紫甘藍色素提取工藝優化及其酸堿指示劑性質

白曉菲，梁東明，張艷紅，閆心怡，韓金龍，弭永生*

1. 德州學院生命科學學院（德州 253023）；2. 德州市食品藥品檢驗檢測中心（德州 253015）

被廣泛使用的食用色素分為兩大類：人工合成色素和天然色素[1-2]。人工合成色素主要以苯、甲苯和苯胺等化工產品為原料，通過化學合成方法制備，通常色澤艷麗，呈色穩定。然而，伴隨物質水平的提高和科學研究的發展，人工合成色素潛在的毒性、致癌和致畸風險越來越受到人們的關注[3-4]。天然色素主要來源于植物組織，某些動物和微生物也是天然色素的來源[5-7]。相對于人工合成色素，天然色素呈色自然，作為食用色素，其安全性可靠，并且具有一定的營養價值和藥理保健功能[8-9]。近年來，人們對天然色素的需求逐漸增長，天然色素被廣泛應用于醫藥、日化、紡織等行業[10-12]。花色苷是一類重要的天然色素物質，又稱花青素，廣泛存在于被子植物的花、果、葉、莖和根的細胞液中，受環境酸度和溫度等因素的影響，能夠呈現出紅、紫、藍等不同顏色。在生物體系中，花色苷具有吸收紫外光的功能，能夠保護細胞分化等生命過程的正常進行。在生物醫用方面，花色苷能夠預防冠心病和心肌缺損，延緩癌細胞的生長[13-15]，具有抗菌、抗炎和抗衰老等重要生理功能[16-18]。

紫甘藍色素屬于花色苷，是一種重要的水溶性天然色素，具有色調柔和、著色力強、安全性高的特點，對酸堿變化敏感，顏色變化明顯，變色范圍廣[19-21]。另外，紫甘藍色素還具有抑菌消炎、清除氧自由基、提高視覺靈敏度等生理功能[22-23]。紫甘藍作為一種常見蔬菜，屬于十字花科蕓薹屬，其生長周期短、產量高、適應性強、價格低、便于運輸和貯藏，是提取花色苷天然色素的理想原料。國內外有關紫甘藍色素的研究還不夠系統，色素提取方法存在操作方法復雜、大規模生產成本高等問題，對于紫甘藍色素的應用研究也難以實際轉化。以市售新鮮紫甘藍作為原料，設計單因素試驗和正交試驗優化紫甘藍色素的水浴法提取工藝，具有操作簡單易行的優勢，便于實現天然色素的大規模提取，所提取天然色素經AB-8大孔吸附樹脂純化后，研究在不同酸堿性條件下的變色性能，開發在普通實驗室能夠應用的pH試紙，探索其作為酸堿滴定用指示劑的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮紫甘藍（市售，使用前清洗干凈）；無水乙醇、鹽酸、氫氧化鈉（均為國產分析純）。

FA224C分析天平（湖南力辰儀器科技有限公司）；YP-B電子臺秤（上海力辰儀器科技有限公司）；HH-1恒溫水浴鍋（菏澤鑫源實驗儀器設備有限公司）；SHZ-D（III）循環水多用真空泵（上海力辰儀器科技有限公司）；UV-5500紫外-可見分光光度計（上海元析儀器有限公司）；Hei-Vap Value HL G3旋轉蒸發儀（德國Heidolph公司）；TDL-60B離心機（山東愛博科技貿易有限公司）；DHG-9070A電熱鼓風干燥箱（上海一恒科學儀器有限公司）；PHS-3C酸度計（上海儀電科學）；M150B粉碎機（浙江天喜網絡科技有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 紫甘藍預處理

新鮮紫甘藍切碎，在60 ℃電熱鼓風干燥箱中干燥至恒重，轉入粉碎機中粉碎，得紫甘藍粉末，干燥避光條件下保存備用。

1.2.2 紫甘藍色素提取單因素試驗

通過測定紫甘藍色素提取液的吸光度，考察不同條件下的提取效率。紫甘藍色素在525 nm處有明顯的特征吸收峰，其吸收強度隨色素溶液pH變化，不同提取條件下的色素提取液需調整至相同pH后再測定其在525 nm處的吸光度，以免影響測定結果。分別考察提取劑pH、乙醇體積分數、提取時間和提取溫度4個因素對紫甘藍色素提取效率的影響。

