乳腺癌中Ki-67、EGFR及E-cad表達及其對預后的影響研究

程辰 李雪平 徐藝 趙紅艷 趙海濤連云港市中醫(yī)院超聲科，連云港 00；連云港市第一人民醫(yī)院超聲科，連云港000；連云港市第一人民醫(yī)院藥學部，連云港 000；連云港市中醫(yī)院普外科，連云港 00

通信作者：趙紅艷，Email：643627734@qq.com

作為當下全世界女性群體較為常見的惡性腫瘤疾病，乳腺癌在所有的女性惡性腫瘤疾病方面位列首位。雖然該疾病的發(fā)病率常年居高不下，但因相關治療技術趨于完善，病患的5 年生存情況表現(xiàn)較好。相關數(shù)據(jù)表明，歐洲一地2006 至2012 年期間，該病患的5 年生存情況從二十年前的83%，攀升至88%，相對生存率更是從91%增長到了96%。基于醫(yī)學技術的進步，分子生物標志物越來越多［1］，靶向明確的新輔助化療及內分泌治療的廣泛開展，使乳腺癌的生存率及預后有了大幅度改善，也使得該疾病的治療方案趨近于慢性疾病管理［2］。因此，構建起圍繞個體特性以及分子生物標志的預后評價機制顯得尤為必要。除人表皮生長因子受體2（HER-2）、雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR）外，細胞增殖相關抗原（Ki-67）、表皮生長因子受體（EGFR）和上皮鈣黏附蛋白（E-cad）目前已經成為臨床病理學中用以評估腫瘤生長活躍程度的常用指標，并且已經在結直腸癌、宮頸癌、神經內分泌癌及胃腸道間質瘤等腫瘤中得到廣泛應用。關于Ki-67、EGFR、E-cad 在乳腺癌中的表達及其對預后的影響，目前只有少數(shù)研究，并且部分顯示出相互矛盾的結果。

為此，我們進一步探討Ki-67、EGFR、E-cad 的表達水平和該疾病的臨床病理治療、預后等聯(lián)系，探索Ki-67、EGFR、E-cad對于乳腺癌患者生存時間的影響，以期為臨床決策提供依據(jù)。

資料與方法

1、研究對象

本文回顧性研究2015 年5 月至2021 年12 月連云港市第一人民醫(yī)院及連云港市中醫(yī)院經手術切除的乳腺癌標本167 例，隨訪并整理患者病例資料，時間起點為患者的手術日期或臨床活檢病理確診日期，以患者失訪、最后1 次隨訪時間（隨訪截止時間為2022 年4 月）或死亡為節(jié)點，研究終點為死亡。（1）納入標準：①女性；②手術病理或臨床活檢確診為乳腺癌的患者；③給予規(guī)范化治療的乳腺癌患者；④相關病例資料完善。（2）排除標準：①其他組織來源腫瘤；②隨訪信息不完整者；③新輔助化療或內分泌治療不規(guī)范者。

2、研究方法

2.1、資料收集 通過連云港市第一人民醫(yī)院及連云港市中醫(yī)院病案管理系統(tǒng)，按照標準檢索出2015 年1 月至2021 年12 月滿足條件的患者住院基本信息和相關原始資料，梳理研究所需要的病例資料，匯總為表格。

2.2、隨訪 通過電話隨訪以及現(xiàn)場訪談等方式，以手術開始或組織活檢病理確診日期為隨訪起點，隨訪截止日期為2022 年4 月1 日，隨訪過程中因失訪未產生結果事件者定義成截尾。

2.3、評價標準 總生存期（OS）即患者確診日期為起點至患者死亡或研究結束期間的時間。期間由開始時間至腫瘤及其并發(fā)癥導致死亡時間或最后1 次隨訪時間為完全數(shù)據(jù)。由隨訪開始日期至截尾日期為截尾數(shù)據(jù)。

3、病理數(shù)據(jù)

