UPLC-ESI-MS/MS測定大鼠血漿降血壓肽的方法學(xué)研究*

何利思，王金林，崔淑芬

UPLC-ESI-MS/MS測定大鼠血漿降血壓肽的方法學(xué)研究*

何利思，王金林，崔淑芬*

（深圳職業(yè)技術(shù)學(xué)院 食品藥品學(xué)院，廣東 深圳 518055)

建立了超高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-ESI MS/MS）法測定大鼠血漿中的重組降血壓肽VLPVPR的方法．大鼠血漿樣品經(jīng)甲醇沉淀蛋白處理后，經(jīng)Thermo Hypersil GOLD C18柱（100 mm×2.1 mm，1.9 μm）分離，流動相為10 mmol·L 乙酸銨水溶液-乙腈．梯度洗脫流程為：0～4 min乙腈（vol%）10%～90%；4～4.5 min乙腈90%～10%，4.5～6.5 min乙腈保持10%，流速：0.2 mL·min-1．質(zhì)譜條件采用ESI離子源，檢測方式為正離子電離，選擇性離子檢測（MRM）．VLPVPR和內(nèi)標(biāo)VLPVPR-R位C，N雙標(biāo)的選擇性檢測離子分別為m/z 680.4→255.2和m/z 690.6→264.2．VLPVPR濃度在0.1～100 ng·mL-1范圍內(nèi)線性良好；定量下限為0.1 ng·mL-1；日內(nèi)、日間RSD均小于15%；低、中、高3個(gè)濃度下的提取回收率分別為（101±7.4）%；（99±4.2）%；（100±3.3）%．該方法專屬性強(qiáng)，靈敏度高，血漿中內(nèi)源物對測定無干擾，適用于復(fù)雜生物基質(zhì)中VLPVPR的檢測，可用于VLPVPR藥代動力學(xué)方面的研究．

超高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜；重組降血壓肽；內(nèi)標(biāo)法；大鼠血漿

降血壓肽是一類具有血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（ACE，angiotensin converting enzyme）抑制活性的多肽物質(zhì)，已成功地從魚貝蝦類、肉類、大豆、酪蛋白、玉米、酒糟等[1-5]眾多食物蛋白質(zhì)中獲得．降血壓肽VLPVPR（Val-Leu-Pro-Val-Pro-Arg）是本課題組依靠酶解和基因工程技術(shù)所獲得的一種新型的降血壓肽[6]，其高劑量可顯著降低SHR大鼠的收縮壓，給藥劑量明顯低于卡托普利[7]．多肽的定量分析是當(dāng)前的研究熱點(diǎn)，其分析方法主要包括免疫法、HPLC法、毛細(xì)管電泳法[8]、HPLC-Q-TOF-MS法[9]等，其中HPLC應(yīng)用最廣泛．超高效液相色譜（UPLC）作為一種新型液相色譜技術(shù)，具有靈敏度更高、分離能力更強(qiáng)、分析速度更快、與HPLC方法轉(zhuǎn)換簡單以及良好的質(zhì)譜入口等特點(diǎn)，為藥物尤其是蛋白多肽類的藥代動力學(xué)研究開辟了廣闊的前景[10]．UPLC-MS/MS集超高效液相色譜的高分離性能與質(zhì)譜的高靈敏度、高專屬性的優(yōu)點(diǎn)于一體，為多肽藥物的快速分析提供了一個(gè)重要的技術(shù)，應(yīng)用到各種基質(zhì)中多肽的定量[11,12]．本文建立并驗(yàn)證了UPLC-ESI-MS/MS法測定大鼠血漿中VLPVPR的方法．

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與材料

液相色譜系統(tǒng)為ACCELA超高效液相色譜儀（美國Thermo Fisher公司）；三重四極桿質(zhì)譜儀為TSQ Vantage，配備ESI電噴霧離子源以及Xcalibur 2.1數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)（美國Thermo Fisher公司）；5810 R高速冷凍離心機(jī)（德國eppendorf），MSA3.6P-0CE-DM微量天平（感量：0.001 mg，德國賽多利斯）；Milli-Q純水系統(tǒng)（美國Millipore公司）．