1.2.2.1 提取劑pH對紫甘藍色素提取的影響

分別稱取5份0.5 g的紫甘藍粉末放入小燒杯中，編號；以體積分數20%、pH分別為1，2，3，4和5的乙醇溶液作為提取劑，按料液比1∶20 g/mL加入到小燒杯中，在50 ℃下水浴提取1 h；浸提后立即離心，吸取上清液，用pH 2的緩沖溶液將上清液稀釋10倍（取5 mL上清液到50 mL容量瓶中定容）；測定稀釋后的提取液在波長525 nm處的吸光度，選取最佳提取條件的pH。

1.2.2.2 乙醇體積分數對紫甘藍色素提取的影響

分別稱取8份0.5 g的紫甘藍粉末放入小燒杯中，編號；以pH 1、體積分數分別為10%，15%，20%，25%，30%，35%，40%和45%的乙醇溶液作為提取劑，按照料液比1∶20 g/mL加入到小燒杯中，在50 ℃下水浴提取1 h；浸提后立即離心，吸取上清液，用pH 2的緩沖溶液將上清液稀釋10倍（取5 mL上清液到50 mL容量瓶中定容）；測定稀釋后的提取液在波長525 nm處的吸光度，選取最佳提取條件的乙醇體積分數。

1.2.2.3 提取時間對紫甘藍色素提取的影響

分別稱取6份0.5 g的紫甘藍粉末放入小燒杯中，編號；以pH 1、體積分數30%的乙醇溶液作為提取劑，按照料液比1∶20 g/mL加入到小燒杯中，分別在50 ℃下水浴提取不同時間（10，30，60，90，120和180 min）；浸提后立即離心，吸取上清液，用pH 2的緩沖溶液將上清液稀釋10倍（取5 mL上清液到50 mL容量瓶中定容）；測定稀釋后的提取液在波長525 nm處的吸光度，選取最佳提取條件的提取時間。

1.2.2.4 提取溫度對紫甘藍色素提取的影響

分別稱取6份0.5 g的紫甘藍粉末放入小燒杯中，編號；以pH 1、體積分數30%的乙醇溶液作為提取劑，按照料液比1∶20 g/mL加入到燒杯中，分別在不同溫度（25，35，45，55，65和75 ℃）下水浴提取2 h；浸提后立即離心，吸取上清液，用pH 2的緩沖溶液將上清液稀釋10倍（取5 mL上清液到50 mL容量瓶中定容）；測定稀釋后的提取液在波長525 nm處的吸光度，選取最佳提取條件的提取溫度。

1.2.3 正交試驗

在單因素試驗基礎上，設計四因素三水平的正交試驗，以紫甘藍色素的吸光度為指標，對提取劑pH、乙醇體積分數、提取溫度、提取時間4個因素進行優選，各因素水平如表1所示，紫甘藍粉末均為0.5 g，料液比均為1∶20 g/mL。

表1 正交試驗因素水平

1.2.4 紫甘藍色素的酸堿變色性質探究及pH試紙的制備

1.2.4.1 紫甘藍色素在不同pH溶液中的顏色變化

用氫氧化鈉溶液和稀鹽酸溶液分別配制pH 1，3，5，6，7，8，10，12和14的溶液，分別取2 mL不同pH的溶液于試管中，向其中加入等量的紫甘藍色素提取液，搖勻，觀察溶液顏色變化。

1.2.4.2 紫甘藍色素制備pH試紙

將濾紙剪成相等大小的濾紙條，放在濃縮后的紫甘藍色素提取液中，充分浸泡，晾干，至色素在濾紙條上著色顯著，制得紫甘藍pH試紙，在紫甘藍pH試紙上滴加不同pH的溶液，觀察試紙顏色變化。