（1）TNM 分期：參照第八版AJCC 公布的乳腺癌分期分期標準［3］，記為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期。（2）病理分子分型：根據(jù)ER、PR及HER2的表達，將乳腺癌分為以下分子分型：Luminal A 乳腺癌、Luminal B 乳腺癌、HER-2 陽性（HR 陽性）乳腺癌、三陰性乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）。（3）ER、PR、HER-2、Ki-67、EGFR、E-cad 的判讀標準。ER、PR 判讀：腫瘤細胞核染色≥1%的任何強度染色判讀為陽性，＜1%腫瘤細胞核染色為陰性。HER-2 判讀：按照陽性細胞表達的數(shù)量分為4級（-、+、++、+++），-、+判定為陰性，++、+++判定為陽性。Ki-67 判讀：Ki-67 陽性定義為細胞核染色為淡黃至棕黃色，隨機選擇10 個400 倍鏡進行計數(shù)，計算Ki-67 陽性細胞數(shù)占總細胞數(shù)的百分比。Ki-67≤14%為低表達，Ki-67＞14%為高表達。EGFR、E-cad 判讀：按照陽性細胞表達的數(shù)量分為4級（-、+、++、+++）。

4、預后評價標準

Neo-Bioscore 評分系統(tǒng)的具體評分如下：ER 陽性、陰性分別對應0、1分；HER-2陽性、陰性分別對應0、1分；組織學分級：1～2級0分，3級1分；新輔助治療前臨床分期：Ⅰ、ⅡA期均為0 分，ⅡB、ⅢA 期均為1 分，ⅢB、ⅢC 期均為2 分；術后病理分期：0期與Ⅰ期均為0分，ⅡA、ⅡB期、ⅢA期及ⅢB期均為1 分，ⅢC 期為2 分。將Neo-Bioscore 評分分為0、1、2、3、4、5、6、7共8個分級。

5、統(tǒng)計學方法

通過Excel軟件對隨訪患者的資料進行整理匯總，建立數(shù)據(jù)庫。運用SPSS 24.0 軟件分析、處理數(shù)據(jù)。計數(shù)資料的組間比較采用卡方檢驗，檢驗水準α=0.05，若P＜0.05則認為數(shù)據(jù)差異有統(tǒng)計學意義；運用Spearman進行關聯(lián)性研究，評價生物學預后因子與臨床病理特征、預后評價體系Neo-bioscore 相關性的研究；對OS、生存分析進行觀察，按照Kaplan-Meier 法進行繪制，得到生存曲線。在此基礎上，采用Cox 回歸模型，排除混雜因素所產生的影響，開展多因素分析。

結 果

1、一般資料

經手術切除的乳腺癌標本167例，患者年齡21～79歲，平均年齡46.4 歲。參照世界衛(wèi)生組織標準病理學，其中有101 例浸潤性導管癌，39 例非特殊浸潤性導管癌，5 例粘液癌、7 例原位癌、37 例導管內癌（單發(fā)或合并浸潤性導管癌）。病理分子分型中，Luminal A 型26 例，Luminal B 型56例，HER-2陽性（HR陽性）57例，三陰型28例。隨訪中有淋巴結轉移72例，術后復發(fā)13例，4例出現(xiàn)了肝、肺、骨轉移等問題；其中，有131 例接收了新輔助化療，31 例接收內分泌治療，5例轉外后續(xù)治療。

2、乳腺癌組織中Ki-67、EGFR、E-cad 的表達與患者臨床病理特征的關系

Ki-67、EGFR、E-cad的表達水平分別與患者的年齡、腫塊的位置、腫瘤長徑、淋巴結是否轉移、TNM分期之間，差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05），但其乳腺癌的病理分子分型與Ki-67、EGFR 表達差異均有統(tǒng)計學意義（χ2=30.463，P＜0.001；χ2=25.652，P＜0.001）。 Ki-67 與EGFR，EGFR 與E-cad 之間的表達水平差異均有統(tǒng)計學意義（χ2=7.167，P=0.007；χ2=18.576，P＜0.001）。

3、Ki-67、EGFR、E-cad 的表達與患者臨床病理特征的相關性研究

Ki-67與腫瘤長徑有一定正相關性（r=0.159，P=0.041），即腫瘤長徑越大，則Ki-67 的表達水平可能越高，但相關系數(shù)r＜0.2，說明關系緊密性一般。乳腺癌的分子分型分別與Ki-67、EGFR、E-cad 的表達水平有顯著相關性（r=0.414，P＜0.001；r=0.379，P＜0.001；r=-0.170，P=0.028），其中乳腺癌的分子分型與Ki-67、EGFR 有緊密的正相關性，與E-cad有緊密的負相關性。EGFR 與Ki-67 的表達水平有緊密的正相關性（r=0.207，P=0.007），與E-cad 的表達水平有顯著的負相關性（r=-0.325，P＜0.001）。

