半乳糖凝集素-3抑制劑柑橘果膠對心力衰竭大鼠血漿N端B型利鈉肽原及心肌纖維化的影響

韓 媛，曾新春

(1.西安市第一醫(yī)院心內(nèi)科，陜西 西安 710002；2.西安交通大學第一附屬醫(yī)院東院心血管內(nèi)科，陜西 西安 710089)

心力衰竭是各種心臟功能、結構疾病導致收縮和(或)舒張功能障礙，以致肺循環(huán)和(或)體循環(huán)淤血，組織、器官血流灌注不足的一種病理狀態(tài)[1]。心力衰竭是多數(shù)心血管疾病的最終歸屬，也是一個涉及心血管、骨骼肌、呼吸、內(nèi)分泌等多個系統(tǒng)器官的臨床綜合征，具有比較高的致殘率與病死率[2]。雖然近年來隨著藥物技術與介入技術的發(fā)展，心力衰竭的治療取得了重要的進展，但是很多患者的長期預后仍不佳。深入揭示心力衰竭的病理生理機制，尋找新的治療方法具有重要價值[3-4]。現(xiàn)代研究表明心肌纖維化在心力衰竭的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，心肌纖維化可增加心肌僵硬度，限制心肌細胞運動，影響心肌的收縮和舒張功能，降低室壁順應性。心肌纖維化在病理上主要表現(xiàn)為成纖維細胞的表型轉(zhuǎn)化、細胞外基質(zhì)過度沉積，還包括心肌細胞的肥大、壞死、凋亡等[5]。N端B型利鈉肽原(N-terminal pro-B-type natriuretic peptide，NT-proBNP)由32個氨基酸組成，有擴血管、利鈉、利尿作用，可預測房顫伴輕度心力衰竭患者電復律后房顫的復發(fā)，也可預測心臟外科手術術后房顫的發(fā)生，是由慢性炎癥引發(fā)心血管疾病的獨立危險因素[6]。研究[7-8]表明，半乳糖凝集素-3是心血管疾病患者左心室功能不全和不良預后的循環(huán)生物標志物，可與受體結合而激活細胞，從而作為細胞外細胞因子發(fā)揮作用。半乳糖凝集素-3可參與心肌炎和心室重構的過程，也可促進心肌纖維化。柑橘果膠為半乳糖凝集素-3的抑制劑，可能存在改善心血管病變狀況的作用[9]。本研究具體探討半乳糖凝集素-3抑制劑柑橘果膠對心力衰竭大鼠血漿NT-proBNP及心肌纖維化的影響，以明確半乳糖凝集素-3抑制劑的作用效果與機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 清潔級雄性Wistar大鼠45只，8～10周齡，體重230～250 g，購自凱學生物科技(上海)有限公司，飼養(yǎng)于本院實驗動物中心。飼養(yǎng)條件：12 h明/暗循環(huán)環(huán)境，自由攝食飲水。本研究得到了醫(yī)院動物倫理委員會的批準，對動物處置符合動物倫理學原則。

1.2 主要試劑 抗Ⅰ型膠原蛋白抗體(批號：JC-A09786，稀釋度1∶1000)、抗Ⅲ型膠原蛋白抗體(批號：bs-0549R，稀釋度1∶1000)購自上海機純實業(yè)有限公司；柑橘果膠(批號：pc168)購自山東恒源康生物科技有限公司；酶聯(lián)免疫法檢測試劑盒(批號：48T/96T)購自上海語純生物科技有限公司。

1.3 心力衰竭大鼠模型制備與分組 將大鼠連接到小動物呼吸機上，連續(xù)監(jiān)測生命體征。在胸骨頂部的第4個肋間隙處做一個切口，除去心包囊，并用體視顯微鏡觀察左前降支并進行結扎，不損壞動脈。關閉動物呼吸機，觀察大鼠自發(fā)呼吸情況。建模成功標準：大鼠精神萎靡，被毛無光澤，一般情況差，食欲低下，靜息狀態(tài)下呼吸急促。將建模成功的心力衰竭模型大鼠共42只隨機平分為模型組、柑橘果膠A組、柑橘果膠B組。模型組給予10 mg/(kg·d)的0.9%氯化鈉溶液灌胃。柑橘果膠A組、B組分別給予0.10、0.20 mg/(kg·d)的柑橘果膠加入0.9%氯化鈉溶液灌胃，連續(xù)治療并觀察4周。