1.2.5 紫甘藍色素作為指示劑在酸堿滴定中的應用

1.2.5.1 強堿滴定強酸

移取25.00 mL待測鹽酸溶液于錐形瓶中，加入2～3滴濃縮后的紫甘藍色素提取液作為指示劑，搖勻，此時溶液呈紅色，用0.100 mol/L氫氧化鈉溶液進行滴定，記錄終點時消耗0.100 mol/L氫氧化鈉溶液的體積，計算被測鹽酸溶液濃度，使用酚酞作為指示劑進行滴定試驗，將使用2種指示劑的測定結果進行對比。

1.2.5.2 強酸滴定強堿

移取25.00 mL待測氫氧化鈉溶液于錐形瓶中，加入2～3滴濃縮后的紫甘藍色素提取液作為指示劑，搖勻，此時溶液呈黃綠色，用0.100 mol/L鹽酸溶液進行滴定，記錄終點時消耗0.100 mol/L鹽酸溶液的體積，計算被測氫氧化鈉溶液濃度，使用酚酞作為指示劑進行滴定試驗，將使用2種指示劑的測定結果進行對比。

1.3 數據處理

試驗均為3次平行，試驗結果用平均值±標準差表示，使用Excel 2010、Origin 8.0、SPSS 24.0等軟件對試驗數據進行處理和分析。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果與分析

2.1.1 提取劑pH對紫甘藍色素提取的影響

如圖1所示，在其他提取條件固定的情況下，考察提取劑pH對紫甘藍色素提取的影響。提取液pH 1時，提取紫甘藍色素效率最高，pH 2～4時，曲線變化較為平穩，提取效率變化不明顯，pH大于4時，提取效率明顯下降，因此，初步最佳提取條件的pH為1。

圖1 提取劑pH對紫甘藍色素提取的影響

2.1.2 乙醇體積分數對紫甘藍色素提取的影響

如圖2所示，在其他提取條件固定的情況下，考察乙醇體積分數對紫甘藍色素提取的影響。乙醇體積分數10%～30%時，隨著乙醇體積分數增加，提取率逐漸提高，乙醇體積分數30%時，紫甘藍色素提取率最高，乙醇體積分數大于30%時，隨著乙醇體積分數增加，提取率逐漸降低，因此，初步選擇乙醇體積分數30%作為最佳條件，在此條件下，可盡量減少乙醇使用量，降低提取成本，同時保證較高的提取效果。

圖2 乙醇體積分數對紫甘藍色素提取的影響

2.1.3 提取時間對紫甘藍色素提取的影響

如圖3所示，在其他提取條件固定的情況下，考察不同提取時間對紫甘藍色素提取效率的影響。隨著提取時間延長，紫甘藍色素的提取效率逐漸升高，說明延長時間能夠提高溶劑浸提效果，提取時間達到120 min時，提取效率最高，超過120 min后，隨著提取時間延長，提取效率有所降低，可能原因是長時間的熱處理使紫甘藍色素略有分解，因此，初步選擇120 min為最佳提取時間。

圖3 提取時間對紫甘藍色素提取的影響

2.1.4 提取溫度對紫甘藍色素提取的影響

如圖4所示，在其他提取條件固定的情況下，考察不同提取溫度對紫甘藍色素提取效果的影響。提取溫度在25～35 ℃時，紫甘藍色素的提取效率幾乎不變，在提取溫度35～55 ℃時，隨著溫度升高，提取效率逐漸升高，說明提高提取溫度有利于紫甘藍色素的溶出，提取溫度達到55 ℃時，提取效率最高，在提取溫度55～75 ℃范圍時，提取效率略有下降，可能原因是提取溫度過高，導致少量紫甘藍色素降解，同時，溫度過高也不利于降低生產成本，因此，初步選擇55 ℃為最佳提取溫度。