4、乳腺癌組織中Ki-67、EGFR、E-cad 的表達水平與乳腺癌預后評價體系Neo-bioscore相關性的研究

Neo-bioscore 評分體系分值高低與Ki-67 的表達水平有緊密正相關性（r=0.324，P＜0.001）；與EGFR 的表達水平有緊密性一般的正相關（r=0.176，P=0.023）。 而Neo-bioscore 評分體系分值高低與E-cad 的表達水平亦有緊密性一般的負相關（r=-0.162，P=0.037）。見表1。

表1 乳腺癌患者預后評價體系Neo-bioscore評分與Ki-67、EGFR、E-cad表達水平的相關性（例）

5、乳腺癌組織中Ki-67、EGFR、E-cad 的表達與患者生存分析

結合臨床隨訪資料，對167 例患者的臨床病例參數(shù)進行歸納總結（表2），術后常規(guī)定期隨訪，共14～88 個月的隨訪期（隨訪的平均時長40個月，34個月為中位數(shù)）。

表2 167例乳腺癌患者生存曲線單因素分析（Log-rank檢驗）

通過Kaplan-Meier單因素分析顯示：乳腺癌的Ki-67表達水平和Neo-bioscore 評分是影像乳腺癌預后的因素（圖1、圖2）。乳腺癌Ki-67 表達水平不同其預后有明顯差異（χ2=3.950，P=0.047），Neo-bioscore 評 分（χ2=13.372，P=0.004）。本研究中腫瘤位置、淋巴結轉移、TNM 分級及其余生物學免疫因子對乳腺癌生存期的影響差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。

圖1 167例乳腺癌患者Ki-67表達水平與生存時間的相關性分析

圖2 167例乳腺癌患者Neo-bioscore評分與生存時間的相關性分析

進一步采用COX 模型排除混雜因素影響，分析Ki-67 表達水平和Neo-bioscore 評分實際值與生存時間的關系，結果顯示Ki-67 表達水平和Neo-bioscore 評分仍是影響患者生存的獨立危險因素（表3）。

表3 167例乳腺癌患者生存曲線多因素分析（COX回歸）

討 論

1、不同年齡對乳腺癌患者生存期的影響

本研究中，167例乳腺癌患者的平均發(fā)病年齡為46.4歲（年齡21～79 歲）。年輕乳腺癌（≤35 歲）以及老年乳腺癌（≥56 歲）比例分別為18.0%和18.6%，年齡分布特征與國內外相關研究［4］結果比較，年輕乳腺癌較國內外相關研究比例較低，而老年乳腺癌卻得到了相似結果。對發(fā)病者的年齡進行分析，人數(shù)最多的組別（61 例）為46～55 歲這一年齡范圍，占36.53%，從這個數(shù)值來看，表明女性絕經前后為高發(fā)期，應對其予以重視。有研究顯示：年輕與老年的乳腺癌患者預后效果均較差，而年輕女性乳腺癌患者往往有較高的不良預后指標，其中絕大部分選擇保留乳房的手段進行治療，相較于年齡更大的乳腺癌患者而言，存在較高的局部復發(fā)風險［5-7］。但值得一提的是，對Luminal 亞型乳腺癌進行分析，老年患者預后效果較差。本研究中，因樣本量及醫(yī)療服務輻射區(qū)域有限，結果中年齡因素對乳腺癌生存期的影響差異無統(tǒng)計學意義。但在未來的研究中，全面評估年輕女性乳腺癌手術后患者，更好地了解影響年輕婦女乳腺癌發(fā)病率和病死率的種族、民族差異的因素，將有助于改善她們的預后情況。