降血壓肽VLPVPR對照品和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)（VLPVPR-R位C，N雙標(biāo)）均由強(qiáng)耀生物科技有限公司（Chinapeptides. Co., Ltd）合成，純度＞95%．甲醇、乙腈、乙酸銨均為色譜純（美國Sigma-aldrich公司）；其余試劑(分析純，市售)；實(shí)驗(yàn)用水均為去離子水．

1.2 方法

1.2.1 溶液的配制

儲備液配制：分別精密稱取VLPVPR、VLPVPR-R位C，N雙標(biāo)對照品2 mg，去離子水溶解，于10 mL容量瓶中定容，配制成200 μg·mL-1的儲備液，-20 ℃避光保存．

標(biāo)準(zhǔn)使用液配制：臨用前，用去離子水將標(biāo)準(zhǔn)儲備液逐級稀釋至實(shí)驗(yàn)所需濃度，制備成標(biāo)準(zhǔn)使用液（0.1～100 ng·mL-1），其中內(nèi)標(biāo)濃度為10 ng·mL-1．

基質(zhì)添加標(biāo)準(zhǔn)使用液配制：取空白血漿按“血漿樣品處理”項(xiàng)下進(jìn)行操作，最后用標(biāo)準(zhǔn)使用液復(fù)溶，得基質(zhì)添加標(biāo)準(zhǔn)使用液．

質(zhì)控制樣品配制：分別取適量VLPVPR及VLPVPR-R位C，N雙標(biāo)的儲備液用水稀釋至合適的濃度，加入空白血漿配制成3個(gè)不同濃度（0.2、10、50 ng·mL-1）質(zhì)量控制樣品（內(nèi)標(biāo)濃度為10 ng·mL-1）．

1.2.2 血漿樣品處理

取200 μL大鼠血漿，加入50 μL VLPVPR-R位C，N雙標(biāo)，混勻，再加入600 μL甲醇，渦旋10 s，4 ℃下冷凍15 min，12000 r·min-1離心5 min，取上清液，氮?dú)獯蹈桑?00 μL水溶解，渦旋10 s，取液體至內(nèi)襯管，上機(jī)分析．

1.2.3 色譜條件與質(zhì)譜條件

色譜條件：色譜柱為Thermo Hypersil GOLD（100 mm×2.1 mm，1.9 μm）；流動相A為10 mM 乙酸銨水溶液，流動相B為乙腈．梯度洗脫程序?yàn)椋?～4 min乙腈（vol%）10%～90%；4～ 4.5 min乙腈90%～10%，4.5～6.5 min乙腈保持10%．流速：0.2 mL·min-1．

質(zhì)譜條件：霧化電壓：3000 V；溫度 400 ℃；鞘氣：40 arb；輔助氣：5 arb；離子傳輸毛細(xì)管溫度：300 ℃；碰撞氣：1.2 mTorr．

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜及質(zhì)譜條件優(yōu)化

2.1.1 色譜條件優(yōu)化

在流動相中加入一定濃度的揮發(fā)性無機(jī)酸用來作為離子對試劑可以用來提高色譜分離能力，同時(shí)提高樣品離子化效率．本文考察了3種流動相：水-乙腈，0.1%甲酸-乙腈，10 mM乙酸銨-乙腈．當(dāng)流動相為水-乙腈時(shí)，峰形較差，當(dāng)流動相為0.1%甲酸-乙腈時(shí)，基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)大，故最終選用10 mM乙酸銨-乙腈為流動相．

2.1.2 質(zhì)譜條件優(yōu)化

在正離子模式下優(yōu)化質(zhì)譜條件，采用流動注射，以10 μL·min-1的速度將樣品溶液注入到電噴霧離子源，優(yōu)化錐孔電壓（Skimmer offset）、碰撞能量（Collision energy）等質(zhì)譜參數(shù)．由一級全掃描光譜可知，VLPVPR在ESI正離子電離方式下主要生成m/z 680.4和340.9，其中m/z 680.4為準(zhǔn)分子離子峰．選擇性對m/z 680.4進(jìn)行二級質(zhì)譜全掃描分析，生成的主要碎片離子為m/z 255.1、169.2等．經(jīng)過調(diào)節(jié)儀器參數(shù)后得到穩(wěn)定且豐度最高的子離子m/z 255.1作為定量離子，而m/z 169.2豐度較高，且與m/z 255.1比例保持穩(wěn)定，因此作為定性離子．實(shí)際樣品分析的離子對選擇見表1．

