基于SSR 標記的無翼坡壘遺傳多樣性研究

蔡 穎，段繼煜，朱思奇，任明迅,2，唐 亮,2

（1. 海南大學 生態與環境學院，海口 570228; 2. 海南大學 環南海陸域生物多樣性研究中心，?？?570228）

熱帶雨林分布在赤道附近降雨充沛的熱帶地區，是1 種具有獨特外貌和群落結構，物種多樣性很高的森林生態系統[1?2]。熱帶雨林在調節局部與全球氣候、維持生物多樣性和生態平衡等方面發揮著重要作用[3]。我國熱帶地區位于亞洲熱帶北緣，是東南亞熱帶雨林向北延伸的邊界，主要包括西藏東南部、云南和廣西南部、臺灣南部和海南島，其中，海南島具有我國分布最集中、連片面積最大的熱帶雨林[4?6]。龍腦香科(Dipterocarpaceae)是海南島熱帶雨林的標志性樹種，廣泛分布在海南島700 m 以下的低海拔山地[7]。胡玉佳[7]根據群落結構和生態外貌特征，將海南島的龍腦香群落分為混合群落與單優群落，后者包括單優青皮林與單優無翼坡壘林。與原生演替形成的單優青皮林不同，單優無翼坡壘林是經過多次人為干擾破壞后，通過次生演替形成的[8]。自20 世紀70 年代在甘什嶺發現無翼坡壘以來，許多學者圍繞單優無翼坡壘林開展了種群、群落和區系研究。胡玉佳[7]在1983 年調查了無翼坡壘林的物種組成，發現群落的物種數較少，森林尚處于更新階段。最近，邢福武等[9]和漆良華等[10]再次調查了無翼坡壘群落，發現物種數有所增長，表明甘什嶺保護區在物種保護上發揮了積極的作用。楊小波等[11?13]研究了無翼坡壘的種群結構，分布格局，物種多樣性和空間配置，確定無翼坡壘為增長型種群，但自疏作用強烈，生長到一定階段后個體數量減少，種群的集群程度變小。胡璇等[14]針對無翼坡壘種群結構與動態的最新研究顯示，老齡樹的比例較25 年前有所增長，種群結構在向好的方向發展，但無翼坡壘的幼齡樹對病害敏感，且生長受磷元素限制[15?17]。光合生理特性研究顯示，雖然無翼坡壘為耐陰樹種，但到一定時期后需要充足的光照才能生長更好，否則將進入長時間的蹲苗期[18]。林中無翼坡壘的密度大，光照和養分條件差，種內競爭激烈，群落總體上仍處在不穩定階段[8]。加上分布范圍局限，適生區面積狹小[19]，國際自然保護聯盟（IUCN）將無翼坡壘評級為極度瀕危種（https://www.iucnredlist.org/species/33393/9776515），所以海南島無翼坡壘的生存狀況仍然不容樂觀。現有報道主要集中在無翼坡壘種群與群落生態的研究上，缺乏遺傳多樣性的評估與分析。種群遺傳變異是闡明物種進化歷史和生態適應的基礎[20]，是評價物種存活潛力、解釋瀕危原因的重要依據[21?22]。因此，研究瀕危物種的遺傳多樣性和遺傳結構是制定其保護策略的前提。

簡單重復序列(simple sequence repeats，SSR)[23]，也稱為微衛星(microsatellite)，是基因組中以1～6個核苷酸為單位的串聯重復序列，長度一般在100～200 bp 之間。因其多態性高、易于檢測等優點[24]，廣泛應用于瀕危物種的保護研究[25?26]。龍腦香科瀕危樹種常用微衛星標記評估遺傳多樣性，用以指導保護管理。LEE 等[27]發現娑羅雙屬的極度瀕危種Shorea lumutensis 仍具有較高水平的微衛星變異，但因個體數量不足500，建議通過就地保護與遷地保護相結合的方式實施物種保護。坡壘屬的極度瀕危種狹葉坡壘(Hopea chinensis)僅在越南廣寧和中國廣西發現，TRANG 等[28]使用SSR標記檢測到種群瓶頸和高水平近交，揭示種群規?？s小是狹葉坡壘瀕危的主要原因。WANG等[29]利用12 對SSR 標記評估了海南島瀕危植物坡壘(H. hainanensis)的遺傳多樣性，發現坡壘的微衛星變異水平明顯低于同屬的非瀕危種H.dryobalanoides，推斷種群瓶頸是坡壘遺傳變異喪失的可能原因。綜上所述，SSR 標記是研究龍腦香科瀕危物種保護的有效分子標記。本研究利用11 個微衛星標記度量海南甘什嶺無翼坡壘種群的遺傳多樣性，并分析種群遺傳結構，評估無翼坡壘遺傳變異下降的程度，旨在為制定無翼坡壘合理的保護措施提供遺傳學依據。