2、Ki-67的表達與腫瘤長徑關系

20世紀80年代，Gerdes等［8］經過長期研究和不斷摸索，在其發(fā)表的成果中指出，Ki-67 為增殖細胞核抗原，和有絲分裂存在非常緊密的關系。當前，在臨床檢測腫瘤增殖活性的過程中，往往會將Ki-67 視為一種具有較高可靠性的指標。根據(jù)已有的研究結果來看，其和癌癥患者存活率、腫瘤體積等存在一定的關聯(lián)性［9］，正是因為如此，經常用于對癌癥患者的預后、療效進行預測和評估。本文在研究過程中，Ki-67 與腫瘤長徑有一定的正向相關性，但緊密性一般（r=0.159，P=0.041），該結論與部分學者先前的研究結論部分一致［10］。分析其原因，筆者認為：對細胞增殖、分化而言，Ki-67 發(fā)揮了非常重要的作用，因Ki-67 與VEGF 呈正相關性，后者對血管的形成產生了明顯促進作用，使得血管變得更加通透，便于供給營養(yǎng)，故腫塊在其作用下，生長速度增快、體積增大，分化程度較高，同時生長方式較易呈現(xiàn)縱向生長。

3、Ki-67、EGFR與病理分子分型相關性

本研究中，Ki-67 與EGFR 的表達水平與病理分子分型中的Luminal A 型、Luminal B 型、HER-2 陽性（HR 陽性）、三陰型有明顯相關性，其趨勢表現(xiàn)為Ki-67與EGFR 的表達水平越高則三陰型的可能性越大。由于缺乏ER、PR、HER-2 的表達，TNBC 的臨床特征為具有侵襲性生物學表現(xiàn)，靶向治療不具有特異性，對內分泌治療的敏感性也較低。從這個層面上來講，相較于其他乳腺癌亞型而言，預后明顯較差。而Ki-67 在TNBC 中的預后價值尚不清楚，也沒有達成共識。Wu 等［11］經過研究發(fā)現(xiàn)，Ki-67 的高表達是切除后TNBC 較差的預后因素，與低表達率相比，Ki-67 臨界值≥40%與更高的復發(fā)和死亡風險相關，但Ki-67 的最佳臨界值尚不清楚。Keam 等［12］報道，接受高Ki-67 表達新輔助治療的TNBC 患者有早期復發(fā)的模式。相比之下，Ki-67 低表達的亞組沒有任何模式，提示Ki-67 高表達可能導致早期復發(fā)，提示其具有高增殖潛力。這一現(xiàn)象可能部分解釋了為什么高Ki-67 表達仍然是新輔助治療亞組的不良預后因素。

EGFR 屬酪氨酸激酶的ErbB 家族［13］。根據(jù)近期相關研究，在癌癥患者中，經常出現(xiàn)EGFR 酪氨酸激酶結構域突變、基因擴增等變化，使得EGFR 參與了不同類型腫瘤的發(fā)病和進展，而EGFR 的基因改變都與抗EGFR 藥物反應的高概率相關，所以在胰腺癌、肺癌等癌癥中，EGFR 發(fā)生過表達、突變，加快腫瘤進程產生，和耐藥性存在一定的關聯(lián)性［14］。TNBC 的患者中也有較大比例發(fā)生EGFR 過表達現(xiàn)象，因此對TNBC 患者而言，EGFR 抑制劑治療可能為有效的治療方式。在臨床治療中，EGFR單抗、聯(lián)合免疫檢查點、PRMT1 抑制劑等極有可能具有重要的推廣價值［15-16］。因此，EGFR 可用于TNBC 預后評價，并在TNBC 治療過程中，可發(fā)揮分子靶點的作用［17］。

4、Ki-67、EGFR、E-cad 三者關系及與乳腺癌預后評價體系Neo-bioscore的相關性

既往的文獻中對乳腺癌中Ki-67、EGFR、E-cad 三者間關系的研究甚少，據(jù)本文的試驗結果：Ki-67 與EGFR 的表達水平呈正向相關性，而EGFR 與E-cad的表達水平呈負向相關性。筆者分析：Ki-67 作為一種增殖標志物，似乎與癌癥的存活率有關，也有研究認為它是檢測腫瘤增殖活性的最可靠指標［9］；EGFR 對細胞增殖、分化產生影響［18］，其高表達極有可能加快惡性腫瘤的轉移、復發(fā)，不管是總生存期，還是無病生存期，都出現(xiàn)了顯著下降趨勢。E-cad作為鈣黏附蛋白家族中重要成員，是近年來的研究熱點之一。作為腫瘤抑制因子的E-cad 與腫瘤的侵襲和轉移密切相關，研究顯示E-cad 在乳腺癌組織中呈低表達，且與ER 表達水平呈顯著相關。E-cad 蛋白表達減少或缺失是導致惡性腫瘤轉移中的一個重要因素。St?nculescu 等［19］發(fā)現(xiàn)在分化差、進展期的癌癥中E-cad蛋白表達降低，轉移病灶中E-cad蛋白表達均缺失。由此可見，Ki-67 與EGFR 同為影響腫瘤細胞增殖的免疫因子，其間的正相關性可以認為不是偶然；E-cad 蛋白作為抑癌因子與增殖因子EGFR 呈負相關性，也可能存在一定的內在關聯(lián)，但需要更多的樣本量支持和實驗進一步驗證。