2.2 專屬性試驗(yàn)

取空白血漿、空白血漿+1 ng·mL-1的VLPVPR樣品加入10 ng·mL-1的VLPVPR-R位C，N雙標(biāo)樣品，按“血漿樣品處理”項(xiàng)下操作，考察大鼠血漿中內(nèi)源性物質(zhì)對VLPVPR和內(nèi)標(biāo)物的干擾情況．典型的方法特異性色譜圖如圖1所示．由圖1可見，在VLPVPR和內(nèi)標(biāo)的出峰時(shí)間，沒有其它干擾性色譜峰的出現(xiàn)，血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)不干擾待測物VLPVPR的測定，方法的選擇性好．

表1 離子對選擇和質(zhì)譜參數(shù)表

A為空白血漿分析物選擇離子掃描圖譜；B為空白血漿內(nèi)標(biāo)物選擇離子掃描圖譜；C為VLPVPR色譜圖；D為內(nèi)標(biāo)VLPVPR-R位C，N雙標(biāo)色譜圖

2.3 線性范圍和定量下限

配制0.1、1、10、50、100 ng·mL-1的基質(zhì)添加標(biāo)準(zhǔn)使用液，建立工作曲線．以血漿中VLPVPR濃度為橫坐標(biāo)，以VLPVPR峰面積與VLPVPR-C，N雙標(biāo)峰面積的比率為，用加權(quán)（1/2）最小二乘法進(jìn)行回歸運(yùn)算，求得直線回歸方程=0.20446，2=0.9992．

取定量下限的樣品（VLPVPR的濃度為0.1 ng·mL-1），按“血漿樣品處理”項(xiàng)下操作，進(jìn)行6樣本分析，根據(jù)當(dāng)日標(biāo)準(zhǔn)曲線求得每一樣本測得濃度，求得該濃度的RSD=7.40%．該結(jié)果表明UPLC-ESI-MS/MS法測定血漿中VLPVPR的定量下限可達(dá)0.1 ng·mL-1．

2.4 精密度和準(zhǔn)確度

按“血漿樣品處理”項(xiàng)下操作處理低、中、高3個(gè)濃度（0.1、10、50 ng·mL-1）的質(zhì)控樣品，每個(gè)濃度平行處理6份，依法與標(biāo)準(zhǔn)曲線同批測定，以當(dāng)日的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算質(zhì)控樣品濃度，據(jù)此求算方法的精密度與準(zhǔn)確度．日內(nèi)精密度和準(zhǔn)確度由對3個(gè)濃度水平的質(zhì)控樣品進(jìn)行分析來評價(jià)，日間精密度和準(zhǔn)確度由對同樣的質(zhì)控樣品在連續(xù)3d內(nèi)進(jìn)行分析來評價(jià)．精密度和準(zhǔn)確度分析結(jié)果良好，見表2．

2.5 回收率和基質(zhì)效應(yīng)

低、中、高3個(gè)濃度（0.1、10、50 ng·mL-1）的質(zhì)控樣品，加入空白血漿，按“血漿樣品處理”項(xiàng)下操作，得VLPVPR色譜圖峰面積．另取100 μL空白大鼠血漿，加入600 μL甲醇，其余操作按“血漿樣品處理”項(xiàng)下步驟提取、吹干，分別向吹干管加入3個(gè)質(zhì)控濃度的VLPVPR標(biāo)準(zhǔn)溶液復(fù)溶后測定，得到VLPVPR色譜圖峰面積．將前者VLPVPR色譜圖峰面積與后者相應(yīng)濃度標(biāo)準(zhǔn)VLPVPR色譜圖峰面積進(jìn)行比較，考察VLPVPR的提取回收率．

質(zhì)譜檢測中的“基質(zhì)效應(yīng)”嚴(yán)重影響定量分析的準(zhǔn)確度和精密度，因此UPLC-MS/MS測定生物樣品時(shí)必須重視基質(zhì)效應(yīng)的影響．取空白血漿，加入濃度為0.1、10、50 ng·mL-1的質(zhì)控樣品溶液，按“血漿樣品處理”操作，進(jìn)樣分析，將測得的峰面積與對應(yīng)濃度的質(zhì)控溶液測得的峰面積比較，計(jì)算方法的基質(zhì)效應(yīng)．