圖4 提取溫度對紫甘藍色素提取的影響

2.2 正交試驗結果與分析

提取工藝優化的正交試驗結果如表2所示。由極差分析結果可以看出，影響紫甘藍色素提取效果的因素主次順序依次為提取劑pH＞提取時間＞乙醇體積分數＞提取溫度，即提取劑pH是最主要的影響因素，提取時間和乙醇體積分數是次要因素，提取溫度的影響最不明顯。根據正交試驗分析得出的最佳組合是A1B2C2D1，即提取劑pH 1、乙醇體積分數30%、提取時間120 min（2 h）、提取溫度45 ℃。

表2 正交試驗設計及結果

2.3 紫甘藍色素變色性質探究試驗結果與分析

2.3.1 紫甘藍色素在不同pH溶液中的顯色情況

如表3和圖5所示，將等量紫甘藍色素加入到不同pH的溶液中時，溶液會呈現不同顏色，不同pH之間顏色區分明顯，基于此，紫甘藍色素可開發作為優良的酸堿指示劑。

表3 紫甘藍色素在不同pH溶液中的顯色情況

圖5 紫甘藍色素在不同pH溶液中顏色變化

2.3.2 紫甘藍色素pH試紙的制備

如圖6所示，通過浸泡法制備紫甘藍色素pH試紙，在試紙上分別滴加pH 1，2，5，7，10，11，12，13和14的水溶液，立即觀察試紙變色情況，在不同pH條件下，試紙顯色變化明顯，與表3結果基本一致，說明所制備的紫甘藍色素pH試紙有實際應用價值。

圖6 紫甘藍色素pH試紙變色結果

2.4 紫甘藍色素作為指示劑在酸堿滴定中的應用效果

2.4.1 強堿滴定強酸

滴定終點判定方法：采用紫甘藍色素作為指示劑時，滴定終點為滴至溶液變藍色且半分鐘內不變色；采用酚酞作為指示劑時，滴定終點為滴至溶液變紅色且半分鐘內不變色。如表4所示，以紫甘藍色素作為指示劑時所測得鹽酸濃度略低于以酚酞作為指示劑時測得的結果，分析原因可能是紫甘藍色素指示劑的滴定終點約pH 7，而酚酞指示劑的滴定終點在pH 8～10，因此，采用紫甘藍色素作為指示劑時消耗的氫氧化鈉溶液體積相對較小，測得鹽酸濃度也相應較小。

表4 氫氧化鈉溶液滴定鹽酸溶液測定結果

2.4.2 強酸滴定強堿

滴定終點判定方法：采用紫甘藍色素作為指示劑時，滴定終點為滴至溶液變藍色且半分鐘內不變色；采用酚酞作為指示劑時，滴定終點為滴至溶液變無色且半分鐘內不變色。如表5所示，以紫甘藍色素作為指示劑時所測得氫氧化鈉濃度略高于以酚酞作為指示劑時測得的結果，分析原因與堿滴定酸時類似，紫甘藍色素作為指示劑時滴定終點約pH 7，而酚酞約pH 8～10。因此，采用紫甘藍作為指示劑時消耗的鹽酸體積相對較大，測得氫氧化鈉濃度也相應較大。

表5 鹽酸溶液滴定氫氧化鈉溶液測定結果

3 結論

以紫甘藍為原料，采用簡便易行的水浴提取法提取紫甘藍色素，在單因素試驗基礎上，進一步通過正交試驗優化天然色素提取工藝，實驗室中最佳提取條件為含30%乙醇溶劑體系、pH 1、溫度45 ℃、時間2 h，提取方法具有生產成本低、操作簡單的特點。對色素進行純化后，進一步研究紫甘藍色素的酸堿變色性質，研究表明紫甘藍色素對酸堿環境敏感，在pH 1～14的寬范圍內具有明顯顏色變化，不同pH下的顯色區分度高，成功制備紫甘藍色素pH試紙用于溶液檢測，并將紫甘藍色素應用于酸堿滴定試驗中，測試結果與傳統酚酞指示劑相當。紫甘藍色素作為一種優良的水溶性天然色素，在食品、保健和醫藥等領域展現潛在應用價值，研究其提取方法和性質具有重要參考價值。