Neo-bioscore 評分系統(tǒng)是將新輔助治療前的臨床分期、腫瘤穿刺病理信息（包括ER、PR、HER-2、組織學分級）、術后病理分期綜合進行評分量化，各項評分相加最終得到Neo-Bioscore 得分，它幾乎涵蓋了乳腺癌新輔助治療前、后重要的臨床病理信息［20］。國內外有研究顯示：對早期無病生存期進行預測時，以該得分為考察指標［21］。對復發(fā)風險進行分組時，如果閾值設定為3 分，與無病生存期的相關性更緊密，對年輕的HR陽性乳腺癌患者內分泌治療方案的選擇進行指導。Neo-Bioscore 除了可以改善新輔助化療后乳腺癌患者在臨床和病理分期上的預后分層［22］，并且可能有助于識別可以避免額外輔助化療的非pCR TNBC 患者。本研究中，Neo-bioscore 評分體系分值高低與Ki-67、EGFR 的表達水平有正相關性，而與E-cad 的表達水平有負相關性。筆者認為：該結果從側面證明，Ki-67、EGFR 等表達在評價乳腺癌患者療效、預后分層時具有重要的指導意義。

5、乳腺癌的Ki-67 表達水平、Neo-bioscore 評分與生存時間的相關性

既往的研究中多次驗證：乳腺癌的高增殖狀態(tài)又導致與腫瘤的浸潤生長和轉移有相關性［23］，所以，Ki-67 高表達和乳腺癌患者不良預后存在非常密切的聯(lián)系。焦武等［24］在研究過程中，Neo-bioscore 評分閾值設置為3分，對198例患者進行分組，按照高、低分組開展生存分析，結果差異有統(tǒng)計學意義（χ2=17.353，P＜0.05），這與本研究中Neo-bioscore評分的生存分析結果相似（χ2=13.372，P=0.004）。但這一預后評分體系并未將Ki-67 表達水平納入參考范圍［25］，雖然在預后評估方面有著全面、分層清晰、早期評估效果好等優(yōu)越性，但臨床對Ki-67 的參考應用較多，這也可能會在某種程度上會影響對乳腺癌預后評估的判定，加之評分標準較為復雜，國內外很多專家學者也在不斷改良。故筆者認為，將Ki-67 表達水平與Neo-bioscore 評分結果綜合評估乳腺癌患者的生存預后，可能更會合理地預測乳腺癌患者的生存情況及預后。

6、本研究的創(chuàng)新點及局限性

本研究首次在乳腺癌中綜合研究免疫因子Ki-67、EGFR、E-cad表達水平之間的相互關系，以及與乳腺癌預后的相關性，并首次將其與乳腺癌預后評價體系Neo-bioscore評分進行比較，確定其對部分乳腺癌亞型靶向治療預后評價的價值分析，此方法國內外發(fā)表的文獻中尚未見報道。

本文在研究過程中存在一些缺陷：首先，由于設置了相對嚴格的納入標準，有可能導致選擇存在偏倚現(xiàn)象；與此同時，隨訪的中位時長為3 年，導致整體層面上的病死率、復發(fā)率被低估，應該延長隨訪時間，更好地對治療乳腺癌患者過程中的這些因素價值進行驗證。

從以上分析來看，本文經過研究，發(fā)現(xiàn)Ki-67、EGFR 及E-cad表達對增殖活性分子表達等產生了輔助判斷作用，使得個性化、靶向治療成為可能，與乳腺癌患者的預后有直接或間接相關性，動態(tài)監(jiān)測腫瘤靶向治療效果，從而更好地為臨床服務。