1 材料和方法

1.1 無翼坡壘種群樣本采集研究區域位于海南省甘什嶺省級自然保護區（109°34′～109°42′ E,18°21′～18°26′N）。甘什嶺屬低山丘陵地貌，海拔約50～681 m，坡度<50°，土壤母質以花崗巖為主，巖層裸露率10%，屬熱帶海洋季風氣候，干濕季分明，雨季集中在5~10 月，年降雨量約為1 800 mm。年平均氣溫25.4 ℃，地帶性森林類型是以無翼坡壘為優勢種的熱帶低地雨林[9?10]。甘什嶺保護區建立于1985 年，主要保護目標是單優無翼坡壘林。本研究根據胸徑將無翼坡壘劃分為3 個齡級：幼齡（Ⅰ）（胸徑 ≤ 2.5 cm），中齡（Ⅱ）（2.5 cm <胸徑 ≤ 7.5 cm）和成熟齡（Ⅲ）（胸徑 >7.5 cm）。在面積2 500 m2的樣方內，隨機選取59 株空間上均勻分布的無翼坡壘，3 種齡級分別有21（Ⅰ）、20（Ⅱ）和18（Ⅲ）株。選擇無病害的嫩葉，采下后立即用硅膠干燥，保存備用。并記錄采樣個體的樹高和胸徑。

1.2 DNA 提取和PCR 擴增采用改良CTAB 法提取基因組DNA[30]?；蚪MDNA 的濃度和質量用NanoDrop 2000 分光光度計測量。本實驗利用WANG 等[31]針對坡壘設計的35 對微衛星引物，從中篩選出在無翼坡壘中能穩定擴增，且多態的11 對引物用于后續試驗。PCR 擴增在Eppendorf的熱循環儀中進行?？偡磻w積30 μL，由1 μL的模板DNA（50 μg·mL?1），1 μL 正反向引物（10 μmol·L?1），15 μL 2× Taq PCR MasterMix（TIANGEN

生物技術，北京）和12 μL ddH2O。循環程序如下：首先94 ?C 預變性4 min，然后循環30 次，其中94 ?C變性30 s，56～63 ?C 退火30 s，72 ?C 延伸1 min，循環結束后再72 ?C 延伸12 min。使用ABI 3730XL 分析儀（Applied Biosystems）進行片段分析，使用GeneMarker 軟件進行微衛星位點的基因分型（ SoftGenetics, State College, Pennsylvania,USA）。

1.3 數據分析無翼坡壘為同源四倍體，因此本研究采用MAC-PR 方法，根據峰值強度比值確定等位基因劑量[32]。由于MAC-PR 方法不能完全解決等位基因劑量未知導致基因分型的不確定性，同時考慮到多倍體物種在減數分裂時可能發生的雙減數，使標準群體遺傳分析結果出現偏差[33]。因此，筆者用GENDIVE version3.04[34]和POLYGENE version1.2b[35]2 個軟件解決因劑量信息缺失及減數分裂時發生雙減數等產生的問題。在POLYGENE version 1.2b 軟件實現了4 種多體遺傳模型，根據貝葉斯信息準則（Bayesian information criterion,BIC）選擇最優模型，基于最優模型計算遺傳多樣性的各項指標，如等位基因數（Na）、有效等位基因數（Ne）、觀測雜合度（Ho）和期望雜合度（He）。

