新近發現的VEGF家族新成員，可由腫瘤細胞分泌，與受體VEGFR-3結合后刺激淋巴管增生。研究[20]發現，VEGFC在胃癌、宮頸癌、乳腺癌、肺癌等多種腫瘤中高表達，其表達水平與淋巴結轉移率、患者生存率、預后等密切相關。

TPT屬于廣譜抗腫瘤藥物，近年來被作為二線藥物被應用于SCLC、婦科腫瘤、胃癌等的治療，但其單獨或聯合應用于NSCLC的治療較少。因此，本研究將不同濃度TPT作用于非小細胞癌裸鼠30 d后，通過裸鼠體重、死亡率、腫瘤體積、瘤細胞凋亡率以及相關蛋白表達情況等的觀察和檢測，結果與文獻[21]基本一致，說明TPT對裸鼠NSCLC具有較好的治療效果。

綜上所述，TPT可降低NSCLC移植瘤裸鼠的病死率，對NSCLC移植瘤具有較好的抑制作用，其機制可能與TPT增加H1993細胞Caspase-3蛋白表達，降低胱抑素C、Ki-67及MMP-2蛋白表達水平有關。