1.4 觀察指標

1.4.1 心臟形態(tài)結構指標測定：所有大鼠在治療第2周與第4周進行心臟形態(tài)結構指標測定。大鼠麻醉后，將注滿肝素化0.9%氯化鈉溶液導管一端連接超聲血流動力學系統(tǒng)，另一端經(jīng)右頸總動脈插入左心室，探頭頻率1.0～4.0 MHz，減小扇掃角度，觀察與記錄室間隔厚度(IVS)和左心室舒張末期內(nèi)徑(LVDD)。

1.4.2 心臟指數(shù)與心肌膠原容積分數(shù)測定：在治療第4周與第8周，各組分別處死7只大鼠，開胸后從主動脈根部切取心臟，測定與記錄心臟指數(shù)。同時，進行Masson染色，測定與記錄心肌膠原容積分數(shù)。

1.4.3 血漿NT-ProBNP含量測定：在治療第4周與第8周，取處死大鼠腔靜脈血2 ml，抗凝后3000 r/min離心10 min，取上清血漿，立即置入-20 ℃冰箱密封保存。采用酶聯(lián)免疫法檢測血清NT-proBNP含量，嚴格按照說明書進行操作。

1.4.4 Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白相對表達水平測定：取所有處死大鼠的心臟組織制成勻漿，低溫離心后分離制備20 μg總蛋白的等分試樣，然后進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，采用半干法轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，與抗Ⅰ型膠原蛋白抗體和抗Ⅲ型膠原蛋白抗體4 ℃孵育過夜，洗滌后與過氧化物酶偶聯(lián)的二抗37 ℃孵育1 h，洗滌后使用增強型化學發(fā)光試劑盒進行顯影，檢測目的蛋白相對表達水平。

2 結 果

2.1 三組大鼠不同時間點心臟形態(tài)結構指標比較 見表1。在治療第2、4周，柑橘果膠A組、B組IVS高于模型組，LVDD低于模型組，且柑橘果膠B組與柑橘果膠A組比較差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。

2.2 三組大鼠不同時間點心臟指數(shù)與心肌膠原容積分數(shù)比較 見表2。在治療第4、8周，柑橘果膠A組、B組的心臟指數(shù)與心肌膠原容積分數(shù)低于模型組，且柑橘果膠B組低于柑橘果膠A組(均P<0.05)。

表2 三組大鼠不同時間點心臟指數(shù)與心肌膠原容積分數(shù)比較

2.3 三組大鼠不同時間點血漿NT-proBNP含量比較 見表3。在治療第4、8周，柑橘果膠A組、B組血漿NT-proBNP含量低于模型組，且柑橘果膠B組低于柑橘果膠A組(均P<0.05)。

2.4 三組大鼠不同時間點Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白相對表達水平比較 見表4。在治療第4、8周，柑橘果膠A組、B組心臟組織Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白相對表達水平低于模型組，且柑橘果膠B組低于柑橘果膠A組(均P<0.05)。

表3 三組大鼠不同時間點血漿NT-proBNP含量比較(ng/L)

表4 三組大鼠不同時間點Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白相對表達水平比較

3 討 論

心力衰竭當前在臨床上比較常見，心肌重構與心室重塑是心力衰竭發(fā)生、發(fā)展的基本機制，主要表現(xiàn)為心肌成纖維細胞增殖、轉(zhuǎn)化，心肌細胞肥大、壞死、凋亡，細胞外基質(zhì)膠原纖維沉積等[10]。隨著我國進入老齡化階段，心力衰竭的患病率呈上升趨勢，已經(jīng)成為一個嚴重的公共衛(wèi)生問題，并且當前心力衰竭的治療方法也沒有取得重大進展。已有研究[11]表明，半乳糖凝集素-3抑制劑可通過改善心肌組織異常基因表達及調(diào)節(jié)心肌細胞鈣離子轉(zhuǎn)運相關蛋白的表達發(fā)揮增強心肌收縮力的作用，從而改善機體的運動耐量、生活質(zhì)量與心功能。本研究顯示，在治療第2、4周時，柑橘果膠A組、B組IVS高于模型組，LVDD低于模型組，且柑橘果膠B組與A組比較差異也有統(tǒng)計學意義，表明半乳糖凝集素-3抑制劑在心力衰竭大鼠的應用能改善心臟結構形態(tài)。研究[12]顯示，半乳糖凝集素-3抑制劑參與心臟纖維化的調(diào)節(jié)，如心肌細胞的擴展及繼發(fā)于心肌結構的改變，可能對心肌損傷發(fā)揮保護作用。半乳糖凝集素-3抑制劑還可逆轉(zhuǎn)異戊二烯相關的心室功能障礙，減少心肌炎和纖維化的發(fā)生，從而改善機體的心室重構狀況[13]。