哈溫平衡近郊系數(Gis)GENODIVE期望雜合度(He)觀合度(Ho)測雜0.663 0.650 ?0.020 ?0.048標指效等位(Ne)性有基因數2.792樣多傳香農指數(I)1.035遺的記SSR 標多態信息含量(PIC)0.550 11 個POLYGENE期望雜合度(He)群種壘觀測雜度(Ho)合0.664 0.628坡翼無的3算等位基因數(Na)/個GenDive 3.04 計產物長度/bp 140～180 Polygene version 1.2b 和單元重復TTCT(4*7)據 1 根表引物序列 (5′–3′)F:ACATGGTCTTTGTTATCTGCTTA R:CCATGGTGCTACAACCTTTCTTG位點Hre1 0.525 0.555 0.053 0.144 2.207 1.059 0.545 0.525 0.613 4 120～170 AT(2*10)F:TTCATGGTCATTGAGTCATAGGT R:GCCTCTACCTAGTGTATGAAGGC Hre2 0.600 0.515 ?0.166 ?0.144 2.039 0.839 0.433 0.601 0.540 AAAATA(6*4) 135～1703 F:TGCTATTCTACCCTAAAAACCCA R:TGGTTGATGCTCTCACAAGCTAT Hre3 0.555 0.480 ?0.157 ?0.085 1.901 0.845 0.436 0.561 0.538 3 100～150 AAG(3*5)F:GATGAGGGATAATGGTGCGTTTG R:CAACTCACGCCTCTGTGTTATTG Hre4 0.618 0.557 ?0.108 ?0.131 2.226 0.952 0.497 0.622 0.586 3 120～150 CTG(3*5)F:AAGTCACCTCCATCCATTTCTCC R:ATGCGGTGAAGAATCATTGGAAC Hre5 0.694 0.661 ?0.050 ?0.096 2.879 1.208 0.604 0.698 0.666 4 140～170 AC(2*8)F:CCTGGAAATCAAAGATGAATCAGCT R:TTGGGGAGGGTAAATAGCAGATG Hre6 0.697 0.614 ?0.134 ?0.230 2.539 1.061 0.540 0.698 0.616 4 140～170 GA(2*7)F:CCGTGGGAGATAGGACATCATTA R:GTTGTGCTTTCACTTATTCATCCCT Hre70.629 0.625 ?0.007 0.020 2.607 1.068 0.573 0.630 0.646 3 140～195 TTA(3*5)F:ATTGTGGATGTAGCTATGGTGAC R:TGTACGGACATTTGGTGGAATCA Hre8 0.342 0.303 ?0.128 ?0.030 1.428 0.535 0.289 0.343 0.350 75～1152 TTTTA(5*6)F:AGTTGGAGATTAAAGAAAGTGGCT R:TTCAATTTAGACCCGTGGACCTC Hre9 0.671 0.569 ?0.181 ?0.033 2.285 1.192 0.598 0.669 0.653 80～1354 AT(2*8)F:TGAGATTCACATGGTTACTGGAA R:ACCATAATTCAAGAAGCATACGCA Hre10 0.420 0.709 0.407 0.402 3.282 1.589 0.716 0.427 0.751 7 135～170 AT(2*9)F:GCTTTCTGCATTTCCTTGAGAGA R:TGATTAGCTGCTGAATTTGGCTG Hre11

使用Structure version 2.3.4[36]分析種群的遺傳結構。K 值從1 到10，每個K 值進行10 次獨立運算，burn-in 設置為100 000 次，然后是1 000 000次MCMC（馬爾科夫鏈蒙特卡羅）迭代。最佳K 值使用STRUCTURE Harvester 程序推斷[37]。使用Clumpp version 1.1.2[38]的Greedy 算法重排最優K 值的10 次重復結果，最后由Distruct version 1.1[39]生成種群結構的圖形表示?；贑avalli-Sforza[40]的遺傳距離，使用MEGA 5.0 軟件包[41]構建無翼坡壘個體的鄰接樹。根據Cavalli-Sforza 的弦距離做主坐標分析（PCoA），當等位基因的劑量未知時，弦距離是偏差最小的距離測度[42]。將微衛星等位基因頻率劃分為10 個等級（0～0.1, 0.1～0.2, ..., 0.9～1.0），使用POLYGENE 的最佳多體遺傳模型估計各個等位基因的頻率，繪制微衛星等位基因頻率的直方分布圖。采用定性的圖形法確定無翼坡壘是否經歷了種群瓶頸[43]。圖解法的基本原理是，與普通等位基因相比，稀有等位基因會在瓶頸期間迅速丟失。因此，無論突變率和模型如何，在出現瓶頸后，低頻( < 0.1)的等位基因都會比中頻(0.101~0.200)的等位基因少。