表2 大鼠血漿中VLPVPR檢測的精密度和準(zhǔn)確度

結(jié)果表明該方法提取回收率高，樣品損失較少，濃度變化不影響提取回收率，方法穩(wěn)定．同時(shí)，VLPVPR低、中、高3個(gè)濃度的基質(zhì)效應(yīng)基本一致，分別為（135±1.4）%，（134±2.0）%，（134±1.6）%．該方法在不同濃度的樣品中，離子增強(qiáng)或減弱效應(yīng)是一致的，建立的色譜質(zhì)譜方法可以有效避免大鼠血漿中基質(zhì)干擾，結(jié)果見表3．

2.6 VLPVPR降解曲線

因?yàn)閂LPVPR加入大鼠血漿中降解很快，無法做穩(wěn)定性穩(wěn)定，所以本文考察了VLPVPR的降解曲線．取空白血漿，配制成VLPVPR濃度為10 ng·mL-1，各取200μL該樣品血漿至9個(gè)2 mL離心管中，按1、11、21、31、41、51、61、71、81 min后加入50μL濃度為40 ng·mL-1的內(nèi)標(biāo)，立即按“血漿樣品處理”項(xiàng)下處理，結(jié)果如圖2所示．

由VLPVPR降解曲線可知，在血漿條件下，VLPVPR在81 min已經(jīng)基本降解，因此在藥代動力學(xué)研究時(shí)應(yīng)考慮如何快速取血，以及在樣品處理過程中降低酶的活性．

表3 回收率和基質(zhì)效應(yīng)（n=6）

圖2 VLPVPR在大鼠血漿中降解曲線

3 結(jié) 論

本研究前處理操作簡單、取樣量少，靈敏度高、專屬性強(qiáng)，且血漿中內(nèi)源物對測定無干擾，經(jīng)方法學(xué)考察確證其回收率和精密度均符合生物樣品測定的要求，可滿足低劑量大鼠給藥后體內(nèi)藥代動力學(xué)的研究．

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Methodological Study of the Determination of Antihypertensive Peptide in Rat Plasma by UPLC-ESI-MS/MS

HE Lisi1, WANG Jinlin1, CUI Shufen1*

（）

To establish an UPLC-ESI-MS/MS method for the determination of recombinant antihypertensive peptide VLPVPR in rat plasma, plasma samples were precipitated by methanol, and the analyte was then separated on a Thermo Hypersil GOLD C18(100 mm×2.1 mm, 1.9 μm) with the mobile phase of acetonitrile and 10 mmol?L-1ammonium acetate at a flow rate of 0.2 mL?min-1. Gradient elution program: acetonitrile 10%～90%, 0～4 min; acetonitrile 90%～10%, 4～4.5 min; acetonitrile 10%, continue 2 min. Detection was carried out by electrospray positive ionization mass spectrometry in the multiple reaction monitoring (MRM) mode of the triple quadrupole rod tandem mass spectrometer. Monitoring the transitions m/z 680.4→255.2 for VLPVPR and m/z 690.6→264.2 for VLPVPR-R C, N double labeled. Good linearity was obtained over the range of 0.1～100 ng?mL-1, and the LOQ was 0.1 ng?mL-1. The intra-and inter-day previsions were all below 15% (RSD). The three different concentrations (low，medium，high) recovery of VLPVPR was (101±7.4)%, (99±4.2)% and (100±3.3)% respectively. The UPLC-ESI MS/MS method for VLPVPR determination is specificity and sensitivity, and could be applied to the pharmacokinetic study.

UPLC-ESI-MS/MS; recombinant antihypertensive peptide; internal standard method; rat plasma

R917

A

1672-0318（2022）03-0055-05

10.13899/j.cnki.szptxb.2022.03.009

2021-11-15

深圳市科技計(jì)劃資助項(xiàng)目（GJHZ20180928161212140）．

何利思，男，廣東茂名人，主管藥師，研究方向：樣品前處理新方法和藥物分析．

崔淑芬，女，遼寧撫順人，教授，博士，研究方向：樣品前處理新方法和藥物分析．

（責(zé)任編輯：王璐）