斑菲素蛋白2在食管鱗狀細胞癌組織中的表達及臨床意義

林曉溪，張俊毅

(1.錦州醫科大學赤峰學院培養基地，內蒙古 赤峰 024099；2.赤峰市醫院腫瘤內科，內蒙古 赤峰 024099；3.赤峰學院附屬醫院病理科，內蒙古 赤峰 024099；4.赤峰學院臨床病理研究所，內蒙古 赤峰 024099)

食管鱗狀細胞癌(Esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)為常見的食管癌類型，患者生存率較低，預后不良[1]。近年盡管手術、放化療等技術得到提升，但ESCC治療效果并未得到明顯改善，除部分可利用消化內鏡切除的食管早期病變之外，大多數ESCC患者5年生存率仍處于較低水平，預后不佳[2]。因此，采取行之有效的方式準確預測ESCC患者預后對臨床進一步治療及隨訪意義重大。TNM分期是評估ESCC患者預后的重要方式，但TNM分期對于不能進行手術的患者仍存在局限性，部分患者無法明確分期，且對于僅能獲得小標本的患者更是如此[3-4]。斑菲素蛋白2(Plakophilin 2，PKP2)屬于細胞黏附分子連環蛋白catenin家族成員之一，主要定位于橋粒，參與穩定細胞黏附連接作用，對維持細胞橋粒功能具有重要意義[5]。PKP2不僅對信號傳導及細胞連接具有一定作用，而且參與腫瘤的發生、發展[6]。目前關于PKP2用于評價惡性腫瘤及預后的研究較少，而將其在ESCC中的表達意義也未見報道。基于此，本研究分析PKP2在ESCC中的表達意義，以探究該指標用于預測ESCC患者預后的臨床價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇赤峰學院附屬醫院2010年1月至2015年12月收治的115例ESCC患者的組織標本和20例癌旁正常食管組織標本。另選取15例冰凍新鮮食管癌標本及癌旁正常食管上皮標本提取RNA用來檢測PKP2的表達。115例ESCC患者中，男性87例，女性28例；中位年齡57歲；腫瘤pTNM分期[7]中，Ⅰ期14例，Ⅱ期45例，Ⅲ期56例，Ⅳ期0例；分化程度[8]中，高分化20例，中分化84例，低分化11例；淋巴結轉移50例；27例腫瘤最長徑>3 cm，88例≤3 cm；食管上段7例，中段50例，下段58例。患者術后隨訪資料完整。病例納入標準：經病理學檢查證實為ESCC；患者資料完整，包括本研究所需資料；術前未接受其他抗腫瘤治療；無其他良惡性腫瘤。排除標準：因嚴重術后并發癥或其他原因導致的病死患者；術前發生全身轉移者；既往存在其他惡性腫瘤病史；合并肝功能衰竭、腎功能衰竭等其他重要臟器疾病者；合并血液系統疾病者；伴免疫系統疾病者等。

1.2 試劑與儀器 鼠抗人單克隆抗體PKP2(批號：20090816、20110626、20130507，美國Santa Cruz公司)；免疫組化試劑盒(PV-9000，上海欣奧盛)；DAB 酶底物顯色試劑盒(福州邁新生物公司)；圖像采集分析系統、石蠟切片機(德國Leica公司)。

1.3 檢測方法

1.3.1 制備組織芯片：組織標本用10%的中性福爾馬林溶液固定，由經驗豐富的病理科醫師對癌組織及癌旁組織取材，常規脫水，浸蠟包埋。制備組織芯片前進行HE染色，選擇蠟塊上具有代表性區域，用組織點樣儀在蠟塊上取孔，獲得組織條(直徑約為1.5 mm)，再使用蠟塊模打孔儀制作組織芯片蠟塊。切片4 μm厚的組織芯片，撈片置于陽離子防脫載玻片上，制成組織芯片，并由病理科醫師判讀確認取點正確。

1.3.2 免疫組織化學染色：采用二步法免疫組織化學染色法。檢測開始前，將組織芯片的切片置于恒溫箱中烤片，脫蠟水洗，進行微波抗原修復(95 ℃)。切片與一抗孵育過夜。沖洗后進行DAB顯色，復染。結果判定：在光鏡下進行觀察，計400個細胞。①染色強度：0分為陰性，弱陽性、中度、強陽性分別記為1、2、3分。②陽性細胞數：0分為無；1分為0%～25%；2分為25%～50%；3分為50%～75%；4分為75%以上。染色強度與陽性細胞數評分乘積為最終得分，低于2分為陰性表達，反之為陽性表達。

1.3.3 PKP2 mRNA相對表達量檢測：以β-actin為內參，采用RT-PCR方法檢測PKP2 mRNA相對表達量。測量3次，取平均值。

2 結 果

2.1 癌旁組織與ESCC組織免疫組化染色結果比較 見圖1。20例癌旁組織中，PKP2陽性信號主要定位在細胞質，且表達微弱，依據評分標準被評為陰性。115例ESCC組織中，PKP2陽性信號主要定位在細胞質，且陽性細胞數與染色強度顯著增加，其中54例患者呈陽性表達，占比46.96%(54/115)，較癌旁正常食管上皮表達(0/20)顯著增高(χ2=15.652，P<0.001)。