2 結果與分析

2.1 無翼坡壘的遺傳多樣性針對坡壘開發的35 個微衛星標記中，11 個能在無翼坡壘中穩定擴增且有多態性，用于無翼坡壘遺傳多樣性分析，其中，擴增產物長度在75~190 bp 之間，最小重復單元為15，最大重復單元為30（表1）。POLYGENE軟件首先確定最優多體遺傳模型，根據BIC 信息標準，選擇BIC 值最小的為最優遺傳模型，結果顯示，CES（Complete equational segregation，完全等分式分離）為無翼坡壘的最優多體遺傳模型，非自交無負PCR 為最佳參數，后續種群遺傳參數的計算將基于CES 模型進行（表2）。由POLYGENE 估計的等位基因個數在2（Hre9）至7（Hre11）之間，平均3.636 個；有效等位基因的個數在1.428（Hre9）至3.282（Hre11）之間，平均2.380 個。多態信息含量0.289（Hre9）至0.716（Hre11），平均值0.526；Shannon 信息指數0.535（Hre9）至1.589（Hre11），平均值1.035。觀測雜合度最小0.343（Hre9），最大0.698（Hre6、Hre7），平均值0.585。期望雜合度最小0.350（Hre9），最大0.751（Hre11），平均值0.599。GENODIVE 計算的觀測雜合度在0.342（Hre9）至0.697（Hre7）之間，平均值為0.583；期望雜合度在0.303（Hre9）至0.709（Hre11）之間，平均值為0.567。POLYGENE 和GENODIVE 估算的遺傳多樣性很接近，顯示多樣性的估計值是可靠的。11 個位點中有9 個（除Hre2 和Hre11）顯著偏離Hardy-Weinberg 平衡，可能是多體遺傳或近交導致的。通過POLYGENE 和GENODIVE 估算了無翼坡壘3 個齡級的遺傳多樣性，結果顯示，無翼坡壘在不同齡級的有效等位基因個數、多態信息含量、香農指數、觀測雜合度以及期望雜合度上沒有顯著差異，遺傳多樣性水平基本相同（圖1）。

表2 Polygene version 1.2 中4 個多體遺傳模型的BIC 評分

圖 1 基于11 個SSR 標記的無翼坡壘3 個齡級的遺傳多樣性1. Polygene version 1.2 計算結果， 2. GenoDive 3.04 計算結果；I（幼齡），齡級II（中齡），齡級III（成熟齡）。

2.2 無翼坡壘的遺傳結構無翼坡壘遺傳結構的Structure 分析結果（圖2）顯示，delta K 在K =2 時取得最大值，故最優K 值為2，即祖先種群由2 種遺傳組分構成。3 個齡級的遺傳組成沒有明顯分化，均包含2 種組分，除少量個體是2 種組分的混合外，大部分個體只有單一遺傳組分（圖2）。為進一步分析3 個齡級的關系，根據Cavalli -Sforza（1967）的公式計算遺傳距離并構建NJ 樹（圖3）。無翼坡壘3 個齡級的個體聚為兩大支，不

圖 2 STRUCTURE 分析的結果(a) 使用ΔK 方法確定最優K 值。(b) K 取值2 到9 似然值的變化情況。(c) K = 2 時的聚類結果，每個豎條代表1 個個體，顏色的比例對應于分配到2 種遺傳組分的后驗概率。

圖 3 基于Cavalli-Sforza (1967)遺傳距離的個體NJ 樹不同顏色的條形圖對應STRUCTURE 中各遺傳組分的比例，數字為個體編號，Ind01- Ind21 對應齡級I，Ind22-Ind41 對應齡級II，Ind42- Ind59 對應齡級III。