心力衰竭患者可表現(xiàn)為瘢痕形成、心肌細胞壞死、纖維組織增生，從而使心臟出現(xiàn)肥大和心室重塑[14]?，F(xiàn)代研究[15]表明，心力衰竭期間的心臟重塑涉及不同階段的心臟對前負荷和后負荷的致病性改變的適應性反應，也關系到表觀遺傳學的改變，從而導致機械性心肌特性的改變。本研究顯示，在治療第4、8周時，柑橘果膠A組、B組心臟指數(shù)與心肌膠原容積分數(shù)低于模型組，且柑橘果膠B組低于A組，表明半乳糖凝集素-3抑制劑在心力衰竭大鼠的應用能改善心臟指數(shù)與心肌膠原容積分數(shù)。從機制上分析，半乳糖凝集素-3抑制劑可阻止心臟過度牽拉，抑制活性氧的表達，從而抑制心臟細胞的凋亡。研究[16-17]顯示半乳糖凝集素-3抑制劑可通過保護心肌細胞及內(nèi)皮細胞死亡的方式來減弱心肌細胞的損害，從而發(fā)揮心功能保護作用。

心力衰竭治療模式歷經(jīng)了強心、擴張血管、利尿、糾正血流動力學異常等過程，但目前心力衰竭的病死率仍然較高，為此延緩疾病進展、逆轉(zhuǎn)衰竭心臟結構和功能是當前研究的重點[18]。NT-proBNP是利鈉肽類的一種肽類激素，部分房顫患者常伴有基礎心血管疾病，可直接引起NT-proBNP水平增加，也是腦鈉肽釋放增加的重要原因，心房內(nèi)NT-proBNP mRNA水平與NT-proBNP生成量隨著心房壓力緊張性的增加而上升[19]。本研究顯示，在治療第4、8周時，柑橘果膠A組、B組的血漿NT-proBNP含量低于模型組，且柑橘果膠B組低于A組，表明半乳糖凝集素-3抑制劑在心力衰竭大鼠的應用能抑制NT-proBNP的表達。從機制上分析，半乳糖凝集素-3抑制劑可促進心臟成纖維細胞轉(zhuǎn)化為肌纖維母細胞，促進心肌成纖維細胞合成膠原纖維的形成，促進心室重構，從而改善心力衰竭的病情[20]。

在心力衰竭機體中，心室重塑不僅涉及心肌細胞肥大，還與心肌纖維化存在相關性，后者可增加左室心功能失代償和心律失常的風險[21]。膠原纖維是細胞外基質(zhì)的主要結構蛋白，Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白是構成心肌膠原纖維網(wǎng)的主要成分，可分泌基質(zhì)金屬蛋白酶，促使成纖維細胞增殖并轉(zhuǎn)化為肌成纖維細胞，導致機體病情惡化。本研究顯示，在治療第4、8周時，柑橘果膠A組、B組的心臟組織Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白相對表達水平低于模型組，且柑橘果膠B組低于A組，表明半乳糖凝集素-3抑制劑在心力衰竭大鼠的應用能抑制心臟組織Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白的表達水平。從機制上分析，半乳糖凝集素-3抑制劑對缺血-再灌注損傷具有很好的治療作用，可促進纖維增生減少，抑制心肌纖維化和延遲心室重構。研究[22]顯示半乳糖凝集素-3抑制劑可顯著改善缺血性心力衰竭大鼠左心室血流動力學指標，還可抑制心臟炎癥指標的釋放，從而改善心肌纖維化。

綜上所述，半乳糖凝集素-3抑制劑柑橘果膠能抑制心力衰竭大鼠血漿NT-proBNP的表達，改善心肌纖維化，進而改善心臟指數(shù)、心肌膠原容積分數(shù)以及心臟結構形態(tài)。本研究由于經(jīng)費原因，觀察的指標比較少，且沒有納入其他藥物進行對比分析，將在后續(xù)研究中探討。