2.2 PKP2表達與臨床病理參數間的關系 見表1。陽性表達組淋巴結轉移、TNM高分期占比較陰性表達組高(均P<0.05)。兩組其他項目比較，差異無統計學意義(均P>0.05)。

2.3 不同PKP2表達患者生存情況分析 見圖2。54例PKP2陽性表達患者隨訪結束后，死亡44例，病死率為81.48%。61例PKP2陰性表達患者隨訪結束后，死亡30例，病死率為49.18%。PKP2陽性表達組患者病死率高于陰性表達組(χ2=11.88，P=0.001)。生存分析發現，PKP2陽性表達患者的總生存時間為(24.173±2.045)個月，短于陰性表達組的(38.472±2.769)個月(t=31.157，P<0.001)。

圖1 正常食管組織及ESCC組織中PKP2免疫組化染色結果(×200)

表1 PKP2表達與臨床病理參數間的關系(例)

圖2 不同PKP2表達患者Kaplan-Meier生存分析曲線

2.4 癌旁組織與ESCC組織PKP2 mRNA表達比較 見圖3。癌旁組織中PKP2 mRNA平均灰度值為0.25±0.07，而ESCC組織PKP2 mRNA平均灰度值為0.86±0.03，ESCC組織中PKP2 mRNA平均灰度值高于癌旁組織(t=65.638，P<0.05)。

圖3 三對癌旁組織(N)和ESCC組織(T)中

2.5 PKP2預測價值分析 將表1中初次經卡方檢驗差異有統計學意義的臨床病理參數(淋巴結轉移和TNM分期)作為狀態變量，將PKP2表達作為檢驗變量，繪制ROC曲線進行分析，結果顯示PKP2高表達用于預測淋巴結轉移、TNM分期的AUC分別為0.785(95%CI：0.648～0.801，P<0.001)和0.763(95%CI：0.629～0.797，P<0.001)，因此具有一定預測價值。

3 討 論

ESCC是常見的食管癌類型，若得不到及時、有效的診治，腫瘤細胞不斷擴散，將增加遠處轉移風險，導致患者病死[9-10]。目前外科手術仍是ESCC首選治療方式，可有效切除病灶，改善患者臨床癥狀。但研究[11]發現，ESCC患者術后5年生存率并無顯著提高。因此，尋求科學有效的可預測ESCC患者預后的指標成為臨床研究重難點。既往研究表示，年齡、病理分期、腫瘤分化程度、腫瘤部位等因素與ESCC患者的預后有密切聯系，但近年發現年齡、疾病分期等相似患者的預后也有差異[12-13]。這可能與基因、多步驟等參與腫瘤發生及發展有關[14]。

PKP蛋白主要包括PKP1、PKP2、PKP3，所有p120ctn家族成員分子結構中均含45個氨基酸，主要定位在橋粒[15]。PKP蛋白與p120ctn參與穩定細胞黏附連接作用相似，在維持細胞橋粒中起到重要作用。此外，研究顯示該家族很多成員在腫瘤發生及發展中起到重要作用。研究[16-17]報道，PKP3在非小細胞肺癌中呈高表達，與患者預后具有密切聯系，且對該蛋白進行干擾后腫瘤細胞的生長也受到明顯抑制。另有研究[18]發現，PKP3蛋白中mRNA增高對早期診斷胃腸道腫瘤有一定提示作用。研究[19]顯示，在頭頸部鱗癌中PKP1 mRNA過表達，且與PKP結構相似的p120ctn異常表達也與惡性腫瘤發生及發展有關。而PKP2作為p120ctn家族成員之一，推測其可能與腫瘤進展存在一定聯系，但目前關于其與ESCC患者的預后關系研究更少。

本研究結果顯示，與癌旁組織比較，PKP2在ESCC組織中表達更高，且陽性表達組患者TNM高分期占比、淋巴結轉移率高于陰性表達者，提示PKP2在ESCC中發揮促癌基因作用，其表達水平升高可能參與并推動腫瘤的發生及發展。另外，研究結果也提示PKP2表達增高是由其基因在癌組織中高表達所致。生存分析發現，PKP2陽性表達組患者的總生存時間短于陰性表達者，提示PKP2陽性表達可能與ESCC患者生存時間有關。分析原因可能為：PKP2作為PKP蛋白家族成員，在上皮細胞中廣泛表達，通過誘導表皮生長因子受體磷酸化并促進其活化介導腫瘤細胞生長信號，激活下游信號途徑，從而刺激ESCC腫瘤細胞異常增殖，促進腫瘤的進展。PKP2也是一種橋粒結構成分，可以作為多功能支架進行黏附和信號傳遞，其高表達可通過調節局部黏附動力學和整合素蛋白表達支持腫瘤細胞的侵襲及轉移，促進腫瘤進展，從而影響ESCC患者的預后。Fujita等[20]研究證實，PKP2表達與食管癌患者生存時間有關，本研究結果與之相符。ROC曲線分析結果顯示，PKP2陽性表達可能預示ESCC患者淋巴結轉移、TNM高分期風險，此時臨床需結合該特征進行早期預測、診斷并干預，以最大限度地提高患者生存率。

綜上所述，ESCC患者PKP2較癌旁組織表達增高，用于預測ESCC患者生存情況、TNM分期及淋巴結是否轉移等有一定應用價值。但PKP2具體作用機制尚未明確，尚無較多循證學依據可作為理論支持；且本研究受納入樣本量及隨訪時間等限制，結果可能存在一定偏倚，研究仍有局限，對于PKP2表達是否能夠作為ESCC預后預測因子還需今后進一步研究證實。