同齡級的個體分散在兩大支中，不同齡級之間未顯示出明顯分化，與Structure 的結果一致。PCoA分析的第1 主坐標（PC1）和第2 主坐標（PC2）分別解釋了29.44%和13.50%的變異，所有個體大致分為2~3 個遺傳組，每個遺傳組中均包含3 個齡級的個體（圖4）。PCoA的結果與Structure 和NJ樹的結果基本一致，進一步說明無翼坡壘齡級間的遺傳差異很小，隨著齡級增加，沒有出現遺傳組成的明顯變化。無翼坡壘低頻等位基因（0～0.100，0.101～0.200）的比例與經歷瓶頸的坡壘種群相似，與未經歷瓶頸的其他龍腦香科種群相比顯著減少[29]（圖5）。這種等位基因頻率分布的變形，低頻等位基因的喪失，是種群經歷瓶頸的1 個特征， 表明無翼坡壘可能最近發生了種群規模的縮減，導致大量低頻等位基因丟失，因此，等位基因頻率分布出現偏移。

圖 4 基于Cavalli-Sforza(1967)弦距離的無翼坡壘主坐標分析(PCoA)

圖 5 無翼坡壘與坡壘[29]SSR 等位基因頻率的直方分布圖

3 討 論

遺傳多樣性對于物種進化和適應有重要影響[44?45]。物種的遺傳多樣性水平越低，適應環境的能力越差，滅絕的風險越大[46]。一般認為，瀕危、特有和狹域分布的植物遺傳多樣性較低[47]。海南島的坡壘屬有坡壘和無翼坡壘2 種，WANG等[29]采集了10 個位于海南熱帶雨林國家公園內不同地點的坡壘種群，利用12 對微衛星標記評估坡壘的遺傳多樣性，結果顯示，坡壘的期望雜合度（He）為0.409，與同屬其他瀕危種如狹葉坡壘（Hopea chinensis）（He=0.473）、H. odorata（He=0.392）[48]的遺傳多樣性水平相當。然而，海南島無翼坡壘的期望雜合度的均值為0.567（GenoDive）或0.600（Polygene），明顯高于同域分布的坡壘（He=0.409）。無翼坡壘微衛星位點的等位基因個數（Na=3.515， Ne=2.397）也比坡壘（Na=2.458， Ne=1.964）多。盡管伐木等干擾導致無翼坡壘數量減小，但因剩余個體較多，有效種群規模仍然較大，與零星分布、個體數量稀少的坡壘相比，無翼坡壘能夠維持相對更豐富的遺傳變異。當然與非瀕危種H. dryobalanoides（He=0.67）[49]相比，無翼坡壘的遺傳多樣性仍是降低的。無翼坡壘與坡壘具有類似的微衛星等位基因頻率分布，低頻等位基因的數量都顯著減少，顯示出清晰的瓶頸信號。綜上所述，無翼坡壘很可能經歷了種群瓶頸，導致低頻等位基因大量丟失，遺傳多樣性降低。

不同齡級的無翼坡壘代表了不同時期的種群。成熟無翼坡壘存活的時間長，代表了較早時期的種群；中齡個體可能是干擾時期或干擾停止后產生的；而幼齡無翼坡壘是經歷干擾后存活個體繁殖的年輕后代。因此推測成熟無翼坡壘的遺傳多樣性比中齡和幼齡的更高。然而3 個齡級的遺傳多樣性沒有明顯差異。這一結果的可能解釋是種群瓶頸持續的時間長，直至保護區建立人為干擾才得以消除，因此，目前處于成熟齡的無翼坡壘，其遺傳多樣性已經遭到破壞，故沒有表現出比中齡與幼齡個體更高水平的遺傳變異。基于主坐標分析和貝葉斯聚類的遺傳結構分析也再次證實不同齡級的無翼坡壘不存在明顯的遺傳分化?？紤]到微衛星提供的進化信息有限，計劃將使用全基因SNP 變異數據進一步研究無翼坡壘瓶頸開始與結束時間，以及瓶頸強度[50]。

無翼坡壘瀕危的主要原因是長期的人為干擾導致種群規?？s小，遺傳變異大量喪失，適應環境變化的能力減弱。另一方面，無翼坡壘果實無翅，傳播距離很短，使得幼苗密度大，競爭激烈，加上冠層遮擋，難以成長為成年個體。要保護無翼坡壘，實現長期存活，首先要恢復其遺傳多樣性，增加種群的進化適應潛力。建議在就地保護的基礎上，進行遠距離個體雜交授粉，提高種苗的遺傳變異。同時進行遷地保護，增加無翼坡壘的生存地點，避免因偶然因素導致原生地種群破壞而引起物種滅絕。